专利名称：聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的纯化方法
技术领域：
本发明涉及利用重组DNA技术生产基因工程药物的方法，具体涉及聚こニ醇化重组人粒细胞集落刺激因子(PEG-rhG-CSF或PEG-G-CSF)的纯化方法，属于医药技术领域。
背景技术：
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是造血因子之一，由175个氨基酸组成，是ー种水溶性的蛋白，具有疏水性。它的主要作用是刺激中性粒细胞系造血细胞的増殖、分化，増加外周血中性粒细胞数量，活化中性粒细胞功能，在预防和治疗多因素引起的中性粒细胞減少症及其并发症(如发热、感染等)方面疗效显著。1991年，Amgen(安姆根)公司的重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)被FDA批准上市用于化疗引起的中性粒细胞减少症的治疗。但作为ー种生物大分子药物，rhG-CSF像大多数生物制品一祥，在临床应用中存在体内半衰期短，易被酶水解和肾脏清除等问题。在化疗过程中，需要长达两周的持续每日静脉或 皮下注射，造成病人依从性较差。聚こニ醇(PEG)修饰是实现蛋白质药物长效的ー种应用较为广泛的方法，PEG修饰的蛋白质和多肽类药物半衰期明显延长，溶解度和稳定性得到改善，免疫原性降低，生物利用度增强，毒副作用減少。PEG修饰的rhG-CSF实现了长效增加外周血中性粒细胞数的目的，2002年，FDA又批准了 Amgen公司的聚こニ醇化粒细胞集落刺激因子(PEG-G-CSF)上市，商品名Neulasta。PEG-G-CSF是由单甲氧基聚こニ醇丁醛与大肠杆菌表达纯化的蛋氨酰化的粒细胞集落刺激因子N-末端赖氨酸氨基共价连接而成，与G-CSF相比其在体内的半衰期明显延长，因而可以減少治疗时的注射次数，減少病人的痛苦。在PEG-G-CSF的纯化过程中，需要去除PEG与G-CSF交联反应液中的交联剂、ニ交联的G-CSF及未交联的G-CSF等。由于交联产生的多种不同交联蛋白异构体，除了分子量有所区别外，其他性质如表面电荷、疏水性等差别较小，因此，分离纯化交联蛋白产物，成为聚こニ醇化技术的难点之一。安姆根公司在专利CN1071760C中公开了 N-末端PEG化rh-G-CSF的纯化方法,将交联反应混合物上样于阳离子交换层析柱Sepharose FF柱，以醋酸钠缓冲液平衡后进行线性洗脱，收集洗脱液；将洗脱液再进行分子筛层析的方法来纯化。虽然，分子筛层析能够去除分离各种交联异构体，但是由于分子筛很难在エ业中实现放大，因此国内大多数的纯化方法是根据表面电荷的差异，采用离子交換层析进行分离纯化，例如CN1663962A公开了 PEG-G-CSF的一步纯化方法，采用阳离子交换层析柱SP SepharoseF.F.装柱后用こ酸-こ酸钠缓冲液平衡，再用不同pH值的こ酸-こ酸钠缓冲液洗脱。此纯化工艺虽然可以实现エ业上的放大，但由于采用的是作用比较单ー的阳离子交換介质进行吸附-解析来进行分离，其内毒素很难控制，导致终产品中内毒素含量不容易控制，影响了产品的质量。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种聚こニ醇化重组人粒细胞集落刺激因子的纯化方法，本发明的发明人对各种层析方法进行了大量的研究，发现利用脱盐层析、离子交换串联层析和脱盐层析顺序组合纯化，能够获得高纯度的聚こニ醇化重组人粒细胞集落刺激因子。本发明纯化工艺充分利用了目的蛋白在表面电荷和疏水性上的特点，先通过ー个阴离子交换层析柱，有效的去除了内毒素，増加了エ艺的可控性；第二步层析充分利用目的蛋白的强疏水性，实现了串联层析，将内毒素的去除和蛋白的纯化两个步骤合并为ー个步骤。本エ艺不仅可以有效去除内毒素，并且简化了操作步骤，节省了生产时间，提高了生产效率，十分适合大規模エ业化放大生产。实施本发明的前期步骤为现有技术可以采用CN1071760C中公开的方法来获得聚こニ醇化重组人粒细胞集落刺激因子交联液，将该交联液作为后续处理的对象。