专利名称：一种小麦凝集素类蛋白TaJRL2及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种小麦凝集素类蛋白TaJRL2及其编码基因与应用。
背景技术：
植物在整个生命周期中会面临各种细菌、真菌、病毒、蚜虫、蝗虫、螟虫、飞蛾等病虫害的危害等，这些病虫害对植物生长发育产生诸多不利的影响。为了应对各种病虫害，植物自身形成了一系列调控机制除了通过在侵染部位合成和积累木质素、植保素等物质来阻止病菌的入侵和扩展之外，植物还通过诱导防卫反应产生广谱抗性来应对病原菌的侵入。研究表明，植物的防卫反应受两类基因的控制，一类是R基因，一类是病程相关基因，前者属于基础抗性，后者属于诱导型抗性。R基因产物作为受体，直接或者间接的参与病原蛋白互作，从而启动植物体内的抗病信号途径。这类抗病反应产生的抗病性较强，但是由于R基因的资源有限，尤其是对某些复杂的数量性状抗病性如小麦的赤霉病抗性，这类R基因的获得尤其困难。除开资源有限较难获得之外，R基因介导的抗性具有病原种类和病原生理小种的特异性，抗谱不广，抗性易于丧失。与R基因相比较，病程相关基因介导的抗性具有抗性持久、抗谱广泛和资源丰富等优点。在缺乏R基因的情况下，通过克隆病程相关基因提高植物的抗性显得尤为重要。这类病程相关基因的共同特点是在经过病原菌诱导后表达量明显升高或减少。小麦是世界上重要的粮食作物之一，但病虫害的影响往往导致产量和品质的下降。病原菌对植物的侵害及引起的一系列防卫反应在不同植物与病原菌之间存在相似性，因此，我们可以通过抗病反应相关基因的应用来提高植物广谱及长效的抗性。抗病反应的调控因子分为正调控因子和负调控因子两类。正调控因子的超量表达，可以快速而有效的启动抗病反应，提高植物的抗病性，拓宽植物的抗谱；而抑制该基因的表达则会导致抗病性的减弱。凝集素是一类非免疫起源的糖结合蛋白，各种生物中分布广泛、种类众多，家族内各成员的结构和功能亦差异悬殊。根据特征性质的不同可以将植物凝集素分为七个亚家族苋科凝集素、葫芦科韧皮部凝集素、橡胶蛋白结构域凝集素、豆科凝集素、单子叶植物甘露糖结合凝集素、II型核糖体失活蛋白凝集素和jacalin相关凝集素。值得说明的是，本发明的TaJRL2蛋白是来源于小麦的jacalin相关凝集素,在本发明提出之前，Genbank中与TaJRL2的同源性最高的多肽链为小麦蛋白TaJRLl，两者的同源性为42%，其次是大麦的mJRL蛋白LEM2，两者的同源性仅为40%
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能提高小麦赤霉病抗性的小麦凝集素类蛋白 TaJRL2。本发明还要解决的技术问题是提供上述蛋白的编码基因。
本发明还要解决的技术问题是提供上述基因在培育抗赤霉病小麦品种中的应用。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下
一种小麦凝集素类蛋白 TaJRL2 (Triticum aestivum Jacalin Related Lectin
2)，它是具有序列表中SEQ ID NO :2所不的氣基酸序列的蛋白质。该蛋白包含148个氨基酸，等电点为7. 14，含有I个jacalin结构域，为AA11-AA146。在NCBI网站上进行序列比对没有发现与该多肽链同源性超过50%的蛋白序列公布。在已公布的蛋白序列中，与该多肽链同源性最高的蛋白质序列是小麦蛋白TaJRLl，两者的同源性为42 %，其次是大麦的mJRL蛋白LEM2，两者的同源性仅为40 %。因此，TaJRL2是一个新的jccalin类似蛋白。编码所述的小麦凝集素类蛋白TaJRL2的基因TaJRL2。所述的基因TaJRL2优选下列核苷酸序列之一1)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；2)在65°C以上高严谨条件下可与SEQ ID NO : I限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。小麦凝集素类蛋白TaJRL2的编码基因进一步优选序列表中SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列。小麦凝集素类蛋白TaJRL2的编码基因含有447bp的核苷酸。含有所述基因TaJRL2的重组表达载体。所述的重组表达载体优选是在PBI 121载体的XbaI及BamHI位点之间插入所述基因TaJRL2得到的重组质粒。含有所述基因TaJRL2的转基因细胞系。利用现有分子生物学的方法可以得到不同的表达载体和转基因细胞系所述的基因TaJRL2在提高小麦对赤霉病抗性中的应用。