中和抗甲型流感病毒抗体及其用途
【专利摘要】本发明涉及特异性结合甲型流感血凝素三聚物的茎区中的表位并中和组1亚型和组2亚型的甲型流感病毒的抗体或其抗原结合片段。本发明还涉及编码所述抗体或抗体片段的核酸、产生所述抗体或抗体片段的永生化B细胞和培养的单浆细胞以及涉及结合所述抗体或抗体片段的表位。此外，本发明涉及所述抗体、抗体片段和表位在筛选方法中以及在甲型流感病毒感染的诊断、治疗和预防中的用途。
【专利说明】中和抗甲型流感病毒抗体及其用途
【背景技术】
[0001]对甲型流感病毒的中和抗体应答对给定病毒亚型通常是特异性的。有16种由它们的血凝素(“HA”)蛋白限定的甲型流感亚型。这16种HA (HI H16)可被分成两组。组 I 由 H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13 和 H16 亚型组成，组 2 包括 H3、H4、H7、H10、H14和H15亚型。虽然所有的亚型均存在于鸟类中，但主要是H1、H2和H3亚型在人中引起疾病。H5、H7和H9亚型正在人中引起散发性严重感染并且可能会产生新的大流行。Hl和H3病毒不断地进化从而产生新的变体，这种现象被称为抗原漂移。因此，响应以前的病毒而产生的抗体针对新的漂移病毒的保护性差或没有保护性。结果是，必须每年产生对抗预计会出现的Hl和H3病毒的新疫苗，该过程十分昂贵并且也不总是有效。这同样适用于H5流感疫苗的制备。实际上，还不清楚基于越南或印度尼西亚甲型流感病毒分离株的现有H5疫苗是否将能对抗将来的流行性H5病毒。
[0002]因为这些原因，将非常期望具有可诱导能够中和所有甲型流感病毒亚型以及它们每年的变体的广谱中和抗体(Gerhard等人2006年进行了综述)。此外，广谱中和异亚型抗体可作为药物施用来预防或治疗甲型流感感染。对于这类药物的制造，选择以高滴度产生以降低生产成本的抗体是重要的。
[0003]已经表征了识别甲型流感病毒的抗体。针对M2 (在受感染的细胞上表达但不在感染病毒上表达的一种小蛋白质)的抗体已经显示出一定的体内保护性效果，可能是通过靶向受感染细胞来通过NK细胞或细胞毒性T细胞破坏。还可能用中和抗体靶向HA蛋白。HA作为同型三聚体前提多肽HAO合成。每个单体可独立地在翻译后切割而形成两条多肽即HAl和HA2，通过单个二硫键连接。较大的N末端片段(HAl，320-330个氨基酸)形成含有受体结合位点和大部分被病毒中和抗体识别的决定簇的膜远端球形结构域。HA的HAl多肽负责病毒与细胞表面的吸附。较小的C末端部分(HA2，~180个氨基酸)形成将该球形结构域锚定至细胞或病毒膜的茎状结构。HA2多肽介导病毒和细胞膜在核内体中融合，从而释放核糖核蛋白复合物释放进细胞质中。
[0004]亚型之间的序列同源性的程度在HAl多肽(亚型之间34% 59%的同源性)比在HA2多肽(51% 80%同源性)中小。最保守的区域是切割位点周围的序列，特别是HA2N末端11个氨基酸，称为融合肽，其在所有甲型流感病毒亚型中是保守的。部分该区域暴露为HA前体分子(HAO)中的表面环区(loop)，但当HAO被切割成HA1/HA2时变成不可接近。概括地说，不同HA亚型中，尤其是在HA1-HA2连接区和在HA2区中都有保守区。然而这些区域对于中和抗体可能是不易接近的。
[0005]在鉴别中和不止一种亚型的甲型流感病毒的抗体方面仅取得有限的成功。另外，迄今所鉴别的抗体的中和作用的迹象窄并且其效价低。Okuno等人用甲型流感病毒/0kuda/57 (H2N2)免疫小鼠并分离了单克隆抗体(C179)，该单克隆抗体结合HA2中的保守构象表位并在动物模型中在体`外和体内中和组I的H2、H1和H5亚型甲型流感病毒(Okuno等人，1993 ；Smirnov 等人，1999 ；Smirnov 等人，2000)。
[0006]Gioia等人描述了在接受了常规季节性流感疫苗的某些个体的血清中存在H5N1病毒中和抗体(Gioia等人，2008)。该作者提出，中和活性可能是由于神经氨酸苷酶(NI)的抗体。然而，未分离单克隆抗体并且未表征靶表位。另外，尚未清楚该血清抗体是否中和其他亚型的甲型流感病毒。
[0007]已经从免疫供体的记忆B细胞和浆细胞分离了可结合HA的茎状区中的表位并且能够中和组I或组2中的一些甲型流感病毒亚型的异亚型人抗体。然而，至今尚未发现靶向在所有16个亚型上保守的HA三聚体中的表位并且能够中和组I和组2亚型二者的病毒的甲型流感特异性中和抗体，并且它们的分离仍是治疗方法和疫苗设计的主要目标。
[0008]尽管进行了数十年的研究，但还没有投入市场的广谱中和或抑制甲型流感病毒感染或缓解甲型流感病毒引起的疾病的抗体。因而，需要鉴别中和多种亚型的甲型流感病毒并且可作为药物用于预防或治疗甲型流感感染的新抗体。还需要鉴别以高滴度产生以降低生产成本的抗体。
【发明内容】
[0009]本发明部分基于从接种了季节性流感疫苗的个体分离出可结合HA并中和不止一种亚型的甲型流感病毒的感染的自然产生的人单克隆抗体以及本发明抗体结合的新表位。因此，在本发明的一个方面，本发明包括中和选自组I和组2亚型的不止一种亚型的甲型流感病毒的感染的抗体及其抗原结合片段。
[0010]在本发明的一个实施例中，本发明包括中和组I亚型和组2亚型的甲型流感病毒的感染的分离的抗体或其抗原结合片段。在本发明的另一个实施例中，其包括中和组I亚型和组2亚型的甲型流感病毒的感染并且特异性结合甲型流感血凝素(HA)三聚体的茎区中的表位的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段的重链和轻链接触HA三聚体的第一近端单体中和第二远端右侧单体中的氨基酸。