该方法主要步骤在于将经过脱盐后的聚こニ醇化重组人粒细胞集落刺激因子交联液顺次通过阴离子交换层析柱与多结合型离子交换层析柱串联层析系统，利用内毒素与阴离子交换层析柱的高度吸附作用达到去除内毒素的目的；之后采用添加了氯化钠的缓冲液単独对多结合型离子交换层析柱进行洗脱，收集洗脱后的目的蛋白液；更进一歩的，本发明的具体处理步骤如下(I)聚こニ醇化重组人粒细胞集落刺激因子交联液经过葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex G-25)脱盐，得脱盐液；(2)脱盐液顺次通过阴离子交换层析柱与多结合型离子交换层析柱串联层析系统，使内毒素结合到阴离子交换层析柱上，至上样完毕；(3)采用添加了氯化钠的缓冲液単独对多结合型离子交换层析柱进行洗脱，收集洗脱后的目的蛋白液；(4)洗脱后的目的蛋白液经过葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex G-25)脱盐柱脱盐去除Na+、Cl-,得到高纯度的蛋白样品。上述过程中，步骤(I)和(2)中的葡聚糖凝胶G-25脱盐层析柱和阴离子交换层析柱与多结合型离子交换层析柱串联层析洗脱在上样前均采用PH6. 0-8. 5，浓度为IOmmol/L lOOmmol/L的磷酸盐缓冲液进行平衡；其中优选采用pH7. 0-8. O、浓度为20mmol/L 50mmol/L的磷酸盐缓冲液进行平衡；步骤(2)中采用的阴离子交换层析柱的层析介质包括琼脂糖凝胶(S印harose)类、聚苯こ烯(SOURCE)类，配基为季氨基Q或ニこ基氨こ基DEAE ;优选层析介质为琼脂糖凝胶类，配基为季氨基Q或ニこ基氨こ基DEAE ;最优选的层析介质为琼脂糖凝胶类，配基为李氨基 Q (Sepharose Q Fast Flow)；步骤(2)中的多结合型离子交换层析柱的层析介质为高流速琼脂糖凝胶类、聚苯こ烯类或硅颗粒类，配基为带部分疏水基团的离子交換配基；其中优选配基为N-苯甲基-N-甲基こ醇胺、带疏水基团的季氨基和带疏水基团的磺酸基；最优选优选层析介质为高流速琼脂糖类，配基为N-苯甲基-N-甲基こ醇胺(Captro adhere)；这种多结合型离子交换层析介质相较于単一性质的分离层析介质，同时具有离子 交換功能基团和疏水作用功能基团，可以通过两种作用方式，将蛋白吸附在层析介质上，从而实现通过多种性质进行目的蛋白的纯化、分离。而步骤(2)中所述的脱盐液可以连续通过阴离子交换层析柱和多结合型离子交换层析柱串联层析系统；同样的步骤(2)中所述的脱盐液也可以首先通过阴离子交换层析柱之后收集，再集中通过多结合型离子交换层析柱。步骤(3)中所述的添加氯化钠的缓冲液为Tris-HCl或醋酸钠缓冲液，缓冲液pH为4. O 7. O,缓冲液浓度为10mmol/L 100mmol/L ;优选缓冲液浓度为20mmol/L 50mmol/L,而其中所添加氯化钠的缓冲液中氯化钠的浓度为100mmol/L I. Omol/L ;优选氯化钠的浓度为100mmol/L 600mmol/L。控制氯化钠的浓度可以使得缓冲液的离子强度发生变化，从而使吸附在阳离子交换层析柱上的目标蛋白解吸，达到了分离的目的。
所述步骤(4)中的葡聚糖凝胶G-25脱盐层析柱在上样前，需采用pH4. O的20mM的醋酸钠缓冲液进行平衡。采用这种技术后，通过采用合适的缓冲体系和层析介质，将两步层析进行了串联，简化了层析步骤，节省了层析时间和エ艺成本，并提高了エ艺的处理量。PEG-G-CSF的等电点为5. O 5. 3左右，如果通过阴离子交換层析采用流穿的方式进行内毒素的去除，传统エ艺需要将缓冲液的PH值调整为5. O以下，但是那样会使去除内毒素的效果大大减弱。通过选择合适的磷酸盐缓冲液和pH值，将目的蛋白在高pH的条件下，仍能穿过阴离子交换层析，确保了去内毒素效果，减轻了后续纯化步骤的负荷，提高了エ艺稳定性；PEG-G-CSF的疏水性较强，采用带疏水基团的多结合型离子交换层析介质，在低离子强度条件下将目的蛋白吸附在多结合型离子交换层析介质上，并将内毒素去除和蛋白纯化两步层析实现了串联。