专利名称：一种分离牛初乳中IgG的方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质分离技术领域，具体涉及一种分离牛初乳中IgG的方法。
背景技术：
牛初乳中含有血清白蛋白、α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白和一些目示胨蛋白，蛋白成分非常复杂。新鲜的牛初乳化学组成受多种因素的影响，包括牛的品种、个体差异及产犊后采样时间等等，而且每种蛋白受上述因素的影响情况不同。免疫球蛋白(Ig)是动物体内重要的免疫活性物质，在动物幼体的营养代谢和生理调节方面具有重要的作用。Ig —般分为IgG、IgA、IgD、IgE、IgM五大类，血清中IgG含量占Ig总量的80% 以上。IgG是人体抵抗疾病的重要物质，是血清中免疫球蛋白的一种，是机体受抗原(如病原体)刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类具有抗体活性的球蛋白。其主要作用是与抗原起免疫反应，生成抗原-抗体复合物，从而阻断病原体对机体的危害，使病原体失去致病作用。IgG具有多种生物活性功能，可抵抗入侵的细菌、病毒等致病原并刺激特殊的反应以帮助机体抵抗疾病，同时还具有活化补体、溶解细菌、中和毒素等功能。目前IgG作为一种新型的、具有活性的强化剂，正逐步被广泛用于婴儿食品、代乳食品、保健食品等中。因此，开发合适的分离纯化工艺，实现组分和含量各异的牛初乳中IgG的高效经济分离，将富余的牛初乳变废为宝具有重大意义和市场潜力。对于IgG分离纯化的研究，国外所用方法包括了近年来广泛用于生化分离的超滤、层析、高效液相色谱等技术，主要有分级超滤法、阴阳离子交换串联吸附及洗脱法。疏水性电荷诱导层析(HCIC)是由Burton和Harding在20世纪90年代统一提出的一种新型的吸附分离技术，该技术是一种双模式的配基，可以与目标蛋白产生静电和疏水性相互作用。
发明内容
本发明提供了一种分离牛初乳中IgG的方法，该方法简单，分离效率高。一种分离牛初乳中IgG的方法，包括对牛初乳进行预处理，分离得到乳清，调节乳清pH，上样于填充MEPHypercel树脂的层析柱，洗脱得到IgG。MEP Hypercel树脂是I^all Biosepra公司生产的一种双功能树脂，目前该介质已经商品化而且被许多实验室用于抗体的分离纯化研究。优选的，所述预处理为取牛初乳，脱脂后调节pH为4. 6，静置30min，4500r/min 离心20min，取上清，用八层纱布过滤，滤液即为乳清。优选的，所述乳清PH调节为6. 0 9. 0，最优选调节为7. 0。优选的，所述乳清上样后停留时间为5 20min，最优选为15min。优选的，所述洗脱为(1)用pH与乳清相同的PB缓冲溶液冲洗；
(2)用含0. 5M NaCl的pH 5. 5醋酸钠缓冲溶液洗脱；(3)用pH 4. 5醋酸钠缓冲溶液洗脱。本发明层析柱填充MEP Hypercel树脂，利用疏水性电荷诱导层析(HCIC)分离牛初乳中的IgG，HCIC高效捕获目标蛋白的能力能减少了对料液的稀释和酸碱盐等预处理， 工艺简单，分离效率高，生产成本低。
图1为上样液II层析图谱；图2为IgG浓度对MEP Hypercel树脂动态吸附容量的影响图；图3为不同离子强度6. 5mg/mL IgG上样液I通过MEP Hypercel层析柱时穿透曲线.