[0011]在本发明的另一个实施例中，本发明包括中和组I亚型和组2亚型的甲型流感病毒的感染并且特异性结合甲型流感HA三聚体的茎区中的表位的分离的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段的重链和轻链接触HA三聚体的第一近端单体中和第二远端右侧单体中的氨基酸，并且其中该抗体或其抗原结合片段以比产生FI6变体2的滴度高至少3倍的滴度在被转染的细胞中产生。
[0012]在本发明的又一个实施例中，本发明包括中和组I亚型和组2亚型的甲型流感病毒的感染并且特异性结合甲型流感HA三聚体的茎区中的表位的分离的抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段的重链和轻链接触HA三聚体的第一近端单体中和第二远端右侧单体中的氨基酸，并且其中该抗体或其抗原结合片段包含:(i)分别在SEQ IDNO: 1,41和43中示出的或分别在SEQ ID NO: 1,41和42中示出的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和(?)分别在SEQ ID N0:4、5和6中示出的或分别在SEQ ID N0:44、5和6中示出的轻链⑶Rl、⑶R2和⑶R3序列。
[0013]在本发明的另一个实施例中，本发明包括分离的抗体或其抗原结合片段，其包含至少一个与SEQ ID NO: 1-6、17-22或41-44中的任一者具有至少95%序列同一性的互补决定区(CDR)序列，其中该抗体中和甲型流感病毒。
[0014]在本发明的另 一个实施例中，其包括分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段中和组I亚型和组2亚型的甲型流感病毒的感染并且包含:(i)分别在SEQ ID N0:l、41和43中示出的或分别在SEQ ID NO: 1、41和42中示出的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；和(ii)分别在SEQ ID NO:4、5和6中示出的或分别在SEQ ID N0:44、5和6中示出的轻链⑶Rl、⑶R2和⑶R3序列。
[0015]在本发明的另一个实施例中，本发明包括分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的重链CDRl ;具有SEQ ID N0:2、SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链CDR2 ;和具有 SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 42 或 SEQ ID N0:43 的氨基酸序列的重链 CDR3，其中该抗体中和甲型流感病毒。在本发明的另一个实施例中，其包括分离的抗体或其抗原结合片段，该分离的抗体或其抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 20或SEQ IDNO:44的氨基酸序列的轻链CDRl ;具有SEQ ID N0:5或SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链CDR2;和具有SEQ ID N0:6或SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链CDR3，其中该抗体中和甲型流感病毒。
[0016]在本发明的又一个实施例中，本发明包括分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体包含具有SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的轻链可变区；或具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO: 14的氨基酸序列的轻链可变区；或具有SEQ ID NO: 29的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQID NO:30的氨基酸序列的轻链可变区；或具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链可变区；或具有SEQ ID N0:59的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链可变区；或具有SEQ ID N0:59的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID N0:61的氨基酸序列的轻链可变区；或具有SEQ IDNO:55的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链可变区；或具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID N0:61的氨基酸序列的轻链可变区并且其中该抗体中 和组I亚型和组2亚型的甲型流感病毒。本发明还包括抗体或其抗原结合片段，其中该抗体为FI6变体1、FI6变体2、FI6变体3、FI6变体4或FI6变体5。
[0017]在本发明的另一个实施例中，本发明包括中和组I亚型和组2亚型的甲型流感病毒的感染的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段由永生化B细胞克隆表达。
[0018]在另一个方面，本发明包括包含编码本发明的抗体或抗体片段的多核苷酸的核酸分子。在又一个方面，本发明包括包含本发明的核酸分子的载体和表达本发明的抗体或其抗原结合片段的细胞。在另一个实施例中，本发明包括包含本发明的载体的细胞。在另一个方面，本发明包括分离的或纯化的免疫原性多肽，该免疫原性多肽包含结合本发明的抗体或抗原结合片段的表位。