同时，通过内毒素去除和蛋白纯化的蛋白液，可以再经过最后一歩的脱盐层析改变串联层析后所得蛋白液的缓冲体系，之所以这样设计，主要是由于纯化步骤采用了添加了氯化钠的缓冲液，所得的蛋白液也含有这种缓冲液，为了去除其中的氯化钠，需再经过脱盐层祈，可以用适合于制剂生产的缓冲液洗脱，这样就使缓冲体系改变了，所得目的蛋白液可以不再经过其他处理，纯度高达99%以上，可以直接用于制剂生产。综上所述，本发明采用的纯化工艺充分利用了目的蛋白在表面电荷和疏水性上的特点，先通过ー个阴离子交换层析柱，有效的去除了内毒素，増加了エ艺的可控性；第二步层析充分利用目的蛋白的强疏水性，实现了串联层析，将内毒素的去除和蛋白的纯化两个步骤合并为ー个步骤。本エ艺不仅可以有效去除内毒素，并且简化了操作步骤，エ艺设计合理，エ艺过程简单，易于控制，便于操作，重复性好；目的蛋白损失少，蛋白收率和质量有明显提高；一次性处理蛋白量大，エ艺稳定性強，适合于大規模エ业生产。
图I为Captro adhere离子交换层析图谱；图2为Captro adhere离子交换层析电泳图谱；图中 I 为ニ交联 mPEG-G-CSF，2 为 mPEG-G-CSF，3 为 G-CSF。
具体实施例方式以下通过实施例将进ー步说明本发明，这些实例不应作为本发明的限制。聚こニ醇化重组人粒细胞集落刺激因子交联液可由现有技术直接获得，如CN1071760C中公开的方法。
实施例II、采用ρΗ8· 5的IOOmM磷酸盐缓冲液平衡葡聚糖凝胶G_25 (Sephadex G-25)脱盐层析柱，将PEG-G-CSF交联液上样完毕，收集脱盐液。2、先将阴离子交换层析柱和多结合型离子交换层析柱进行串联，阴离子交换层析柱的层析介质为琼脂糖凝胶(sepharose Q Fast Flow),多结合型离子交换层析柱的层析介质为高流速琼脂糖凝胶(Captro adhere)。3、用pH8. 5的IOOmM磷酸盐缓冲液平衡对串联层析柱进行平衡，将收集的脱盐液上样，完毕后，再用PH8. 5的IOOmM磷酸盐缓冲液冲洗至基线。然后将阴离子交换层析柱与多结合型离子交换层析柱分开，用pH7. O的IOOmM Tris-HCl缓冲液平衡Captro adhere离子交换层析柱，然后用含O. I I. Omol/L氯化钠的pH7. O的IOOmM Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，收集目的蛋白液，用醋酸将其PH调整至4. 5左右。
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4、用ρΗ4· O的20mM的醋酸钠缓冲液平衡葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex G-25)脱盐柱，将目的蛋白液上样，用平衡缓冲液继续洗脱，收集蛋白峰得到高纯度蛋白样品。5、在百级层流罩下进行除菌过滤，即为PEG-G-CSF原液，取样进行SDS-PAGE检测纯度平均可达97%以上，串联柱收率可达68%以上。实施例2I、采用ρΗ6· O的IOmM磷酸盐缓冲液平衡葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex G-25)脱盐层析柱，将PEG-G-CSF交联液上样完毕，收集脱盐液。2、先将阴离子交换层析柱和多结合型离子交换层析柱进行串联，阴离子交换层析柱的层析介质为琼脂糖凝胶(sepharose Q Fast Flow),多结合型离子交换层析柱的层析介质为高流速琼脂糖凝胶(Captro MMC)。3、用pH6. O的IOmM磷酸盐缓冲液平衡对串联层析柱进行平衡，将收集的脱盐液上样，完毕后，再用PH6. O的IOmM磷酸盐缓冲液冲洗至基线。