一入 ，图4为不同离子强度下MEP Hypercel树脂对IgG的动态吸附容量图；图5为不同pH、6. 5mg/mL IgG上样液I通过MEP Hypercel层析柱时穿透曲线图；图6为不同吸附pH下MEP Hypercel树脂动态吸附容量图；图7为MEP Hypercel层析吸附时间对动态结合容量和回收率的影响图；图8为MEP Hypercel层析柱pH梯度洗脱图；图9是牛初乳乳清MEP Hypercel吸附层析图；图10是牛初乳乳清MEP Hypercel吸附层析洗脱液SDS-PAGE图；其中，1 :Marker，2 :IgG标准品，3 :IgA标准品，4 牛初乳乳清，5 牛初乳粉上样液，6:水洗脱液(图9中区域2洗脱液)，7:pH 4.5 50mM醋酸钠缓冲溶液洗脱液(图9中区域3洗脱液)，8:pH 3.0 200mM醋酸钠缓冲溶液洗脱液(图9中区域4洗脱液)；图11是牛乳清IgG在MEP Hypercel层析中不同pH和离子强度洗脱图；图12是牛乳清在MEP Hypercel层析中不同离子强度和pH缓冲液洗脱液 SDS-PAGE 图；其中，1=Marker, 2 IgG 标准品，3 牛乳清，4，0. 5M NaCl+pH 5. 550mM 醋酸钠缓冲溶液洗脱(图11中区域B洗脱液)，5:pH 4.5，50mM醋酸钠缓冲溶液洗脱(图11中区域C 洗脱液)，6:pH 4.0，50mM醋酸钠缓冲溶液洗脱(图11中区域D洗脱液)，7 :pH 3.0,200mM 醋酸钠缓冲溶液洗脱液(图11中区域E洗脱液)；图13(A)是牛乳清亲和色谱图；图13 (B)MEP Hypercel层析pH 4. 5醋酸钠缓冲溶液洗脱组分亲和色谱图。
具体实施例方式实施例1牛初乳粉20g溶于300mL水中，2M HCl调pH为4. 6，静置20min，4500rpm离心 20min取上清液，上清液经40% (NH4)2SO4沉淀后4°C 4500rpm离心20min，弃掉上清液，沉淀用50mM的磷酸缓冲液重新溶解，以该溶液作为上样液I。新鲜牛初乳(浙江萧山五星牛奶厂)4500r/min离心20min制得脱脂乳，2M HCl调 pH 4. 6，静置 30min,4°C 4500r/min 离心 20min, 8 层纱布过滤，滤液用 IM NaOHi周 pH 至 7. 0， 作为上样液II。
亲和色谱结合Bradford法分析上样液I中IgG纯度约为80%，纯度相对较高，实施例2 5以上样液I代替上样液II，测试IgG含量、离子强度、吸附pH和吸附时间对MEP Hypercel层析动态吸附容量的影响，对层析吸附条件进行优化。实施例2 IgG含量对MEP Hypercel层析动态吸附容量的影响取IOg MEP Hypercel 树脂装柱(Φ 1. 6 X 6cm)，在AKTA purifier 层析仪上，以 1. 5mL/min流速通入50mM PB缓冲溶液平衡至基线稳定；配置pH 6.0、186含量分别为0.5、1、2、4、611^/1^的上样液1，以相同流速上样，在层析柱中的停留时间为8min，每隔1分钟收集流出液，亲和色谱检测流出液中IgG的浓度， 直至流出液在紫外^Onm下的吸收值变化缓慢或不再发生变化，然后使用200mM pH 3. 0的醋酸钠缓冲溶液将吸附的蛋白洗脱下来，至紫外吸收值冲洗平稳，图1为上样液II层析图谱。采用公式(1)计算10%穿透时，MEP Hypercel树脂动态吸附容量，具体结果如图3所
权利要求
1.一种分离牛初乳中IgG的方法，包括对牛初乳进行预处理，分离得到乳清，调节乳清PH，上样于填充MEPHypercel树脂的层析柱，洗脱得到IgG。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预处理为取牛初乳，脱脂后调节PH 为4. 6，静置30min，4500r/min离心20min，取上清，用八层纱布过滤，滤液即为乳清。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳清PH调节为6.0 9. 0。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述乳清pH调节为7.0。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳清上样后停留时间为5 20min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳清上样后停留时间为15min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗脱为(1)用PH与乳清相同的PB缓冲溶液冲洗；(2)用含0.5M NaCl的pH 5. 5醋酸钠缓冲溶液洗脱；(3)用pH4. 5醋酸钠缓冲溶液洗脱。
全文摘要
本发明公开了一种分离牛初乳中IgG的方法，包括对牛初乳进行预处理，分离得到乳清，调节乳清pH，上样于填充MEP Hypercel树脂的层析柱，洗脱得到IgG。本发明层析柱填充MEP Hypercel树脂，利用疏水性电荷诱导层析(HCIC)分离牛初乳中的IgG，HCIC高效捕获目标蛋白的能力能减少了对料液的稀释和酸碱盐等预处理，工艺简单，分离效率高，生产成本低。
文档编号C07K16/04GK102250241SQ20111018476
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月1日 优先权日2011年7月1日
发明者吴绵斌, 张书衍, 王如涛 申请人:浙江大学