专利名称：一种抗口腔致龋菌的多肽Pm4及制备方法
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域，涉及Fmoc化学合成多肽，即一种抗口腔致龋菌的多肽Pm4及制备方法，该多肽具有抗口腔致龋菌能力，尤其是链球菌属的细菌。
背景技术：
虽然投入了大量的人力、物力，龋病(dental caries)仍然是世界性非传染性的三大疾病之一。龋病是在口腔内外环境中多种因素影响下，牙齿硬组织发生的一种慢性进行性破坏的细菌感染性疾病。变异链球菌和远缘链球菌是主要的致龋菌。1946年，McClure 和Hewitt证实青霉素可以抑制大鼠龋病的发生，主要机理是抑制细菌细胞壁合成、抑制或干扰细菌的核酸和蛋白质的代谢与合成途径来达到抗菌的目的。然而这些传统抗生素容易诱使细菌发生突变而产生抗菌素的耐药性。因此，国内外学者一直致力于开发新型的抗菌素，而多肽是一段具有抗菌活性的短的氨基酸。鱼类具有强有力的天然免疫系统，从而能够应对大量的病原微生物。我们在之前已经证明了 α 螺旋线性阳离子多肽 Pleurocidin (GWGSFi7KKAAHVGKHVGKAALTHYL-NH2)具有抗致龋菌、真菌的能力，并对变异链球菌生物膜有一定的抑制作用。但是pleurocidin的长度为25个氨基酸，过长的氨基酸提高了合成成本和对细菌生物膜的渗透能力，因此开发出新的短肽就更为必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗口腔致龋菌的多肽Pm4及制备方法，以克服天然抗菌肽长度过长，合成成本相对较高的问题。本发明采用的技术方案是一种抗口腔致龋菌的多肽Pm4，其制备方法是通过对天然多肽pleurocidin的活性中心的查找，对口腔常见致龋菌有一定的抗菌、杀菌能力，在确定活性中心的基础上，对其进行氨基酸的删除和替换形成新型的具有杀菌能力的抗菌多肽；所述新型抗菌多肽Pm4，序列为GWGKFFKKFFKVGK。其制备方法中所述口腔常见致龋菌为变异链球菌。其制备方法中所述口腔常见致龋菌为远缘链球菌。其制备方法中所述口腔常见致龋菌为血链球菌。多肽使细菌细胞膜表面失去原有性状，变得粗糙甚至有出现孔隙，通过在细菌表面形成离子通道，引起细菌内容物的流出，从而导致了细菌的死亡。抗口腔致龋菌的多肽Riil制备方法是，其特征在于通过保持、改进α螺旋特性， 对天然多肽pleurocidin活性中心氨基酸进行删除和替换，通过直接化学Fmoc合成的方法，构建有抗菌能力的多肽。本发明的特点是发现并合成了新型的抗菌短肽。该多肽通过在细菌表面形成离子通道的原理来引起细菌的崩解、死亡。提高了合成成本和利用效率，从而更好的用于龋病的预防和治疗。本发明通过对天然多肽pleurocidin活性中心的删除和替换，构成了新的抗菌多肽。该多肽对口腔中的变异链球菌、血链球菌、远缘链球菌都有一定的抗菌能力。多肽对细菌的最小抑菌浓度范围为8-32Pg/ml，最小杀菌浓度范围为8-64Pg/ml之间。多肽比天然多肽的长度更小，而抑菌、抗菌能力相当。本发明的多肽的抗菌原理为多肽使细菌表面失去原有性状，变得粗糙甚至有出现孔隙；在细菌表面形成离子通道，引起细菌内容物的流出，从而导致了细菌的崩解、死亡；从而具有抗口腔致龋菌的能力。
以下结合附图和实施例对本发明做进一步的详细描述
图1是本发明中的多肽Riill和RI114的α螺线结构软件推测图； 图2是多肽处理细菌的电镜照片； 图3是多肽处理2个小时的结果； 图4是多肽处理2个小时的结果。