然后将阴离子交换层析柱与多结合型离子交换层析柱分开，用pH4. O的IOOmM醋酸钠缓冲液平衡Captro MMC离子交换层析柱，然后用含0. lmol/L I. 0mol/L氯化钠的pH4. O的20mM醋酸钠缓冲液进行梯度洗脱，收集目的蛋白液。4、用ρΗ4· O的20mM的醋酸钠缓冲液平衡葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex G-25)脱盐柱，将目的蛋白液上样，用平衡缓冲液继续洗脱，收集蛋白峰得到高纯度蛋白样品。5、在百级层流罩下进行除菌过滤，即为PEG-G-CSF原液，取样进行SDS-PAGE检测纯度平均可达97%以上，串联柱收率可达70%以上。实施例3I、采用ρΗ8· O的20mM磷酸盐缓冲液平衡葡聚糖凝胶G_25 (Sephadex G-25)脱盐层析柱，将PEG-G-CSF交联液上样完毕，收集脱盐液。2、先将阴离子交换层析柱和多结合型离子交换层析柱进行串联，阴离子交换层析柱的层析介质为琼脂糖凝胶(sepharose DEAE Fast Flow),多结合型离子交换层析柱的层析介质为高流速琼脂糖凝胶(Captro adhere)。3、用pH8. O的20mM磷酸盐缓冲液平衡对串联层析柱进行平衡，将收集的脱盐液上样，完毕后，再用PH8. O的20mM磷酸盐缓冲液冲洗至基线。然后将阴离子交换层析柱与多结合型离子交换层析柱分开，用pH6. O的20mM Tris-HCl缓冲液平衡Captro adhere离子交换层析柱，然后用含100mmol/L 600mmol/L氯化钠的pH7. O的20mM Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，收集目的蛋白液，用醋酸将其PH调整至4. 5左右。4、用ρΗ4· O的20mM的醋酸钠缓冲液平衡葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex G-25)脱盐柱，将目的蛋白液上样，用平衡缓冲液继续洗脱，收集蛋白峰得到高纯度蛋白样品。5、在百级层流罩下进行除菌过滤，即为PEG-G-CSF原液，取样进行SDS-PAGE检测纯度平均可达99%以上，串联柱收率可达75%以上。实施例4I、采用ρΗ7· O的20mM磷酸盐缓冲液平衡葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex G-25)脱盐层析柱，将PEG-G-CSF交联液上样完毕，收集脱盐液。 2、先将阴离子交换层析柱和多结合型离子交换层析柱进行串联，阴离子交换层析柱的层析介质为琼脂糖凝胶(sepharose DEAE Fast Flow),多结合型离子交换层析柱的层析介质为高流速琼脂糖凝胶(Captro MMC)。3、用pH7. O的20mM磷酸盐缓冲液平衡对串联层析柱进行平衡，将收集的脱盐液上样，完毕后，再用PH7. O的20mM磷酸盐缓冲液冲洗至基线。然后将阴离子交换层析柱与多结合型离子交换层析柱分开，用pH5. O的20mM醋酸钠缓冲液平衡Captro MMC离子交换层析柱，然后用含100mmol/L 600mmol/L氯化钠的pH5. O的20mM醋酸钠缓冲液进行梯度洗脱，收集目的蛋白液。4、用ρΗ4· O的20mM的醋酸钠缓冲液平衡葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex G-25)脱盐柱，将目的蛋白液上样，用平衡缓冲液继续洗脱，收集蛋白峰得到高纯度蛋白样品。5、在百级层流罩下进行除菌过滤，即为PEG-G-CSF原液，取样进行SDS-PAGE检测纯度平均可达99%以上，串联柱收率可达75%以上。实施例5I、采用ρΗ7· 5的30mM磷酸盐缓冲液平衡葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex G-25)脱盐层析柱，将PEG-G-CSF交联液上样完毕，收集脱盐液。2.先将阴离子交换层析柱和多结合型离子交换层析柱进行串联，阴离子交换层析柱的层析介质为琼脂糖凝胶(sepharose Q Fast Flow),多结合型离子交换层析柱的层析介质为高流速琼脂糖凝胶(Captro adhere)。