专利名称：一种从龟甲胶中分离功能多肽的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域中的多肽分离技术，尤其涉及一种从龟甲胶中分离功能多肽的方法。
背景技术：
龟甲胶是龟甲经煎煮、浓缩制成的固体胶，它的主要成分是胶原蛋白。龟甲胶是指以龟甲为原料采用热处理、酸/碱处理、酶法降解或结合多种方式降解获得的混合物，其主要成份是龟甲胶中胶原降解后形成的分子量不均一的多肽类物质。龟甲胶具有提高人体免疫力、促进钙的吸收、改善血液微循环以及补充氨基酸营养成份等功能，从龟甲胶中有效识别不同功能的多肽组份是近年来龟甲胶产品开发中的热点。传统的龟甲胶产品开发的重点主要集中于龟甲胶的胶原蛋白制备过程对分子量范围及产品性能的影响，而且其制备方法主要是酸水解法和酶解法。日本Holckaido大学的 Naqai N利用胃蛋白酶在酸性条件下提取龟甲胶中的胶原蛋白，其结构与猪胶原蛋白相似， 且研究发现其胶原蛋白能够促进组织中的基质生长，龟甲胶还可作为新型胶原蛋白来源为生物医药材料和食品保健品运用(J Biomater Sci Polym Ed. 2009，20 (5-6) :567-576)； 美国Gerald Soslau等人研究了胶原蛋白不会引起人类血小板的聚集(Biochemistry and Molecular Biology，2005，142，3 :353-360) ；Liu C C 等人从龟甲胶中提取出胶原蛋白，并利用自由基清除活性和还原力方法分析胶原蛋白的抗氧化活性，当胶原蛋白含量在 IC50,1.95mg/ml时，自由基清除活性和还原力都与胶原蛋白的含量呈正相关(Advanced Materials Research，2010，152-153 1788-1792) ；Godley B J等人利用同位素标记法研究了各种龟甲中胶原蛋白的含量，其中鼋和绿海龟中的胶原蛋白含量较高(Marine Ecology Progress Series Mar Ecol Prog Ser, 1998,166 :277-284)；邓燕等人采用胃蛋白酶酶解法从龟甲中提取胶原蛋白，发现龟皮胶原的酶解速率比猪皮的快，其氨基酸组成中的羟脯氨酸含量高于猪皮胶原，而且龟皮胶原更易降解为小分子肽，易于被人体吸收利用(食品研究与开发，2006,27(6) :62-64)；骆达等人利用酸水解法降解龟甲胶，采用异硫氰酸苯酯衍生化-HPLC法测定其龟甲中胶原蛋白(中草药，2008，39，6 :851-852)；韩国Hee-Guk Byun利用离子交换色谱和凝胶过滤色谱的方法从胶原蛋白中分离出具有抑制血管紧张素转化酶活性的多肽(Process Biochemistry, 2001, 36 :1155-1162)；日本 Maruyama S 从胶原蛋白中分离出可抑制血小板活性的多肽(Biochim. Biophy. Acta ；1993，1164，215-223)； 传统的龟甲胶中不同多肽的分离方法主要基于分子量范围、带电荷状态等性质进行分离， 存在分辨率低和特征性不强等缺点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于亲和层析的龟甲胶中功能多肽的分离方法。纤维连接蛋白等血浆中的蛋白质可与胶原蛋白降解物中部分多肽进行特异性结合，利用纤维连接蛋白或凝血因子等血浆中的蛋白质作为配基采用亲和层析的方法可从龟甲胶中分离出
3特征性的多肽，本发明涉及的胶原蛋白中功能多肽分离方法具有分辨率高和特征性强等优
点ο本发明的详细内容(1)将龟甲胶溶于水制成胶原蛋白溶液，并将该溶液的pH值调至6. 0-9. 0 ；(2)将胶原蛋白溶液上亲和层析柱，循环上样至亲和层析柱吸附样品达到饱和。(3)使用淋洗剂将未与层析介质配基结合的多肽淋洗出。(4)使用洗脱剂将与亲和层析介质配基结合的多肽洗脱出，洗脱过程的温度控制在 15-37 "C。(5)利用凝胶过滤层析法或膜超滤的方法将得到的洗脱液浓缩，得到浓缩液；