所述的含有基因TaJRL2的重组表达载体在提高小麦对赤霉病抗性中的应用。利用任何一种可以引导外源基因在植物中超量表达的载体，将本发明所提供的凝集素类基因TaJRL2导入植物细胞，可获得改变植物对赤霉病抗性的转基因细胞系及转基因植株。为了便于对转基因植物或转基因植物细胞进行筛选，可以对载体进行加工，如加入抗生素标记基因(如潮霉素、卡那霉素和庆大霉素)，加入抗生素标记基因之后的载体用于转化，可以在转化后的植物培养基中加入抗生素，抑制非转基因细胞系和植株的生长，有助于快速和有效的获得转基因植株。为了便于观察外源基因的表达，可以在载体中启动子和外源基因之间加入报告基因(GUS基因、GFP和荧火虫荧光素酶报告基因)，构建报告基因和外源基因融合表达的载体，该载体用于遗传转化，可以通过观察报告基因的表达与否和表达量高低，推测外源基因在植物体内表达情况。为了转基因植物释放的安全性，也可以构建载体时不携带任何筛选标记基因，而在苗期进行PCR检测。含有本发明的TaJRL2表达载体可通过使用基因枪法、农杆菌介导法、花粉管通道，电击，显微注射，Ti质粒，Ri质粒或植物病毒等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化后的植物细胞培育成完整的植株。被转化的植株材料既可以是双子叶植物，也可以是单子叶植物，如水稻、棉花、小麦、大豆、烟草、拟南芥、大麦、高粱、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等。有益效果本发明提供了一种新的小麦凝集素类蛋白TaJRL2及其编码基因。通过基因工程的方法将本发明提供的小麦凝集素类基因转入植物中，可以提高植物对赤霉病的抗性。由于该基因是粮食作物小麦本身存在的内源基因，因此，该基因的超量表达不会影响植物的食品安全性，可以广泛应用于各种植物的抗病虫性育种过程。
图I实施例ISDS-PAGE电泳图。图2实施例2TaJRL2基因PCR扩增结果。图3实施例3TaJRL2基因PCR扩增结果。图4转基因小麦的PCR检测。图5转基因小麦的GUS检测结果，左图为非转基因小麦叶片，右图为转基因小麦叶片，由图明显呈蓝色。图6转基因小麦的赤霉菌抗性得到提闻。
五具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所要求保护的范围。实施例I :TaJRL2蛋白的获得。在抗赤霉病材料望水白开花期，将赤霉菌孢子液用喷雾器喷洒到穗部，所用孢子液为江苏省范围内强致病力赤霉菌菌株F4、F15, F17及F34的分生孢子混合液，接种后立即将穗子套上塑料袋，保持湿度，以保证赤霉菌发病。在接种后24小时后取麦穗，同时用水接种做为对照，取材后立即用液氮冷冻。取700mg冻存的麦穗，加入70mg的PVP于液氮中磨成粉末，加入5mL10%三氯醋酸/丙酮振荡混匀、_20°C沉淀I小时；4°C 15，OOOg离心15min，沉淀重新悬浮于5mL冷丙酮中，-20°C放置2小时；4°C 15，OOOg离心15min，沉淀悬浮于80%的冷丙酮中，-20°C放置I小时，离心去丙酮，将沉淀干燥成粉。按每mg干粉加入10μ L裂解液(7Μ脲，2Μ硫脲，4% CHAPS，1% CA，0. 3%蛋白酶抑制剂，50U/mL DNase I)的比例加入裂解液，4°C搅拌抽提15min后加入14mM的DTT ;4°C再搅拌20min，然后35，OOOg离心lOmin，上清即为蛋白抽提液。将蛋白提取液进行等电聚焦后，进行SDS-PAGE电泳。电泳缓冲液用Tris-Glycine-SDS缓冲液，温度设为17°C;先用2. 5W/胶预电泳30min后，再用5W/胶电泳至溴酚蓝到玻璃板下缘为止。电泳结束后，取下凝胶进行银染。分析在侵染后蛋白点的丰度与对照相比超过3倍的蛋白点(图I)，取一个分子量为15. 56千道尔顿，等电点为7. 14的蛋白点即为TaJRL2蛋白。实施例2 :编码TaJRL2蛋白的cDNA序列的获得。 对实施例I得到的蛋白点进行质谱分析获得其氨基酸组成信息，根据对应肽片段的EST用来搜索小麦EST数据库，得到了 3条EST序列CK216494. 1，CJ596679. I和BM135703. I，将上述3条EST序列进行拼接，然后用MacVector软件设计弓I物Pl，Pl引物对如下Pl-F :5’ -ATGAAGATGGGCCCGTATGGC-3’ (SEQ ID NO. 3) ；P I-R :5’-TCAAACCCCAAGTTTGTAGGC-3’ (SEQID NO. 4)。