具体实施例方式一种抗口腔致龋菌的多肽Pm4，其制备方法是通过对天然多肽pleurocidin的活性中心的查找，对口腔常见致龋菌有一定的抗菌、杀菌能力，在确定活性中心的基础上， 对其进行氨基酸的删除和替换形成新型的具有杀菌能力的抗菌多肽；所述新型抗菌多肽 Pm4，序列为 GWGKFi7KKFi7KVGK15其制备方法中所述口腔常见致龋菌为变异链球菌。其制备方法中所述口腔常见致龋菌为远缘链球菌。其制备方法中所述口腔常见致龋菌为血链球菌。多肽使细菌细胞膜表面失去原有性状，变得粗糙甚至有出现孔隙，通过在细菌表面形成离子通道，引起细菌内容物的流出，从而导致了细菌的死亡。抗口腔致龋菌的多肽制备方法是，其特征在于通过保持、改进α螺旋特性，对天然多肽pleurocidin活性中心氨基酸进行删除和替换，通过直接化学Fmoc合成的方法，构建有抗菌能力的多肽。实施例
图1是多肽Riill和RI114的α螺线结构软件推测图。图2是多肽处理细菌的电镜照片。Α，正常变异链球菌；B，Riill处理过后的变异链球菌；C，Pml4处理过后的变异链球菌；D，正常血链球菌；E，Pmll处理过后的变异链球菌； F，Riil4处理过后的变异链球菌。可以看见多肽处理过后的细菌表面发生变化，出现多孔状或是细菌崩解，皱缩的现象。1.多肽的设计合成 1. 1多肽的设计
多肽采用截取pleurocidin活性中心的方法，删除、替换氨基酸的方法设计。设计后多肽的物理性质如表1。α螺线结构的参数见表1，示意图见图2。表 ιPml Pm4_ GWGRFFKKWWRVGKRVGK GWGKFFKKFFKVGK縣性<H> 0 321 0406疏水!§,H> Oj 56 0 744净电荷ζ 7 5PmSOWGKFFKKFFKFSK0.4460.7555PmllMFKFFKKFFKKWK0 578CL95S6PmMPKFPKKrFKKW0 5680.9335 1. 2 Fmoc方法合成多肽。常规Fmoc固相合成方法合成多肽。该合成方法已经较为成熟，产品质量可靠，合成产物经过HPLC纯化。多肽纯度均需要大于>90%。2.多肽体外抗口腔主要致龋菌活性测试 2. 1细菌菌株和培养条件
菌株变异链球 lif {Streptococcus mutans) UA 159 ；血链球 lif {Streptococcus sanguinis) ATCC 10556 ；远缘链球菌(份re^iococc^s sobrinus) ACTT 6715(购自四川大学华西口腔医院中心实验室)。培养条件37度恒温，BHI培养基中厌氧培养。2. 2最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定
根据美国CLSI标准，使用两倍稀释法来进行MIC和MBC的检测。细菌在BHI培养基中过夜培养后，稀释到IO6 CFU/ml备用。多肽使用两倍稀释法稀释后放入200μ 7孔的96孔板中。加入备用的菌液，挑战多肽最终浓度为0. 125 μδ/πι1到256 Pg/ml。三蒸水作为阴性对照加入其他孔中。整个96孔板放入37° C厌氧恒温箱中静止培养16至M小时。直接观察培养基的浑浊度和用分光光度计(600nm)来确定MIC值。在澄清的孔中取出ΙΟΟμΙ 细菌培养液，铺板、37° C过夜培养。不能观察到菌落生长的多肽浓度为最小杀菌浓度。每个实验重复3次。2. 3多肽处理致龋菌后电镜观察