[0019]本发明还包括药物组合物，该药物组合物包含本发明的抗体或其抗原结合片段、本发明的核酸分子、包含本发明的核酸分子的载体、表达本发明的抗体或抗体片段的细胞、包含本发明的载体的细胞、或本发明的免疫原性多肽以及药学上可接受的稀释剂或载体。本发明还包括药物组合物，该药物组合物包含第一抗体或其抗原结合片段和第二抗体或其抗原结合片段，其中第一抗体为本发明的抗体，而第二抗体为中和甲型流感或乙型流感病毒感染的任何抗体或其抗原结合片段。
[0020]本发明的抗体或其抗原结合片段、本发明的核酸、包含本发明的核酸的载体、表达本发明的载体的细胞、包含结合本发明的抗体或抗体片段的表位的分离的或纯化的免疫原性多肽、或本发明的药物组合物(i)在制备用于治疗甲型流感病毒感染的药物中、(ii)在疫苗中、或(iii)在甲型流感病毒感染的诊断中的用途也设想处于本发明的范围内。另外，本发明的抗体或其抗原结合片段通过检查抗甲型流感病毒疫苗的抗原是否含有具有正确构象的特异性表位来监测所述疫苗的质量的用途也设想处于本发明的范围内。
[0021]在另一个方面，本发明提供预防、治疗或减轻甲型流感病毒感染或降低甲型流感病毒感染的风险的方法，包括给对其有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的抗体或抗原结合抗体片段。
[0022]在另一个方面，本发明包括特异性结合本发明的抗体或其抗原结合片段的表位，其(i)用于疗法中、(ii)用于制备治疗甲型流感病毒感染的药物、(iii)用作疫苗、或(iv)用于筛选能够中和甲型流感病毒感染的配体。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1示出了已用表达编码FI6变体2、3、4或5的基因的载体瞬时转染的293F细胞的抗体产生的滴度。
[0024]图2A和2B是分别与FI6变体3 (在图中称为FI6)复合的HlHA和H3HA的F亚结构域的表面展示。在HAl和HA2中选定的促成保守性疏水沟槽的侧链用箭头指示，其近似边界用黑线指示。Thr (40)和 Thr (318)位于 HAl 中，而 Ile (45)、Trp (21)、Thr (41)、Leu (38)和18-21转折(turn)位于HA2中。
[0025]图3示出了 FI6变体3 (在图中称为FI6)与HA三聚体的F亚结构域的结合。图3A示出了以Ribbons表示法表示的结合三个FI6变体3抗体的H3HA的三聚体。HA单体之一的HAl为黑色，HA2为深灰色，而其他两个HA单体为浅灰色。图3B和3C分别示出了 Hl/FI6变体3复合物和H3/FI6变体3复合物中IXDRl环区与相邻HA单体的融合肽的相互作用的缩放视图。图3D和3E示出了来自H5HA与CR6261的复合物(pdb ID 2GBM) (D)和H5HA与FlO的复合物(pdb 3FKU) (E)的单体的结构，与FI6变体3相比它们结合类似的区域但
它们的VH结构域在HA上的位置低5-10人。
[0026]图4示出了 FI6变体3 (在图中称为FI6_v3)与Hl和H3HA的F亚结构域的相互作用。其描绘了 Hl HA和H3 HA的F亚结构域以及具有选定侧链的FI6变体3的HCDR3和IXDRl环区的表面表示。最接近的HA单体以浅灰色描绘；远端右侧单体以浅灰色描绘；与H3 HAl的N38结合的聚糖以深灰色球体描绘。
[0027]图5示出了交叉反应性抗体结合位点处的组特异性差异。图5A和5B示出了Asn-38处的碳水化合物侧链在H3 HA不含配体的结构(apo_structure) (A)中和在FI6变体3结合结构⑶中的定位。图5C和示出了 HAl Trp-21在不同抗体复合物中的取向。子图C示出了与Hl或H3HA 的F亚结构域相互作用的FI6变体3(在图中称为FI6)的HCDR3环区的Phe-1OOD。子图D示出了分别向H5 HA的Trp-21呈送Phe_55和Phe_54的FlO和CR6261抗体的HCDR2环区。
[0028]图6示出了 FI6变体3在HA上的接触表面。四个子图示出了 FI6变体3、CR6261和FlO抗体在HA上的印迹(用黑线描绘轮廓)；三个HA单体以白色、浅灰色或深灰色描绘。图6A:FI6变体3/未切割Hl的接触印迹;图6B:FI6变体3/切割H3 ;图6C:CR6261/H5 ;图6D:F10/H5o与CR6261和FlO不同，FI6变体3与两个HA单体构成接触。对于FI6变体3复合物，标记了抗体/HA界面处的糖基化位点。
[0029]图7示出了 FI6变体3VH和VK链中接触HA的残基(粗体，Kabat编号法)。
[0030]图8显示FI6变体3在甲型流感病毒感染的小鼠模型中赋予保护作用。图8A示出了在以10MLD50 (小鼠中的50%致死剂量)H1N1A/PR/8/34病毒经鼻内感染前三个小时经静脉内(1.v.)接受不同剂量的FI6变体3的BALB/c小鼠(每种实验条件五只)的存活曲线而图8B示出了其体重损失。图8C示出了在以3 X 105pfu的H3N2HK_x31病毒感染前三个小时经静脉内接受不同剂量的FI6变体3的小鼠(每种实验条件十只)的体重损失。所示出的是所进行的三个实验中的一个代表性实验。还示出的是在以10MLD50的A/PR/8/34病毒感染后第O天(感染前3小时)或第1、2和3天经静脉内接受15mg/kg FI6变体3的小鼠(每种实验条件五只)的存活曲线(图8D)和体重损失(图SE)。示出了所进行的两个实验中的一个代表性实验。所示出的是平均值土SD。图8F和8G示出了在以A/PR/8/34病毒感染前一天接受 10mg/kg(F)或 3mg/kg(G)的 FI6 变体 2(FI6_v2)、FI6_v2KA (缺少补体结合)、FI6-V2LALA (缺少补体和FcR结合)或对照抗体的小鼠(每种实验条件十只)的存活曲线。