以抗病种质望水白的穗部cDNA作为模板，用英俊公司的Trizol试剂盒提取小麦穗部的总RNA,采用Promega公司的反转录试剂盒进行反转录，合成单链CDNA0用引物Pl进行PCR扩增，扩增体系为25^，包括5叩模板，Pl-F和Pl-R引物各5pmol，dATP，dTTP, dCTP 和 dGTP 各 5nmol，37. 3nmol MgCl2，0. 5 单位的 DNA 聚合酶，Ix PCR缓冲液。扩增的程序是94°C变性3分钟；30个循环，94°C变性20秒，51°C退火30秒，72 °C延伸I分钟；最后72°C延伸5分钟。通过PCR扩增，获得了包含开放读码框的447bp的核苷酸序列(图2)，测序显示PCR产物如SEQ ID NO : I所示，命名为TaJRL2基因，该序列编码148个氨基酸，如SEQ IDNO 2所示，等电点为7. 14，含有I个jacalin结构域，为AA11-AA146，钙蛋白命名为TaJRL2。 实施例3 -M TaJRL2基因小麦的赤霉菌抗性得到提高。以抗病种质望水白的穗部cDNA作为模板，利用引物P2进行PCR扩增，P2引物对如下P2-F :5’-ATCGTCTAGAGGCGATGAAGATGGGC-3’ (SEQ ID NO. 5) ；P2-R :5’-GTACGGATCCAACCCCAAGTTTGTAG-3’(SEQ ID NO. 6)。将扩增得到的PCR产物(图3)用限制性内切酶XbaI及BamHI进行双酶切后，与经过同样限制性内切酶进行酶切的PBI121表达载体进行连接，酶切验证，获得由CaMV35S启动子启动的TaJRL2超量表达的质粒载体。构建好的载体通过热击法转化到DH5 α大肠杆菌菌株中，通过含有50 μ g/mL的卡那霉素的LB培养基进行筛选，获得阳性克隆。参照1993年Weeks发表在Plant Physiol第102期1077-1084页上的文章中的材料与方法，以幼胚短暂培养产生的可以较高频率再生出可育植株的愈伤组织为受体，采用基因枪法将CaMV35S启动子控制下的TaJRL2基因导入小麦，将基因枪转化后的愈伤放置于含有30mg/L G418的1/2MS培养基上进行筛选，剪取获得的再生苗叶片，提取DNA进行PCR检测(图4)叶片GUS染色检测(图5)，获得TaJRL2超量表达的转基因小麦。将TO代转基因小麦叶片和非转基因叶片同时接种赤霉菌，3天后进行赤霉病抗性鉴定，所用赤霉菌为江苏省内感染小麦的强赤霉菌(F4，F15，F17，F34)菌株的混合物。结果表明，转基因植株对赤霉菌的抗性增强，叶片上赤霉菌菌丝生长变慢(图6)。
权利要求
1.一种小麦凝集素类蛋白TaJRL2，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
2.编码权利要求I所述的小麦凝集素类蛋白TaJRL2的基因TaJRL2。
3.根据权利要求2所述的基因TaJRL2，其特征在于所述的基因TaJRL2具有下列核苷酸序列之一 . 1)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列； .2)在高严谨条件下可与SEQID N01限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
4.含有权利要求2所述基因TaJRL2的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体是在PBI121载体的XbaI及BamHI位点之间插入权利要求2所述基因TaJRL2得到的重组质粒。
6.含有权利要求2所述基因TaJRL2的转基因细胞系。
7.权利要求2所述的基因TaJRL2在提高小麦对赤霉病抗性中的应用。
8.权利要求4所述的含有基因TaJRL2的重组表达载体在提高小麦对赤霉病抗性中的应用。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种小麦凝集素类蛋白TaJRL2及其编码基因与应用。小麦凝集素类蛋白TaJRL2，具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，其编码基因序列如SEQ ID NO1所示。通过基因工程的方法将编码小麦凝集素类蛋白TaJRL2的基因TaJRL2转入小麦中，可以提高小麦对赤霉病的抗性。由于该基因是粮食作物小麦本身存在的内源基因，因此，该基因的超量表达不会影响植物的食品安全性，可广泛应用于各种植物的抗病育种过程。
文档编号C07K14/42GK102617721SQ20121008282
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月26日 优先权日2012年3月26日
发明者徐文琦, 贾海燕, 陈燕, 马正强 申请人:南京农业大学