专利名称：分离纯化苏云金芽孢杆菌中的水溶性抗生素-Zwittermicin A的方法
技术领域：
本发明属植物化学、农业化学、生物医药学、植物保护、食品化学、分析化学、 有机化学、生物化学领域，特别涉及一种分离纯化苏云金芽孢杆菌中的水溶性抗生素-Zwittermicin A 的方法。
背景技术：
目前，在全球范围内广泛使用的化学杀虫剂，在杀伤害虫的同时，也大量杀伤了害虫天敌，造成了生态平衡的破坏和环境的严重污染，给人类的生命安全带来了巨大威胁。此外，害虫已逐步对长期使用的化学杀虫剂产生抗药性，形成化学杀虫剂施用的恶性循环。而生物杀虫剂可以部分克服以上缺点。因此积极开发和应用生物农药取代化学农药防治果品及蔬菜等作物上的害虫已成为人类的共识。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis subsp.简称Bt)产生的毒蛋白是天然的杀虫剂，它是目前国内外公认的最有利用前景的一种无公害生物农药。Bt杀虫毒蛋白至今尚未在无公害蔬菜等绿色食品生产上发挥出应有的作用，在应用上长期推而不广，其原因之一主要是以毒蛋白的含量计算产量，国内外Bt液体发酵产品生产成本较高，适用范围小；其二是毒蛋白受到紫外线照射是发生降解，另外雨淋及喷施是易溶于水造成流失，应用时间敏感，仅适于对敏感害虫的灭杀，对甜菜夜蛾、钻蛀性主要害虫的杀虫效果和成本竞争不过化学农药。Zwittermicin A是苏云金芽孢杆菌在发酵过程中产生的水溶性抗生素，杀虫活性极低，但对苏云金芽胞杆菌的杀虫活性物质毒蛋白的杀虫毒力有增效作用，它不但使与杀虫有关的杀虫晶体蛋白(如Cry 1A、CrylB, CrylC和CryZ至Cry6类)活性增加几倍、 甚至上千倍，而且也可以降低害虫的抗药性。因此该抗生素的存在能够有效地降低Bt 的发酵成本，为Bt工程菌的应用奠定了基础。随着人们对生物杀虫剂的需要，分离纯化 Zwittermicin A方法的研究成为热点。1994年，Mabb提供了两种检测苏云金芽孢杆菌所产生的Zwittermicin A的方法对噬菌体敏感和对草生欧文氏杆菌的生长抑菌效果。1996年，Sandra等提供了另外三种脂肪酸甲酯的簇分析，10个碱基的RAPD及针对zmaR(Zwittermicin A的抗性基因)的特异性引物PCR反应。而以上五种方法中，抑菌圈的试验是相对准确且简单的。2005年邵铁梅等对Bt菌株的抑菌圈测定方法进行了完善。目前仅有的分离纯化方法有(1)离子交换-高压纸相电泳法(Silo-Souh等 1994) (2)离子交换-高效液相色谱法(Manker等1994 ；Silo-Souh等1998 ；沈锡辉，王开梅 2004 ；陈守文，何进2007)等方法。上述纯化方法步骤较多，试验复杂，并且高效液相色谱仪器比较昂贵，同时需要专业技术人员，并且至今还没有Zwittermicin A的标准品。而等电聚焦电泳法分离纯化苏云金芽孢杆菌中的水溶性抗生素-Zwittermicin A的方法试验操作相对简单，并且测出了 Zwittermicin A的等电点，为Zwittermicin A的工业化奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种分离纯化苏云金芽孢杆菌中的水溶性抗生素-ZwittermicinA 的方法。具体步骤为将苏云金芽孢杆菌即Bacillus thuringiensis subsp的发酵液经10000r/min离心lOmin，得发酵液上清液，在50°C将上清液水相真空浓缩至50倍；根据体积比，在浓缩液中加入1/2体积的无水乙醇，然后经lOOOOr/min离心lOmin，丢弃沉淀相，保留水相；水相中加入等体积的石油醚，摇勻，静置，分离水相和石油醚相，丢弃石油醚相，保留水相；既得经无水乙醇和石油醚初步纯化的上清液样品，收集备用；将pH为3. 5 9. 5的载体电解质液体1. 5-2. 5mL、上清液样品0. 5-1. 5mL、溴酚蓝一滴、蒸馏水6_8mL、琼脂糖0. 05-1. 5g混合，将混合胶液升温至75 85°C溶解充分，保温将胶液灌到粗细均勻，直径约为0. 3cm的医用胶管中，冷却两小时后接入电泳池，阳极加入60 80mL0. 5mol/L醋酸溶液，阴极加入 60 80mL0. 5mol/L氢氧化钠溶液，胶管的两端均需浸入电极液中，使用JY5000电泳仪，调整电流，使功率输出保持在1 2W，当管中的溴酚蓝颜色集中成一点时，停止电泳，将胶管以溴酚蓝点为中心，分别切为Icm的小段，然后经抑菌试验分析可知，靠近溴酚蓝的那段管中就是用电泳法分离纯化出的水溶性抗生素-Zwittermicin A。在优化的条件下等电聚焦电泳是利用两性电解质在凝胶内制造一个很好的PH梯度，电泳时两性分子将迁移到不带正电或负电的等电点(pi)，而抗生素-Zwittermicin A 也被聚集到一个狭窄区域，从而得到分离纯化。结合抑菌测定结果，计算出抗生素的等电点为 3. 59 3. 81。本发明所述的等电聚焦电泳法，是实验试剂及样品与空气隔绝，避免氧化，使其结果更为精准，并且此方法操作简单，能够将抗生素-Zwittermicin A分离出，并测出它的等电点，为以后抗生素-Zwittermicin A的大量分离纯化制备奠定了基础。并且此方法还可运用到其他两性电解质的分离测定中。