[0031]图9示出了在HlNl PR/8/34致死攻击后经FI6变体3处理的小鼠的肺病毒滴度。BALB/c小鼠(每种实验条件四只小鼠)在经10MLD50H1N1 PR/8/34鼻内(1.η.)感染之前三小时(第O天)或之后第1、2或3天接受静脉内注射15mg/kg FI6变体3或对照抗体(HJ16，HIV-1特异性)。在肺部感染后4天测定病毒滴度。在大脑中，病毒无法侦测。数据以箱须图(box-and-whiskers)形式呈现,其中箱从第25百分位延伸至第75百分位，中间为水平线。箱上方和下方的须指示极值。学生t检验统计学分析的结果对于p〈0.05而言以*表示，对于p〈0.0Oi而言以***表示。
[0032]图10示出了与HA茎区结合的FI6变体3干扰蛋白酶介导的HAO切割。用FI6变体3、FE17 (识别HA球形头部上`的Ca2位点的人抗体)或对照抗体温育来自H1NC/99分离株的重组HA。然后使HA-抗体混合物在37°C下暴露于经TPCK处理的胰蛋白酶5、10或20分钟。然后在变性条件下使样品在聚丙烯酰胺凝胶上跑胶并使用可识别所有甲型流感菌株的HA2和HAO的生物素化人mAb(F032)来使蛋白质印迹显影。示出的是HAO带。示出了三个实验中的一个代表性实验。
【具体实施方式】
[0033]本发明部分地基于从接种了季节性甲型流感疫苗的个体中发现和分离能广谱中和不同亚型的甲型流感病毒的天然产生的人抗体以及本发明抗体所结合的新型表位。希望得到这样的抗体，因为为了中和不同亚型的甲型流感病毒仅需要一种或少数几种抗体。另外，广谱中和异亚型抗体以高滴度产生从而降低生产包含抗体的药物的成本。另外，由这类抗体识别的表位可成为能够诱导针对不同亚型的季节性和候选流行分离株的广谱保护作用的疫苗的一部分。
[0034]因此，在一个方面，本发明提供分离的抗体和其抗原结合片段，其能中和至少两种组I和组2亚型中的甲型流感病毒。在一个实施例中，本发明提供分离的抗体或其抗原结合片段，其能中和组I亚型和组2亚型的甲型流感病毒感染。
[0035]在另一个实施例中，提供分离的抗体或其抗原结合片段，其能中和组I亚型和组2亚型的甲型流感病毒感染并且特异性结合甲型流感HA三聚体的茎区中的表位，其中该抗体或其抗原结合片段的重链和轻链接触HA三聚体的第一近端单体和第二远端右侧单体中的氨基酸。
[0036]如早前所论述的，HA蛋白作为包含三个相同单体的三聚体前体多肽HAO (同型三聚体)而合成。每个单体可独立于其他两个单体被切割，或可能不如此。每个单体经翻译后切割形成两条多肽，即HAl和HA2，其或者由单个二硫键连接。本发明抗体的重链和轻链接触HA三聚体的三个单体中的两个。本发明抗体所接触的单体可以是切割的或未被切割的。为清晰起见并且出于理解附图中示意性表示的目的，将本发明抗体所接触的两个抗体称作近端单体和远端右侧单体。
[0037]如本文所用，术语“抗原结合片段”、“片段”和“抗体片段”可互换用来指本发明抗体的保留抗体的抗原结合活性的任何片段。抗体片段的例子包括但不限于单链抗体、Fab、Fab’、F(ab' )2、Fv或scFv。此外，本文所用的术语“抗体”包括抗体和其抗原结合片段二者。
[0038]如本文所用，“中和抗体”是指一种能中和，即防止、抑制、减小、阻碍或干扰病原体引发和/或保持宿主内感染的能力的抗体。术语“中和抗体”和“中和…的抗体”在本文中可以互换使用。如本文所述，这些抗体可单独地或以组合形式，在经适当配制后用作预防剂或治疗剂，与活性疫苗接种联合使用，用作诊断工具或用作生产工具。
[0039]对本领域中已知的与Hl和H5HA共结晶的组I特异性异亚型抗体的X射线结晶学研究表明抗体与HA三聚体的仅一个单体相互作用。另外，研究显示这些抗体使HA仅与重链的CDR残基接触而不与轻链的CDR残基接触。相反，本发明的抗体或抗原结合片段并非接触三个HA单体中的一个，而是接触两个。另外，本发明的抗体使HA与来自重链和轻链二者的CDR残基接触。另外，由本发明的抗体或抗原结合片段与HA构成的相互作用的性质与由其他抗体(CR6261和F10)构成的相互作用性质明显不同。最显著的区别在于本发明抗体与HA上的疏水沟槽的相互作用仅由重链的⑶R3 (HCDR3)介导，而对于CR6261和FlO而言，该结合中涉及所有三个HCDR。
[0040]在一个实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段的重链接触近端单体中的氨基酸残基，且本发明的抗体或抗原结合片段的轻链接触HA三聚体的近端单体和远端右侧单体二者中的氨基酸残基。本发明抗体接触的单体(即，近端单体和远端右侧单体)可未被切割，或其可被切割而形成HAl和HA2多肽。在一个实施例中，近端单体和远端右侧单体被切割。在另一个实施例中，近端单体和远端右侧单体未被切割。
[0041]本发明的抗体和抗原结合片段特异性结合甲型流感病毒的16种亚型的16种不同HA中保守的表位。在一个实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段结合包含HAl中位置329处的氨基酸残基和HA2中位置1、2、3和4处的氨基酸残基的表位，其中HAl和HA2存在于HA三聚体的未切割单体中。
[0042]在另一个实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段的重链接触近端或远端右侧单体的HAl中位置318处的氨基酸残基和HA2中位置18、19、20、21、38、41、42、45、49、53和57处的氨基酸残基。这些单体可以是未被切割的或切割的。
[0043]在又一个实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段的轻链接触未被切割的近端单体的HA2中位置38、39和43处的氨基酸残基和未被切割的远端右侧单体的HAl中位置327、328和329处和HA2中位置1、2、3和4处的氨基酸残基。[0044]在又一个实施例中，本发明的抗体和抗原结合片段特异性结合包含未被切割的近端单体的HAl中位置318处的氨基酸残基和HA2中位置18、19、20、21、38、39、41、42、43、45、48、49、53、56和57处的氨基酸残基的表位。另外，这些抗体特异性结合包含未被切割的远端右侧单体的HAl中位置327、328、329处的氨基酸残基和HA2多肽中位置1、2、3和4处的
