专利名称：中国南海信号芋螺毒素Lt7b的制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种多肽及其编码基因序列、其制备方法和应用。属于生物领域。
背景技术：
芋螺(Cone snails)，俗称为“鸡心螺”，其在分类学上隶属于软体动物门(Mollusca)、腹足纲(Gastropoda)、前觸亚纲(Prosobranchia)、新腹足目(Neogastropoda)、芋螺科(Conidae)、芋螺属(Conus)。地球上现存的芋螺物种约有700多种，主要分布于温暖的热带或亚热带海域，其中以印度-太平洋区域和东太平洋-西大西洋区域最多。芋螺一般生活在岩石、珊瑚礁、沙和泥沙质的海底。少数物种可以栖息在几十米至200余米的深水区。白昼或退潮后在海藻下或珊瑚洞中栖息，夜晚外出觅食，春季和夏季为其主要的繁殖期。我国现今发现了约有80多种芋螺，主要分布于南沙群岛、西沙群岛、海南岛及台湾附近海域，少数分布在广东、广西沿海。芋螺按其食性可分为三大类食鱼芋螺(piscivorous)，食螺芋螺(molluscivorous)和食虫芋螺(vermivorous)。其中食虫性芋螺种类最多，占全部芋螺种类的70%左右，而食鱼性芋螺虽然占芋螺总数较少，但毒性最强，至今为止报道的芋螺致死事件基本上是该类芋螺造成的。芋螺的毒液是其捕食、防御和竞争的主要武器。毒液由芋螺毒管的上皮细胞分泌产生，并储存于毒管末端的毒泡中。毒液的主要活性成分是复杂的鸡尾酒样的混合毒素多肽，即芋螺毒素(conotoxin)。每种芋螺个体的毒液中大约含有100-1000种成分，其中的绝大部分都是芋螺毒素。近几十年来的研究表明，芋螺毒素主要作用于细胞膜上各种离子通道和神经递质/激肽的受体，且具有很强的生物学活性。芋螺毒素具有如下特点分子质量小，富含二硫键；前导肽高度保守而成熟肽具有多样性；作用靶点广且具有高度组织选择性。芋螺毒素常被作为探针用于各种离子通道和受体的类型及亚型的分类和鉴定，也极有望直接开发成药物或作为先导化合物用于新药的研发。目前，国内外已明确功能的芋螺毒素只占了整个毒素库的很小一部分，但是对它们的生理功能已经有了较为清晰的认识。芋螺毒素二硫键骨架和结构的不同，决定了它们功能靶位的差异，已经清楚的靶位主要包括配体门控的离子通道、电压门控的离子通道及G蛋白偶联的受体。二十世纪七十年代，美国犹他大学教授B. M. Olivera的实验室最早开始了对芋螺毒素全面系统研究工作。芋螺毒素按照其结构特点(前体肽中N端高度保守的信号肽区和C端的二硫键骨架)，可分为不同的超家族和骨架类型。至今已经得到分离的芋螺毒素有数千种，数十种芋螺毒素已申请美国专利。它们在镇痛、局部缺血性保护、癫痫治疗、某些疾病诊断和受体研究中具有广泛的应用价值，有的已进入临床研究或已被FDA正式批准为治疗新药，用作特异诊断试剂和镇痛药。目前，由Elan公司进行开发的芋螺毒素 -MVIIA(SNXIII，商品名Ziconotide)，因其直接作用分布于神经组织的N-型钙离子通道，无需第二信使或蛋白，不成瘾，已成为治疗难治性神经疼痛的新一代药物，已通过了 III期临床试验，正式被FDA批准上市。而另一个衍生于《 -芋螺毒素CVID的化合物AM336作用类似于Ziconotide，因其对N-钙通道的选择性更强，副作用更低，已经批准作为对抗严重抗吗啡作用慢性疼痛的治疗药物进入临床试验阶段。此外，Conantokin-G作为NMDA受体高度选择性的拮抗剂，对难以治疗的癫痫有效，也已完成I期临床试验。另一方面，芋螺毒素作为研究离子通道和膜受体的极好探针或工具，已经成为电压门控型钙离子通道(VSCCs)和N型乙酰胆碱受体(nAChRs)等通道、受体鉴定和诊断的标 准工具，在神经药理学领域得到了广泛的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种中国南海信号芋螺毒素基因Lt7. 