(6)将浓缩液冷冻干燥，所得白色粉末即龟甲胶胶原蛋白中的功能多肽。本发明所述的基于亲和层析的龟甲胶中功能多肽的分离方法中，如果待分离的胶原蛋白原料是水溶液，则省去(1)所述的胶原蛋白溶解过程，直接将胶原蛋白溶液的PH值调制 6. 0-9. 0。所述的龟甲胶可以是龟甲胶原蛋白或其胶原蛋白降解物。所述亲和层析介质的基质是直径为40120微米琼脂糖微球。所述的亲和层析柱中层析介质的配基可以是纤维连接蛋白或凝血因子等血浆中的蛋白质。所述的洗脱剂是含2-8mol/L脲、pH值为3. 0-8. 0的缓冲液或含5_50%乙醇的水溶液或5-50%乙腈的水溶液。如果采用5-50%乙醇的水溶液或5-50%乙腈的水溶液作为洗脱剂，则省去(5)所述的利用凝胶过滤层析法或膜超滤的方法将得到的洗脱液浓缩，得到浓缩液的过程，洗脱液直接进行冷冻或喷雾干燥。
具体实施例方式实施例1原料2mg/ml龟甲胶胶原蛋白水溶液(1)将原料龟甲胶水溶液的pH调至7. 0。(2)将龟甲胶水溶液上样至亲和层析柱至透过液中检测出胶原蛋白，亲和层析柱基质交联琼脂糖微球。亲和层析柱配基人血浆纤维连接蛋白，柱填料体积40ml，填料粒径=60-120微米。(3)使用20ml 0. 2mol/L碳酸氢铵作为淋洗剂淋洗层析柱，流速lml/min。(4)使用20%乙醇溶液在30°C下洗涤层析柱，流速lml/min，收集前30min组份，(5)将收集到的组份直接冷冻干燥，获得的白色粉末即为龟甲胶中的功能多肽。实施例2原料龟甲胶水溶液(1)将原料龟甲胶水溶液的pH调制7. 0，浓度控制在3-10mg/mL。(2)将龟甲胶水溶液上样至亲和层析柱至透过液中检测出胶原蛋白，亲和层析柱配基人血浆纤维连接蛋白，柱填料体积40ml，填料粒径60-120微米。(3)使用20ml 0. 2mol/L碳酸氢铵作为淋洗剂淋洗层析柱，流速lml/min。(4)使用8M脲溶液(含0. ImoVLNH4HCO3)在20°C下洗涤层析柱，流速lml/min，
4收集前35min组份，(5)将收集到的洗脱液使用凝胶过滤层析柱(S^hadexGlO)除去溶液中的脲。(6)脱盐后的多肽直接冷冻干燥，获得的白色粉末即为龟甲胶中的功能多肽。
权利要求
1.一种从龟甲胶中分离功能多肽的方法，其特征在于将从龟甲胶溶液上样至亲和层析柱，淋洗去除未被亲和吸附的多肽，使用洗脱剂将龟甲胶中与层析介质亲和的功能多肽洗脱出，使用干燥方法获得功能多肽粉末。
2.按照权利要求1所述的方法，龟甲胶中的功能多肽分离是基于亲和层析的分离技术。
3.按照权利要求1所述的方法，亲和层析介质的配基是纤维连接蛋白或凝血因子等人血浆中的蛋白质。
4.按照权利要求1所述的方法，亲和层析介质的基质是直径为40-120微米琼脂糖微球。
5.按照权利要求1所述的方法，从龟甲胶中分离出的功能多肽是指龟甲胶中可以与纤维连接蛋白或凝血因子等人血浆中的蛋白质相结合的多肽。
6.按照权利要求1所述的方法，原料是龟甲胶溶解后溶液或从龟甲胶中分离出的胶原蛋白降解物。
7.根据权利要求1所述的方法，干燥方法是冷冻干燥或喷雾干燥法。
全文摘要
一种从龟甲胶中分离功能多肽的方法，其工艺过程为将龟甲胶水溶液上样至以血浆蛋白为配基的亲和层析柱，循环上样至亲和层析柱吸附样品达到饱和，使用淋洗剂将未吸附的多肽淋洗出，使用洗脱剂将与亲和层析介质配基结合的多肽洗脱出，将洗脱液浓缩，冷冻干燥后所得白色粉末即龟甲胶中的功能多肽。该方法具有分离过程简单和特异性强等优点。
文档编号C07K1/22GK102199192SQ20111007589
公开日2011年9月28日 申请日期2011年3月29日 优先权日2011年3月29日
发明者孔英俊, 张宏, 张贵锋, 查圣华, 苏志国, 马光辉, 高建萍 申请人:中国科学院过程工程研究所, 北京同仁堂健康药业股份有限公司