氨基酸残基的表位。
[0045]在另一个实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段的轻链接触近端单体的HA2中位置38、39、42和46处的氨基酸残基和远端右侧单体的HAl中位置321和323处和HA2中位置7和11处的氨基酸残基。在该实施例中，近端和远端右侧单体二者均被切割。
[0046]在又一个实施例中，本发明的抗体和抗原结合片段特异性结合包含切割的近端单体的HAl中位置318处的氨基酸残基和HA2中位置18、19、20、21、38、39、41、42、45、46、49、52,53和57处的氨基酸残基，以及被切割的远端右侧单体的HAl中位置321和323处的氨基酸残基和HA2中位置7和11处的氨基酸残基的表位。
[0047]如本文所示，本发明的抗体或抗原结合片段能够特异性结合所有16种亚型的甲型流感病毒的HA。在一个实施例中，本发明的抗体特异性结合亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 和 H16 的甲型流感 HA。
[0048]在本发明的另一个实施例中，本发明提供具有高生产滴度的抗体。举例而言，一旦分离本发明的两种极类似的抗体(FI6变体I和FI6变体2)，就合成所述抗体的若干种变体(尤其是FI6变体2的变体)来改善在转染细胞中的产生。在一个实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段以比产生FI6变体2的滴度高至少1.5倍的滴度在被转染的细胞中产生。在另一个实施例中，本发明的抗体以比产生FI6变体2的滴度高至少1.8、2、2.2,2.5,2.7、
3,3.2,3.4,3.6,3.8、4、4.2,4.4,4.6,4.8、5、5.3、5.6 或 6 倍的滴度产生。在一些实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段以比产生FI6变体2的滴度高至少3倍、至少4倍或至少4.5倍的滴度在被转染的细胞中产生。
[0049]因此，在一个实施例中，本发明提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中和组I亚型和组2亚型的甲型流感病毒的感染并且特异性结合甲型流感HA三聚体的茎区中的表位，其中该抗体或其抗原结合片段的重链和轻链接触HA三聚体的第一近端单体和第二远端右侧单体中的氨基酸，且其中该抗体或其抗原结合片段在转染细胞中以比产生FI6变体2时的滴度高例如至少3倍的滴度产生。
[0050]如本文所述，转染细胞可为本领域技术人员现在已知或后来发现用于表达编码本发明抗体的核酸序列的任何细胞。这样的细胞的例子包括但不限于哺乳动物宿主细胞，例如CHO、HEK293T、PER.C6、NS0、骨髓瘤或杂交瘤细胞。此外，这些细胞可被瞬时转染或稳定转染。转染类型以及适用于转染的细胞类型在本领域技术人员的技能范围内。
[0051]在另一个实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段特异性结合包含SEQ IDNO: 37、38、39或40中任一者的氨基酸序列的多肽。
[0052]人单克隆抗体、分泌本发明抗体的永生化B细胞克隆或转染的宿主细胞以及编码本发明抗体的核酸也包括在本发明的范围内。如本文所用，术语“广谱特异性”用来指可结合和/或中和一种或多种组I亚型和一种或多种组2亚型的甲型流感病毒的本发明抗体或抗原结合片段。
[0053]本发明的抗体或抗原结合片段中和一种或多种组I亚型(H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13和H16以及它们的变体)的甲型流感病毒和一种或多种组2亚型(H3、H4、H7、H10、H14和H15以及它们的变体)的甲型流感病毒。在一个实施例中，示例性的组I亚型包括H1、H2、H5、H6和H9，示例性的组2亚型包括H3和H7。
[0054]本发明的抗体和抗体片段能够中和甲型流感病毒亚型的各种组合。在一个实施例中，抗体可中和甲型流感病毒Hl和H3亚型、或H2和H3亚型，或H3和H5亚型，或H3和H9亚型，或Hl和H7亚型，或H2和H7亚型，或H5和H7亚型，或H7和H9亚型。
[0055]在另一个实施例中，本发明的抗体和抗体片段可中和甲型流感病毒Hl、H2和H3亚型，或Hl、H3和H5亚型，或Hl、H3和H9亚型，或H2、H3和H5亚型，或H2、H3和H9亚型，或H3、H5和H9亚型，或Hl、H2和H7亚型，或Hl、H5和H7亚型，或Hl、H7和H9亚型，或H2、H5和H7亚型，或H2、H7和H9亚型，或H5、H7和H9亚型，或H1、H3和H7亚型，或H2、H3和H7亚型，或H3、H5和H7亚型，或H3、H7和H9亚型。
[0056]在又一个实施例中，抗体可中和甲型流感病毒Hl、H2、H3和H7亚型，或Hl、H3、H5和H7亚型，或H1、H3、H7和H9亚型，或H2、H3、H5和H7亚型，或H2、H3、H7和H9亚型，或H3、H5、H7 和 H9 亚型，或 H1、H2、H3 和 H5 亚型，或 H1、H2、H3 和 H9 亚型，或 H1、H3、H5 和 H9亚型，或H2、H3、H5和H9亚型，或H1、H2、H5和H7亚型，或H1、H2、H7和H9亚型，或H1、H5、H7和H9亚型，或H2、H5、H7和H9亚型。