2，其基因序列如序列表中序列I所示。本发明的第二个目的是提供上述信号芋螺毒素基因Lt7. 2编码的多肽Lt7b，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。本发明的第三个目的是提供一种重组表达载体pTRX-Lt7. 2。本发明的第四个目的是提供一种多肽的表达方法，从表达、分离和纯化几个方面对原有的多肽表达方法进行改良。本发明的第五个目的在于提供上述芋螺毒素多肽Lt7b在神经生物学研究及镇痛药物开发中的应用。本发明使用的信号芋螺采自中国海南省三亚市。本发明通过构建cDNA文库和测序的方法，从中国南海信号芋螺毒管中分离得到中国南海信号芋螺毒素基因Lt7. 2。本发明提供一种重组表达载体pTRX_Lt7. 2，通过以下方式合成首先，将信号芋螺毒素基因Lt7. 2的cDNA序列分拆为两对互补序列作为模板母链，在该母链基因的5’端和3’端分别加入限制性内切酶Kpn I和Not I的酶切位点；另夕卜，在5’端加入了 EK酶的识别位点，而在3’端还加入了两个终止密码子(TAA)，上述该两对引物经PCR扩增后分为互补配对的两组分别进行磷酸化与退火，合成出线性全长的信号芋螺毒素基因Lt7. 2。其次，通过限制性内切酶Kpn I和Not I双酶切法对质粒pTRX_Neu5进行酶切，切除Neu-5片段后得到线性化的载体pTRX。最后，利用T4DNA连接酶将上述线性的信号芋螺毒素基因Lt7. 2和上述线性化的载体pTRX进行连接，得到重组表达载体pTRX-Lt7. 2。本发明还提供一种多肽的表达方法，具体实施步骤为(I)将重组表达质粒pTRX-Lt7. 2转化大肠杆菌BL21 (DE3)；(2)培养转化后的大肠杆菌BL21(DE3)；(3)对培养后的大肠杆菌BL21(DE3)进行超声裂解，高速离心收集超声上清；上清液经镍柱亲和层析纯化，得到重组融合蛋白；(4)重组融合蛋白经Enterokinase, EK酶酶切，酶切后的产物经分子筛层析过滤和HPLC纯化得到目的蛋白——芋螺毒素多肽Lt7b。
上述多肽的表达方法使用重组表达载体pTRX-Lt7. 2作为表达质粒，表达效率较高，且优化了细菌培养条件和多肽纯化分离方式，有效提高了芋螺毒素多肽Lt7b的表达量。
本发明通过青蛙坐骨神经-腓肠肌标本肌肉收缩实验和小鼠热板法实验发现，一定浓度的芋螺毒素多肽Lt7b具有阻断神经递质传递和镇痛性能，因此本发明还提供一种芋螺毒素多肽Lt7b在神经生物学研究及镇痛药物开发中的应用。
图I重组表达载体pTRX-Lt7. 2合成过程示意2重组表达载体pTRX-Lt7. 2的测序结果3重组融合蛋白镍柱分离纯化亲和层析4重组融合蛋白的诱导表达及纯化的SDS-PAGE电泳图谱图5酶切后的芋螺毒素多肽Lt7b反相高效液相色谱6芋螺毒素多肽Lt7b的MALDI-T0F质谱7芋螺毒素多肽Lt7b蛙坐骨神经-腓肠肌标本肌肉收缩抑制实验结果分析8芋螺毒素多肽Lt7b对小鼠福尔马林法的镇痛实验结果
具体实施例方式以下结合具体实施例，来进一步说明本发明的技术方案。应理解，以下实施例只用于说明本发明而不以任何形式限制本发明。实施例I :信号芋螺毒管组织总RNA的提取及毒素cDNA克隆总RNA的提取参照Gibcol BRL公司的TRIZOL LS试剂说明书进行。LATaq DNA聚合酶、10 XPCR Buffer, DNA ladder 购买自 TaKaRa 公司；dNTP mix, pGEM~T Easy VectorSystems购自Promega公司；PCR引物由Invitrogen公司合成；其他有机试剂均为国产分析纯，购自广州化学试剂厂。