3、用pH7. 5的30mM磷酸盐缓冲液平衡对串联层析柱进行平衡，将收集的脱盐液上样，完毕后，再用PH7. 5的30mM磷酸盐缓冲液冲洗至基线。然后将阴离子交换层析柱与多结合型离子交换层析柱分开，用pH6. O的20mM Tris-HCl缓冲液平衡Captro adhere离子交换层析柱，然后用含100mmol/L 600mmol/L氯化钠的pH6. O的20mM Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，收集目的蛋白液，用醋酸将其PH调整至4. 5左右。4、用ρΗ4· O的20mM的醋酸钠缓冲液平衡葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex G-25)脱盐柱，将目的蛋白液上样，用平衡缓冲液继续洗脱，收集蛋白峰得到高纯度蛋白样品。5、在百级层流罩下进行除菌过滤，即为PEG-G-CSF原液，取样进行SDS-PAGE检测纯度平均可达99%以上，串联柱收率可达80%以上。实施例6I、采用ρΗ6· 5的50mM磷酸盐缓冲液平衡葡聚糖凝胶G_25 (Sephadex G-25)脱盐层析柱，将PEG-G-CSF交联液上样完毕，收集脱盐液。
2、先将阴离子交换层析柱和多结合型离子交换层析柱进行串联，阴离子交换层析柱的层析介质为琼脂糖凝胶(sepharose Q Fast Flow),多结合型离子交换层析柱的层析介质为高流速琼脂糖凝胶(Captro MMC)。3、用pH6. 5的50mM磷酸盐缓冲液平衡对串联层析柱进行平衡，将收集的脱盐液上样，完毕后，再用PH6. 5的50mM磷酸盐缓冲液冲洗至基线。然后将阴离子交换层析柱与多结合型离子交换层析柱分开，用pH5. O的30mM醋酸钠缓冲液平衡Captro MMC离子交换层析柱，然后用含100mmol/L 600mmol/L氯化钠的pH5. O的30mM醋酸钠缓冲液进行梯度洗脱，收集目的蛋白液。4、用ρΗ4· O的20mM的醋酸钠缓冲液平衡葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex G-25)脱盐柱，将目的蛋白液上样，用平衡缓冲液继续洗脱，收集蛋白峰得到高纯度蛋白样品。5、在百级层流罩下进行除菌过滤，即为PEG-G-CSF原液，取样进行SDS-PAGE检测纯度平均可达99%以上，串联柱收率可达80%以上。
实施例7I、采用ρΗ8· O的20mM磷酸盐缓冲液平衡葡聚糖凝胶G_25 (Sephadex G-25)脱盐层析柱，将PEG-G-CSF交联液上样完毕，收集脱盐液。2、先将阴离子交换层析柱和多结合型离子交换层析柱进行串联，阴离子交换层析柱的层析介质为琼脂糖凝胶(sepharose DEAE Fast Flow),多结合型离子交换层析柱的层析介质为高流速琼脂糖凝胶(QMA Spherosil LS)。3、用pH8. O的20mM磷酸盐缓冲液平衡对串联层析柱进行平衡，将收集的脱盐液上样，完毕后，再用PH8. O的20mM磷酸盐缓冲液冲洗至基线。然后将阴离子交换层析柱与多结合型离子交换层析柱分开，用PH6. O的20mM Tris-HCl缓冲液平衡QMA Spherosil LS离子交换层析柱，然后用含100mmol/L 600mmol/L氯化钠的pH7. O的20mM Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，收集目的蛋白液，用醋酸将其PH调整至4. 5左右。4、用ρΗ4· O的20mM的醋酸钠缓冲液平衡葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex G-25)脱盐柱，将目的蛋白液上样，用平衡缓冲液继续洗脱，收集蛋白峰得到高纯度蛋白样品。5、在百级层流罩下进行除菌过滤，即为PEG-G-CSF原液，取样进行SDS-PAGE检测纯度平均可达99%以上，串联柱收率可达75%以上。