一种crm197蛋白的生产方法

一种crm197蛋白的生产方法
【专利摘要】本发明涉及一种CRM197蛋白的生产方法，属于生物医药制造领域，其过程包括：种子液的制备CRM197发酵培养、离心去除菌体、发酵液预处理、Toyopearl?DEAE-650S离子交换进行捕获、Butyl?sepharose?4B进行疏水纯化、超滤浓缩换液（冻干）；其中疏水纯化之后蛋白纯度不低于95％，由此确立了合理的发酵和纯化工艺路线以及相应的工艺参数，有利于工艺的放大和规模化生产。
【专利说明】—种CRM197蛋白的生产方法
【技术领域】:
[0001]本发明涉及一种疫苗制备方法，特别涉及一种疫苗的载体蛋白CRM197蛋白的生产方法，属于生物医药制造领域。
【背景技术】:
[0002]随着我国对公共卫生安全的关注度的提高，尤其是对疾病预防为主策略的确立，使得我国的疫苗事业迅速发展。近年来，多糖结合疫苗技术逐渐成熟，已被广泛应用到多种疾病的预防控制中。多糖结合疫苗是指采用化学方法将多糖共价结合在蛋白载体上所制备成的多糖-蛋白结合疫苗，能够使多糖由T细胞非依赖性抗原转化为T细胞依赖性抗原，从而增强多糖的免疫原性，更好地诱导机体产生免疫记忆反应,使机体获得免疫持久性,从而实现多糖抗原免疫原性的提高。
[0003]国际上应用的载体蛋白主要有5种:破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素的无毒变异体CRM197、流感嗜血杆菌D蛋白和B群脑膜炎球菌外膜蛋白复合体。而国内研制的结合疫苗多采用破伤风类毒素，此类结合疫苗虽然具有较好的免疫效果，但破伤风毒素相对分子质量较大，致敏性较强，且存在毒性回复的危险，因此开发和使用无毒性的载体蛋白具有重要意义。
[0004]CRM197是白喉毒素的无毒变异体。与天然白喉毒素相比，CRM197蛋白在结构上仅是A片段上第52位的甘氨酸残基被谷氨酸残基取代，从而使得其酶催化活性丧失，因而不能对细胞产生毒性作用；但由于其B片段的蛋白序列及结构未发生任何变化，没有毒性的CRM197蛋白仍然可与敏感细胞的受体结合。即CRM197蛋白在丧失酶活性及毒性的同时仍保留白喉毒素的免疫原性，且其与其它多种白喉毒素及变异体相比，具有完全无毒，完整性最高、突变最少、结构最接近，受体阻断能力最强的优点。因此CRM197成为一种理想的多糖结合疫苗载体蛋白。
[0005]目前，我国公布的有关生产CRM197的方法专利有:
[0006]2006年03月21日，国家知识产权局公布了葛`兰素史密丝克莱恩生物有限公司P-M-H-德霍泰等用于生产白喉类毒素的方法专利，专利申请号为200680017793.1，此专利涉及CRM197的发酵方法,其包括在发酵罐中的培养白喉棒杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)菌株的发酵方式以及培养基的配方，该培养方式足以维持均质培养物的搅动和限量通气以便培养物中的p02在大部分发酵过程中能够降低到4%以下，直至完成发酵。
[0007]2007年07月18日，国家知识产权局公布了海南天源康泽医药科技有限公司李模孝等白喉毒素突变体CRM197及其制备方法专利，专利申请号为200610042194.7，此专利以大肠杆菌为出发菌，以包涵体形式表达白喉毒素突变体CRM197，目标产物序列为长度536个氨基酸，具有白喉毒素的免疫原性而不具有白喉毒素的毒性。该发明克隆了编码CRM197的基因，构建表达CRM197的重组表达质粒并转化至大肠杆菌表达宿主中以包涵体形式表达。目的蛋白在蛋白总含量中占24%以上，CRM197更易于纯化，纯度易于达到95%以上，目的蛋白回收率高。[0008]2008年09月17日，国家知识产权局公布了齐鲁制药有限公司王克波等的CRM197突变体的纯化方法专利，申请号为200710013378.5，该专利发明了一种利用大肠杆菌表达的CRM197突变体的纯化方法，纯化方法步骤包括将包涵体变性、复性后，利用超滤方法进行浓缩后，利用阴离子交换层析进行纯化，收集蛋白峰，可得到高纯度的蛋白样品。
[0009]无论是天然的菌株还是重组构建的CRM197工程菌，虽然出发菌株不同，但培养方式及其纯化工艺仍是制约其发展的重要一环。工程菌固然有其表达量上的优势，但所表达的蛋白与天然的CRM197蛋白的性质区别仍有待考究和大量的研究工作；而用天然菌，如果选择合适的培养基和培养条件，以及相应的纯化方法，仍能够生产出满足要求的蛋白，而且作为临床用药的载体蛋白，天然的CRM197是最安全的和可靠的。