取活螺体，用铁锤破碎螺壳，暴露出螺肉，冰上小心并快速分离毒管组织，称重后迅速放入液氮并充分研磨，加入15倍重量体积的TRIZOL LS试剂(即Ig组织中加A 15ml)，冰浴中充分匀浆，-80°C冰箱中保存以备提取总RNA。取50_100mg组织样品，用Iml TRIZOL LS试剂匀浆，15_30°C静置5min。然后加入0. 3mL氯仿，剧烈振荡3min后，15-30°C静置lOmin。4°C、12，OOOrpm离心lOmin，取上层水相。加入0. 5ml异丙醇，冰上静置IOmin 后，4°C、12, OOOrpm 离心 IOmin,弃上清。再加 Iml 75% 乙醇漂洗沉淀,4°C、7，500rpm离心5min，弃上清，真空干燥去除样品中痕量的乙醇，加入适量无RNase的去离子水。取I 进行I %琼脂糖胶电泳，I U I用紫外分光光估算RNA的浓度与纯度，_80°C保存备用。l)cDNA第一链的合成cDNA第一链的合成使用 Clontech 公司的 SMART PCR cDNA Synthesis Kit,按照说明书进行试验。在5 Ul反应体系中加入下列组分(于冰上操作)1 U g螺毒管总RNA，SMART III olignucleotide和CDS III/3’PCR引物各I yl，以超纯水补齐体积，混匀，短暂离心。72°C温育2min,冰浴2min,短暂离心，使混合物集于管底。再依次加入2 y I 5 X FirstStrand Buffer、Iu I 20mmol/L 的 DTT、1u I lOmmol/L 的 dNTP Mix 和 Iu I PowerScriptRT (CLONTECH)后轻弹管壁，混匀并短暂离心。置PCR仪42°C反应Ihr逆转录合成第一链，冰浴终止反应，_40°C保存。 2) 02-超家族芋螺毒素的cDNA克隆PCR引物序列如表I所示表I
权利要求
1.一种中国南海信号芋螺毒素基因，其特征在于基因序列如序列表中序列I所不。
2.一种由权利要求I所述的芋螺毒素基因编码的多肽，其特征在于氨基酸序列如序列表中序列2所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于由载体PTRX和权利要求I所述的芋螺毒素基因连接组成。
4.一种多肽的表达方法，其特征在于实施步骤为 (1)将权利要求3中所述的重组表达载体转化宿主菌； (2)培养转化后的宿主菌； (3)对培养后的宿主菌进行超声裂解，收集上清；上清液经亲和层析纯化，得到重组融合蛋白； (4)重组融合蛋白经肠激酶酶切，酶切的产物经分子筛层析过滤和HPLC纯化得到目的蛋白，芋螺毒素多肽。
5.权利要求2所述的多肽在神经生物学研究及镇痛药物开发中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种中国南海信号芋螺毒素基因Lt7.2及其编码的多肽Lt7b的制备方法和应用。本发明通过构建cDNA文库，从中国南海信号芋螺的毒管组织中克隆得到芋螺毒素基因Lt7.2。本发明提供一种多肽的制备方法，通过将芋螺毒素基因Lt7.2与载体pTRX连接得到重组表达载体pTRX-Lt7.2，将重组表达载体pTRX-Lt7.2转化进入宿主菌中，并在宿主菌中稳定高效表达，表达产物重组融合蛋白经分离纯化后，得到目的蛋白——多肽Lt7b。本发明提供的多肽Lt7b具有阻断神经递质传递和中枢镇痛作用，可用于制备神经生物学研究的工具药和镇痛药物。
文档编号C07K14/435GK102628048SQ201210082809
公开日2012年8月8日 申请日期2012年3月23日 优先权日2012年3月23日
发明者任政华, 吴赟, 周茂军, 尤驭文, 强媛媛, 徐安龙, 朱晓燕, 王磊 申请人:中山大学