使用扫描电镜来观察多肽对细菌膜表面的影响。S. mutans UA 159，S. sanguinis 10556在新鲜培养基中厌氧条件下生长到对数期。在室温下，多肽处理细菌悬液(100 μ ) M小时后离心(4500 rpm)收集菌液沉淀。细菌沉淀使用PBS清洗2次，使用2. 5%的戊二醛固定并使用乙腈梯度脱水(50%, 70%, 80%和90%处理20分钟，100%处理20分钟2 次)。然后使用干燥机(ES-2030, Hitachi,日本)冷冻干燥，喷金(Ion Sputter E-1045， Hitachi,日本)。未经过处理的细菌作为阴性对照，其他步骤类似。喷金后的标本使用冷场发射电镜观察(S-4800，Hitachi,日本)。2. 4杀菌曲线的测定
为了检测多肽的短时间杀菌能力，我们进行了时间杀死曲线的实验。变异链球菌、远缘链球菌和血链球菌在BHI培养基中生长到对数期，然后稀释至105CFU/ml。在厌氧的培养条件下，使用检测时间杀死曲线的方法对该多肽的杀菌能力进行评价。使用的浓度是各个多肽8倍的MIC值。具体实验步骤如下在使用多肽处理变异链球菌之后，在每一个时间点(0、2、5、10、20、30、60、120分钟)吸出10μ1的细菌悬液放入490μ1培养基中稀释，使多
肽的浓度降至杀菌浓度之下，并保持在冰上使其停止生长。震荡之后根据不同的细菌浓度， 20-500μ1稀释后菌液铺板，37度厌氧培养之后计数。
3.实验结果证明，其有益效果如下
3. 1 MIC和MBC检测值显示，这几种多肽都对口腔致龋菌有一定的抗菌能力，见表2。
权利要求
1.一种抗口腔致龋菌的多肽Pm4，其制备方法是通过对天然多肽pleurocidin的活性中心的查找，对口腔常见致龋菌有一定的抗菌、杀菌能力，在确定活性中心的基础上，对其进行氨基酸的删除和替换形成新型的具有杀菌能力的抗菌多肽；所述新型抗菌多肽Pm4， 序列为 GWGKFi7KKFi7KVGK15
2.根据权利要求1所述的抗口腔致龋菌的多肽Pm4，其制备方法中所述口腔常见致龋菌为变异链球菌。
3.根据权利要求1所述的抗口腔致龋菌的多肽Pm4，其制备方法中所述口腔常见致龋菌为远缘链球菌。
4.根据权利要求1所述的抗口腔致龋菌的多肽Pm4，其制备方法中所述口腔常见致龋菌为血链球菌。
5.根据权利要求1所述的抗口腔致龋菌的多肽Pm4，其特征是多肽使细菌细胞膜表面失去原有性状，变得粗糙甚至有出现孔隙，通过在细菌表面形成离子通道，引起细菌内容物的流出，从而导致了细菌的死亡。
6.根据权利要求1所述的抗口腔致龋菌的多肽Pm4制备方法是，其特征在于通过保持、改进α螺旋特性，对天然多肽pleurocidin活性中心氨基酸进行删除和替换，通过直接化学Fmoc合成的方法，构建有抗菌能力的多肽。
全文摘要
本发明属于医药生物技术领域，涉及Fmoc化学合成多肽，即一种抗口腔致龋菌的多肽Pm4及制备方法，其制备方法是通过对天然多肽pleurocidin的活性中心的查找，对口腔常见致龋菌有一定的抗菌、杀菌能力，在确定活性中心的基础上，对其进行氨基酸的删除和替换形成新型的具有杀菌能力的抗菌多肽；所述新型抗菌多肽Pm4，序列为GWGKFFKKFFKVGK；其制备方法中所述口腔常见致龋菌为变异链球菌；其制备方法中所述口腔常见致龋菌为远缘链球菌；其制备方法中所述口腔常见致龋菌为血链球菌。它克服天然抗菌肽长度过长，合成成本相对较高的问题。
文档编号C07K7/08GK102417536SQ201110381230
公开日2012年4月18日 申请日期2011年11月26日 优先权日2011年11月26日
发明者倪龙兴, 陶睿 申请人:倪龙兴