[0010]因此，筛选合适的出发菌株及恰当的发酵方式，使出发菌能够高水平表达CRM197蛋白，并且进一步对发酵液成分进行分离纯化得到满足要求的CRM197目的蛋白，是本发明所要解决的问题。

【发明内容】
:
[0011]本申请提供一种利用白喉棒杆菌生产CRM197蛋白的方法，包括如下步骤:
[0012]I)采用白喉棒杆菌进行发酵培养；
[0013]2)发酵液通过连续流或者杯式离心机离心后，过中空纤维进行进澄清处理；
[0014]3)经过澄清之后的发酵液用IOkDa超滤膜进行超滤浓缩；
[0015]4)浓缩液经硫酸铵两次盐析后对沉淀进行复溶；
[0016]5)复溶液经离子 交换捕获CRM197蛋白；
[0017]6)捕获后的蛋白经疏水分离进行进一步纯化；
[0018]7)浓缩至所需浓度保存。
[0019]其中白喉棒杆菌来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，菌株编号为ATCC39255、ATCC39526、ATCC 11049、ATCC51926 或 ATCC51280 中的一种；优选 ATCC39255 或 ATCC51280。
[0020]其中步骤1，白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)的培养方式为，I)将种子液接种到培养基中34-35°C培养进行菌种活化；2)菌种活化后,接种至含培养基的发酵罐中，在34-35°C条件下发酵，前期维持发酵液pH在7.3-7.5，此阶段菌体生长，直至生物量不再增加；当菌体进入生长平台期后期蛋白开始大量表达，此时控制发酵液PH在7.4-7.8，以发酵液溶氧不再变化为发酵终点。
[0021]优选的白喉棒杆菌的培养方式为，I)将种子液接种到CY培养基中，35°C摇床培养20h，培养条件转速200rpm，2L三角瓶装液500ml ;2)将种子液接种至含CY培养基的发酵罐中，接种量为5 %，在34.5 °C，以亚硫酸钠饱和溶液标定溶氧电极O %，在300rpm，罐压维持
0.1Mpa，通气量0.75m3/h的条件下标定溶氧为100 %，维持整个培养过程中的溶氧不低于3%，维持发酵液pH为7.4，直至生物量不再增加；3)在菌体进入稳定期后发酵液蛋白pH开始上升，蛋白开始表达，此时控制发酵液pH为7.6，以发酵液溶氧迅速上升为发酵终点。
[0022]其中步骤2，培养好的发酵液通过连续流或者杯式离心机离心之后，采用中空纤维进行进一步澄清处理，以除去残留的菌体碎片和不溶性的颗粒；
[0023]其中步骤3，经过澄清之后的发酵液用IOkDa超滤膜进行超滤浓缩，浓缩完之后进行洗滤，洗滤倍数约在5倍，洗滤缓冲液为IOmM~IOOmM, 0.15~0.2MNaCl pH 7.0~7.6PB,(磷酸缓冲液)，之后取出浓缩液，进行洗膜2-3次，洗膜液和浓缩液合并，最终浓缩液的浓缩倍数约在10倍左右；
[0024]其中步骤4中的两次盐析过程为，浓缩液采用20-50%饱和硫酸铵进行第一次盐析，离心去除沉淀后对上清液进行二次盐析，盐析浓度为60-85%饱和硫酸铵；优选45-50%饱和硫酸铵进行第一次盐析，离心去除沉淀后对上清液进行二次盐析，盐析浓度为70-80%饱和硫酸铵。
[0025]其中步骤5中的离子交换捕获过程为阴离子交换，色谱填料为:Toyopear1DEAE-650S>DEAE.Fratogel EMD、Q.Sepharose.FF>CaptoQ Seharose.FF ;优选:Toyopearl DEAE-650S、Capto Q Sepharose.FF ;复溶液经 10mM-50mM PB 超滤换液体至Cond8.0-2.0，pH调节至7.0-8.0上样，平衡缓冲液为10mM-50mM PB ;洗脱缓冲液:10mM-50mM PB+0.5M KCL ;可采用梯度洗脱或25% B 一步洗脱。 [0026]其中步骤6中的分离纯化过程中疏水填料基架为sepharose.HP或者Toyopearl、Cellufine、POROS > Sepharose.FF、Fractogef;配基为 Butyl 类型或者 Phenyl、Ether >Octy ;基架与配基组合；疏水填料为 Toyopearl Butyl_650S, PhenylSepharose.6FF,Octyl sepharose 4FF ;疏水填料优选填料:Butyl_650S Toyopearl、Phenyl Sepharose6FF (highsub);平衡缓冲液为10~IOOmM PB, pH 7.0~7.6，I~2M-硫酸铵；洗脱缓冲液为10~IOOmM PB, pH 7.0~7.6 ;方式为梯度洗脱或者两阶梯等度洗脱，其中两阶梯等度洗脱第一次洗脱的缓冲液为:10~50mM PB，pH 7.0,0.3-1.5M硫酸铵。