附图为本发明所述抗生素-Zwittermicin A分子结构图。Zwittermicin A分子结构可以看出，具有2个亚氨基、3个酮基、4个氨基和5个羟基，羟基交错排列在碳主链两侧，分子量为396Da的线性氨基多元醇。由于富含氨基和羟基，有正负电解离，由此推断可通过等电聚焦电泳试验分离此抗生素并测定它的等电点pi。
具体实施例方式实施例将苏云金芽孢杆菌即Bacillus thuringiensis subsp的发酵液经10000r/min 离心lOmin，得发酵液上清液，在50°C将上清液水相真空浓缩至50倍；根据体积比，在浓缩液中加入1/2体积的无水乙醇，然后经lOOOOr/min离心lOmin，丢弃沉淀相，保留水相；水相中加入等体积的石油醚，摇勻，静置，分离水相和石油醚相，丢弃石油醚相，保留水相；既得经无水乙醇和石油醚初步纯化的上清液样品，收集备用；将pH为6. 5的载体电解质液体 2mL、上清液样品lmL、溴酚蓝一滴、蒸馏水7mL、琼脂糖0. Ig混合，将混合胶液升温至80°C溶解充分，保温将胶液灌到粗细均勻，直径约为0. 3cm的医用胶管中，冷却两小时后接入电泳池，阳极加入70mL0. 5mol/L醋酸溶液，阴极加入70mL0. 5mol/L氢氧化钠溶液，胶管的两端均需浸入电极液中，使用JY5000电泳仪，调整电流，使功率输出保持在1.5W，当管中的溴酚蓝颜色集中成一点时，停止电泳，将胶管以溴酚蓝点为中心，分别切为Icm的小段，然后经抑菌试验分析可知，靠近溴酚蓝的那段管中就是用电泳法分离纯化出的水溶性抗生素-Zwittermicin A，所述试剂均为分析纯。
权利要求
1. 一种分离纯化苏云金芽孢杆菌中的水溶性抗生素-Zwittermicin A的方法，其特征在于具体步骤为将苏云金芽孢杆菌即Bacillus thuringiensis subsp的发酵液经 10000r/min离心lOmin，得发酵液上清液，在50°C将上清液水相真空浓缩至50倍；根据体积比，在浓缩液中加入1/2体积的无水乙醇，然后经lOOOOr/min离心lOmin，丢弃沉淀相， 保留水相；水相中加入等体积的石油醚，摇勻，静置，分离水相和石油醚相，丢弃石油醚相， 保留水相；既得经无水乙醇和石油醚初步纯化的上清液样品，收集备用；将pH为3. 5 9. 5 的载体电解质液体1. 5-2. 5mL、上清液样品0. 5-1. 5mL、溴酚蓝一滴、蒸馏水6_8mL、琼脂糖 0. 05-1. 5g混合，将混合胶液升温至75 85°C溶解充分，保温将胶液灌到粗细均勻，直径约为0. 3cm的医用胶管中，冷却两小时后接入电泳池，阳极加入60 80mL0. 5mol/L醋酸溶液，阴极加入60 80mL0. 5mol/L氢氧化钠溶液，胶管的两端均需浸入电极液中，使用 JY5000电泳仪，调整电流，使功率输出保持在1 2W，当管中的溴酚蓝颜色集中成一点时， 停止电泳，将胶管以溴酚蓝点为中心，分别切为Icm的小段，然后经抑菌试验分析可知，靠近溴酚蓝的那段管中就是用电泳法分离纯化出的水溶性抗生素-Zwittermicin A ；所述试剂均为分析纯。
全文摘要
本发明公开了一种等电聚焦电泳法分离纯化苏云金芽孢杆菌中的水溶性抗生素-Zwittermicin A的方法。用无水乙醇和石油醚初步纯化苏云金芽孢杆菌发酵液的上清液，制样，将上清液样品、两性电解质液体、溴酚蓝、蒸馏水及琼脂糖配成胶液，将其升温至75～85℃溶解充分，保温将其灌到直径约为0.3cm的医用胶管中，冷却两小时后接入电泳池，阴阳两极分别按要求加入电解液，胶管的两端均需浸入电极液中，进行等电聚集电泳，既可分离纯化出的水溶性抗生素-ZwittermicinA。本发明实验试剂及样品与空气隔绝，避免氧化，结果更为精准，并且操作简单，能够将抗生素-Zwittermicin A有效分离出。
文档编号C07C273/18GK102249952SQ20111011764
公开日2011年11月23日 申请日期2011年5月6日 优先权日2011年5月6日
发明者严丽, 刘红艳, 宋福平, 张 杰, 李洋, 郝再彬 申请人:桂林理工大学