实施例8I、采用ρΗ8· O的20mM磷酸盐缓冲液平衡葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex G-25)脱盐层析柱，将PEG-G-CSF交联液上样完毕，收集脱盐液。2、先将阴离子交换层析柱和多结合型离子交换层析柱进行串联，阴离子交换层析柱的层析介质为琼脂糖凝胶(sepharose Q Fast Flow),多结合型离子交换层析柱的层析介质为高流速琼脂糖凝胶(QMA Spherosil LS)。3、用pH8. O的20mM磷酸盐缓冲液平衡对串联层析柱进行平衡，将收集的脱盐液上样，完毕后，再用PH8. O的20mM磷酸盐缓冲液冲洗至基线。然后将阴离子交换层析柱与多结合型离子交换层析柱分开，用PH6. O的20mM Tris-HCl缓冲液平衡QMA Spherosil LS离子交换层析柱，然后用含100mmol/L 600mmol/L氯化钠的pH7. O的20mM Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，收集目的蛋白液，用醋酸将其PH调整至4. 5左右。4、用ρΗ4· O的20mM的醋酸钠缓冲液平衡葡聚糖凝胶G_25 (Sephadex G-25)脱盐柱，将目的蛋白液上样，用平衡缓冲液继续洗脱，收集蛋白峰得到高纯度蛋白样品。5、在百级层流罩下进行除菌过滤，即为PEG-G-CSF原液，取样进行SDS-PAGE检测纯度平均可达99%以上，串联柱收率可达75%以上。试验例I聚こニ醇化重组人粒细胞集落刺激因子的药效学研究PEG-G-CSF主要通过PEG的末端醛基与G-CSF的氨基酸残基反应而成的，与G-CSF相比，分子量的増加 ，降低了 PEG-G-CSF在肾小球的滤过率，提高了药物的稳定性。因为PEG-G-CSF在清除过程中存在着自我调节过程，在中性粒细胞水平恢复以前，血清中PEG-G-CSF的水平要高于同等剂量G-CSF的血清水平，从而使半衰期得以延长，由原来的
3.5小时延长到33小吋。药效学研究可知，PEG-G-CSF可减少化疗期间IV度中性粒细胞减少的发生率，升高中性粒细胞最低值，60、100或200 μ g/kg每个化疗周期给药I次能较好地预防中性粒细胞减少症。G-CSF的半衰期较短，需要毎日注射，每个化疗周期至少连续注射2周；而PEG-G-CSF每疗程只需注射I次，且在安全性和疗效方面与每日注射G-CSF相仿。这样以来PEG-G-CSF相对于G-CSF就具有低给药频率和提高病人顺应性的优势。比较例I采用实施例5所述的方法对聚こニ醇化重组人粒细胞集落刺激因子进行纯化，同时采用现有技术CN1663962A公开的纯化方法进行对比，对比结果如下表现有技术与本发明技术參数对比
技术参规模原液收率原液纯度生产周
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现有技批次量5g40-53% 含有少量聚体，95. 7% 38小时
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本发明批次量IOg57-68%98. 2%34小时可见，采用本发明所述的纯化方法，简化了操作步骤，缩短处理所需的时间，エ艺设计合理，エ艺过程简单，易于控制，便于操作，重复性好；目的蛋白损失少，蛋白收率和质量有明显提高；一次性处理蛋白量大，エ艺稳定性强，适合于大規模エ业生产。
权利要求
1.一种聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的纯化方法，其特征在于将经过脱盐后的聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子交联液顺次通过阴离子交换层析柱与多结合型离子交换层析柱串联层析系统，使内毒素结合到阴离子交换层析柱上； 之后采用添加了氯化钠的缓冲液单独对多结合型离子交换层析柱进行洗脱，收集洗脱后的目的蛋白液； 其中所述的步骤(2)中采用的阴离子交换层析柱的层析介质为琼脂糖凝胶类或聚苯乙烯类，配基为季氨基Q或二乙基氨乙基DEAE ； 所述的多结合型离子交换层析柱的层析介质为高流速琼脂糖凝胶类或聚苯乙烯类或硅颗粒类，其配基为带部分疏水基团的离子交换配基； 所述的添加了氯化钠的缓冲液为Tris-HCl或醋酸钠缓冲液，缓冲液pH为4. O 7. O，缓冲液浓度为10mmol/L 100mmol/L ;其中氯化钠浓度为O. lmol/L I. Omol/L。