[0057]在又一实施例中，本发明的抗体可中和甲型流感病毒Hl、H2、H3、H5和H7亚型，或H1、H2、H3、H7 和 H9 亚型，或 H1、H3、H5、H7 和 H9 亚型，或 H2、H3、H5、H7 和 H9 亚型，或 Hl、H2、H3、H5 和 H9 亚型，或 H1、H2、H5、H7 和 H9 亚型，或 H1、H2、H3、H5、H7 和 H9 亚型。在又
一个实施例中，除了中和甲型流感病毒H6亚型外，本发明的抗体和抗原结合片段还中和上述组合中的一者或多者。
`[0058]本发明的抗体和抗原结合片段具有高中和效价。中和50%甲型流感病毒所需要的本发明抗体的浓度可例如为约50 μ g/ml或更低。在一个实施例中，中和50%甲型流感病毒所需要的本发明抗体的浓度为约 50、45、40、35、30、25、20、17.5、15、12.5、11、10、9、8、7、6、
5,4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5或约I μ g/ml或更低。在另一个实施例中，中和50%甲型流感病毒所需要的本发明抗体的浓度为约0.9,0.8,0.75,0.7,0.65,0.6,0.55,0.5,0.45,0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.075、0.05、0.04、0.03、0.02,0.0U0.008,0.006,0.004、0.003,0.002或约0.001 μ g/ml或更低。这意味着中和50%甲型流感病毒仅需低浓度的抗体。可使用本领域技术人员已知的标准中和测定法来测量特异性和效价。
[0059]本发明提供对于HA具有特定广谱特异性且中和一种或多种组I的甲型流感病毒亚型和一种或多种组2的甲型流感病毒亚型的抗体。本发明的抗体结合HA的在选自组I和组2的两种或更多种甲型流感病毒亚型之间保守的区域中的表位。
[0060]在一个实施例中，本发明提供抗体，例如分离的抗体或纯化的抗体，其特异性地结合组I和组2甲型流感病毒亚型的HA的茎区中的保守表位并且干扰病毒的复制和传播。本发明还提供抗体，例如分离的抗体或纯化的抗体，其特异性地结合组I和组2亚型的HA的茎区中的保守表位并抑制病毒进入细胞。不受任何理论约束，在一个示例性实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段结合甲型流感病毒的茎区中的保守表位并通过干扰融合步骤来抑制病毒进入细胞。在一个实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段通过募集补体和表达FcR的杀伤细胞并介导抗体依赖细胞毒性(antibody-dependent cellcytotoxicity, ADCC)来限制病毒传播。蛋白的表位或抗原决定簇对应于该分子为抗体的结合位点(或互补位)所特异性识别的那些部分。因此，表位是需要互补性互补位来进行它们的操作性识别的相关实体。在蛋白的不同变体之间保守的表位是指相同的互补位能通过接触这些分子的相同部分而特异性地识别这些不同的变体。
[0061]本发明的抗体可以是单克隆的，例如人单克隆抗体，或重组抗体。本发明还提供本发明抗体的片段，尤其是保留抗体的抗原结合活性的片段。尽管本说明书(包括权利要求书)在某些地方，明确是指抗体的抗原结合片段、抗体片段、变体和/或衍生物，但是应当理解，术语“抗体”或“本发明的抗体”包括所有的抗体类别，即抗体的抗原结合片段、抗体片段、变体和衍生物。
[0062]在一个实施例中，本发明的抗体和抗体片段中和组I和组2的两种或更多种甲型流感病毒亚型的组合。示例性甲型流感病毒亚型包括但不限于H5N1 (A/越南/1203/04)、HlNl (A/新喀里多尼亚/20/99)、HlNl (A/所罗门群岛/3/2006)、H3N2 (A/怀俄明/3/03)和H9N2 (A/鸡/香港/G9/97)。在另一个实施例中，抗体中和3、4、5、6、7或更多种组I和组2甲型流感病毒亚型的组合和/或对3、4、5、6、7或更多种组I和组2甲型流感病毒亚型的组合具特异性。
[0063]在一个示例性实施例中，本发明包括对甲型流感病毒亚型Hl和H3 (例如HlNl和H3N2)或H1、H3、H5和H9 (例如H1N1、H3N2、H5N1和H9N2)具特异性的抗体或其抗体片段。在又一个实施例中，抗体或其抗体片段对犯、!13、册、!17和H9 (例如H1N1、H3N2、H5N1、H7N1、H7N7、H9N2)具特异性。在本 申请的前面部分提供了甲型流感病毒亚型的其他示例性组合。
[0064]本发明的示例性抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸序列的SEQID编号以及编码它们的核酸序列的SEQ ID编号列于表1中。
[0065]表1:示例性甲型流感病毒中和抗体的W多肽和多核苷酸的SEQ ID编号
【权利要求】
1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中和组I亚型和组2亚型的甲型流感病毒的感染并特异性结合甲型流感血凝素(HA)三聚体的茎区中的表位，其中所述抗体或其抗原结合片段的重链和轻链接触所述HA三聚体的第一近端单体和第二远端右侧单体中的氨基酸，并且其中所述抗体或其抗原结合片段以比产生FI6变体2的滴度高至少3倍的滴度在被转染的细胞中产生。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段的重链接触所述近端单体中的氨基酸残基，并且其中所述抗体或其抗原结合片段的轻链接触所述近端单体中的氨基酸残基和所述HA三聚体的所述远端右侧单体中的氨基酸残基。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合甲型流感HA三聚体的茎区中的表位，并且其中所述HA三聚体中的所述第一或第二单体是未被切割的或切割的。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段的重链接触所述第一或第二单体的HAl中位置318处的氨基酸和HA2中位置18、19、20、21、38、41、42、45、49、53和57处的氨基酸残基，并且其中所述单体是未被切割的或被切割的。
5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段的轻链接触所述近端单体的HA2中位置38、39和43处的氨基酸残基和所述远端右侧单体的HAl中位置327、328和329以及HA2中位置1、2、3和4处的氨基酸残基，并且其中所述近端单体和所述远端右侧单体是未被切割的。
6.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段的轻链接触所述近端单体的HA2中位置38、39、42和46处的氨基酸残基以及所述远端右侧单体的HAl中位置321和323以及HA2中位置7和11处的氨基酸残基，并且其中所述近端单体和所述远端右侧单体是被切割的。
7.根据权利要求1所述 的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合包含所述近端单体的HAl 中位置 318 处的氨基酸和 HA2 中位置 18、19、20、21、38、39、41、42、43、45、48、49、53、56和57处的氨基酸残基，以及所述远端右侧单体的HAl中位置327、328、329处的氨基酸残基和HA2多肽位置1、2、3和4处的氨基酸残基的表位，其中所述近端单体和所述远端右侧单体是未被切割的。
8.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合包含所述近端单体的HAl 中位置 318 处的氨基酸和 HA2 中位置 18、19、20、21、38、39、41、42、45、46、49、52、53 和 57处的氨基酸残基，以及所述远端右侧单体的HAl中位置321和323处的氨基酸残基和HA2中位置7和11处的氨基酸残基的表位，其中所述近端单体和所述远端右侧单体是被切割的。
9.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合包含HAl中位置329处的氨基酸和HA2中位置1、2、3和4处的氨基酸残基的表位，其中所述HAl和HA2存在于所述HA三聚体的未被切割的单体中。
10.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合亚型 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 和 H16 的甲型流感HA。
11.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中和组I亚型和组2亚型的甲型流感病毒的感染并且特异性结合甲型流感HA三聚体的茎区中的表位，其中所述抗体或其抗原结合片段的重链和轻链接触所述HA三聚体的第一近端单体和第二远端右侧单体中的氨基酸，并且其中所述抗体或其抗原结合片段包含:(i)分别在SEQ ID N0:l、41和43中示出的或分别在SEQ ID NO: 1,41和42中示出的重链CDRU CDR2和CDR3序列；和(ii)分别在SEQID N0:4、5和6中示出的或分别在SEQ ID NO:44,5和6中示出的轻链CDRU CDR2和CDR3序列。
12.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段的重链接触所述近端单体中的氨基酸残基，并且其中所述抗体或其抗原结合片段的轻链接触所述HA三聚体的所述近端单体中和所述远端右侧单体中的氨基酸残基。
13.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合甲型流感HA三聚体的茎区中的表位，并且其中所述HA三聚体中的所述第一或第二单体是未被切割的或切割的。
14.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段的重链接触所述第一或第二单体的HAl中位置318处的氨基酸和HA2中位置18、19、20、21、38、41、42、45、49、53和57处的氨基酸残基，并且其中所述单体是未被切割的或切割的。
15.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段的轻链接触所述近端单体的HA2中位置38、39和43处的氨基酸残基和所述远端右侧单体的HAl中位置327、328和329以及HA2中位置1、2、3和4处的氨基酸残基，并且其中所述近端单体和所述远端右侧单体是未被切割的。
16.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段的轻链接触所 述近端单体的HA2中位置38、39、42和46处的氨基酸残基和所述远端右侧单体的HAl中位置321和323以及HA2中位置7和11处的氨基酸残基，并且其中所述近端单体和所述远端右侧单体是被切割的。
17.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合包含所述近端单体的 HAl 中位置 318 处的氨基酸和 HA2 中位置 18、19、20、21、38、39、41、42、43、45、48、49、53、56和57处的氨基酸残基，以及所述远端右侧单体的HAl中位置327、328、329处的氨基酸残基和HA2多肽中位置1、2、3和4处的氨基酸残基的表位，其中所述近端单体和所述远端右侧单体是未被切割的。