2.根据权利要求I所述的聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的纯化方法，其特征在于具体步骤如下 (1)聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子交联液经过葡聚糖凝胶G-25(SephadexG-25)脱盐，得脱盐液； (2)脱盐液顺次通过阴离子交换层析柱与多结合型离子交换层析柱串联层析系统，使内毒素结合到阴离子交换层析柱上，至上样完毕； (3)采用添加了氯化钠的缓冲液单独对多结合型离子交换层析柱进行洗脱，收集洗脱后的目的蛋白液； (4)洗脱后的目的蛋白液经过葡聚糖凝胶G-25(S印hadexG-25)脱盐柱脱盐去除Na+、Cl-，得到高纯度的蛋白样品。
3.根据权利要求2所述的聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的纯化方法，其特征在于所述步骤(I)中的葡聚糖凝胶G-25脱盐层析柱和步骤(2)中的阴离子交换层析柱与多结合型离子交换层析柱串联层析洗脱在上样前，均采用PH6. 0-8. 5、浓度为lOmmol/L IOOmmoI/L的磷酸盐缓冲液进行平衡。
4.根据权利要求2所述的聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的纯化方法，其特征在于所述步骤(4)中的葡聚糖凝胶G-25脱盐层析柱在上样前需采用pH4. O的20mM的醋酸钠缓冲液进行平衡。
5.根据权利要求I或2所述的聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的纯化方法，其特征在于所述的添加了氯化钠的缓冲液为Tris-HCl或醋酸钠缓冲液，缓冲液浓度为20mmol/L SOmmoI /I,;其中氣化纳浓度为 O. lmol/L O. Bmmol /I,η
6.根据权利要求I或2所述的聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的纯化方法，其特征在于所述步骤(2)中的阴离子交换层析柱的层析介质层析介质为琼脂糖类，配基为季氨基Q或二乙基氨乙基DEAE ； 多结合型离子交换层析柱的层析介质为高流速琼脂糖类，配基为N-苯甲基-N-甲基乙醇胺。
全文摘要
本发明提供一种聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的纯化方法，本发明的发明人对各种层析方法进行了大量的研究，发现利用脱盐层析、离子交换串联层析和脱盐层析顺序组合纯化，能够获得高纯度的聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子。本发明纯化工艺充分利用了目的蛋白在表面电荷和疏水性上的特点，先通过一个阴离子交换层析柱，有效的去除了内毒素，增加了工艺的可控性；第二步层析充分利用目的蛋白的强疏水性，实现了串联层析，将内毒素的去除和蛋白的纯化两个步骤合并为一个步骤。本工艺不仅可以有效去除内毒素，并且简化了操作步骤，节省了生产时间，提高了生产效率，十分适合大规模工业化放大生产。
文档编号C07K1/18GK102850450SQ201110184390
公开日2013年1月2日 申请日期2011年7月1日 优先权日2011年7月1日
发明者王晶翼, 孙丽霞, 王克波, 艾现伟, 董婷, 王希菊, 张乐, 王乐 申请人:齐鲁制药有限公司