18.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合包含所述近端单体的 HAl 中位置 318 处的氨基酸和 HA2 中位置 18、19、20、21、38、39、41、42、45、46、49、52、53和57处的氨基酸残基，以及所述远端右侧单体的HAl中位置321和323处的氨基酸残基和HA2中位置7和11处的氨基酸残基的表位，其中所述近端单体和所述远端右侧单体是被切割的。
19.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其特异性结合包含HAl中位置329处的氨基酸和HA2的位置1、2、3和4处的氨基酸残基的表位，其中所述HAl和HA2存在于所述HA三聚体的未被切割的单体中。
20.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合亚型 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 和 H16 的甲型流感HA。
21.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中和组I亚型和组2亚型的甲型流感病毒的感染，并且包含:(i)分别在SEQ ID NO: 1、41和43中示出的或分别在SEQ ID N0:l、41和42中示出的重链⑶R1XDR2和⑶R3序列；和(ii)分别在SEQ ID NO:4、5和6中示出的或分别在SEQ ID N0:44、5和6中示出的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQIDN0:59或55中示出的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的重链可变区；和与SEQ IDNO: 57或61中不出的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的轻链可变区；
23.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链可变区；或具有SEQ ID NO: 59的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的轻链可变区；或具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的轻链可变区；或具有SEQID NO:55的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的轻链可变区，并且其中所述抗体中和组I亚型和组2亚型的甲型流感病毒。
24.根据前述权利要求任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为人抗体、单克隆抗体、纯化的抗体、单链抗体、Fab> Fab’、F(ah' ) 2、Fv或scFv。
25.根据前述权利要求任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其用于治疗甲型流感病毒感染。
26.一种核酸分子，其包含编码前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。
27.根据权利要求26所述的核酸分子，其中所述多核苷酸包含与SEQID NO:45-54,56、58、60或62中任一者中所不的核酸序列具有至少75%同一性的序列。
28.根据权利要求26所述的核酸分子，其中所述多核苷酸包含SEQID N0:60和58、或SEQ ID NO:60 和 62、或 ·SEQ ID NO:56 和 58、或 SEQ ID NO:56 和 62 中所示的序列。
29.—种载体，其包含根据权利要求26、27或28所述的核酸分子。
30.一种细胞，其表达根据权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段；或者包含根据权利要求29所述的载体。
31.一种分离的或纯化的免疫原性多肽，其包含结合根据权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的表位。
32.—种药物组合物，其包含根据权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求26-28中任一项所述的核酸、根据权利要求29所述的载体、根据权利要求30所述的细胞或根据权利要求31所述的免疫原性多肽以及药学上可接受的稀释剂或载体。
33.根据权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求26-28中任一项所述的核酸、根据权利要求29所述的载体、根据权利要求30所述的细胞或根据权利要求31所述的免疫原性多肽或根据权利要求32所述的药物组合物的用途，(i)用于制造用来治疗甲型流感病毒感染的药物、(ii)用于疫苗或(iii)用于诊断甲型流感病毒感染。
34.根据权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的用途，用于通过检查抗甲型流感病毒疫苗的抗原是否含有具有正确构象的特异性表位来监测所述疫苗的质量。
35.一种减少甲型流感病毒感染或降低甲型流感病毒感染的风险的方法，包括:给对其有需要的受试者施用预防或治疗有效量的根据权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
【文档编号】C07K16/10GK103717617SQ201180072356
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2011年7月18日 优先权日:2011年7月18日
【发明者】A·兰扎韦基亚 申请人:生物医学学会