[0027]优选，平衡缓冲液为10~50mM PB, pH 7.0,1.5M硫酸铵；洗脱缓冲液为10~IOOmM PB, pH 7.0~7.6 ;洗脱缓冲液为10~50mM PB, pH 7.0，洗脱方式为一步洗脱，先用预洗缓冲液洗脱杂蛋白以后，再用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，其中预洗缓冲液为50mMPB, PH 7.0,1.05M硫酸铵。
[0028]其中步骤7中所述的浓缩为，采用IOkDa或30kDa，超滤膜进行超滤浓缩至所需浓度；优选IOkDa超滤膜进行超滤；
[0029]其中步骤7中所述的保存方法为超滤浓缩至所需浓度并置换缓冲体系；-20°C冻存或冻干保存；优选，加入1%~5%的抑肽酶和10~20umol/L EDTA后，_20°C冻存或加入糖后冷冻干燥保存。
[0030]另一保存方法为:为冻干保存，冻干前液体除加入1%~5%的抑肽酶和10~20umol/L EDTA外，再加入1% _5%的蔗糖，乳糖，麦芽糖；其中优选蔗糖。
[0031]最优选的纯化工艺为:(I)先通过连续流或者杯式离心机澄清CRM197发酵液，然后0.45um中空纤维膜进一步澄清，IOkDa超滤膜浓缩；(2)超滤浓缩液采用30%饱和硫酸铵进行第一阶段的盐析，离心去除沉淀后对上清液进行二次盐析，盐析浓度为50%饱和硫酸铵，之后对二次沉淀进行沉淀复溶；(3) Capto QSepharose.FF捕获,硫酸铵二次盐析沉淀复溶液，超滤换液至Cond 2.2, pH调节至7.6上样。平衡buffer:20mM PB pH 7.6 ；洗脱 buffer:20mM PB+0.2M NaCL, pH 7.6 ;洗脱方法:一步洗脱；(4)Phenyl Sepharose6FF(highsub)疏水纯化:Capto Q Sepharose.FF捕获液与Buffer (50mM PBS, 2M硫酸铵，pH
7.0)混合，pH 调节至 6.98。平衡 buffer:50mM PBS pH 7.0，IM(NH4)2SO4 ;预洗 buffer:50mM PBpH 7.0,0.3M(NH4)2S04 ;洗脱 buffer:50mM PB pH 7.0 ;洗脱方法:采用两步法洗脱，第一步先预洗洗脱杂蛋白，第二步洗脱Buffer洗脱目的蛋白。(5)采用IOkDa超滤膜进行超滤浓缩至浓度10mg/ml，然后洗虑置换至PB体系下，加入1%的抑肽酶和20umol/L的EDTA，加入I %蔗糖后冻干保存；
[0032]本申请所述方法，是通过工艺摸索及优化获得的，其工艺的关键点为:发酵培养:采用优化的培养基和培养条件，在菌体生长阶段培养基PH值控制在pH在7.4±0.1左右的范围内有利于菌体的迅速生长，菌体进入生长稳定期后期发酵液蛋白PH开始上升，蛋白开始表达，此时控制发酵液pH在7.6±0.2左右的范围内，有利于蛋白大量表达，通过两阶段对于PH值的控制能够使CRM197稳定高产。
[0033]纯化工艺:采用上述纯化工艺路线，第一步采用发酵液的预处理，第二步采用阴离子交换色谱进行捕获，第三步采用疏水层析进一步纯化，能够稳定的生产出满足要求的目的蛋白，疏水纯化之后蛋白纯度不低于90% ；
[0034]本发明与【背景技术】相比，确立了合理的发酵和纯化工艺路线以及相应的工艺参数；从而有利于工艺的放大和规模化生产，经过纯化后的CRM197蛋白纯度高，安全性好，极大的满足了结合疫苗对载体蛋白的要求；
[0035]测定方法及分析结论:
[0036]所得CRM197蛋白采用Western-Blotting，SDS-PAGE,和HPLC方法，通过与标准品进行对比来优化和控制各个步骤，其方法如下:
[0037]1.CRM197 的鉴定
[0038]将待检测样品与标准的CRM197蛋白用SDS-PAGE电泳分离各组分，通过印迹技术把分离样品原位、定量转移到NC膜上，用特异抗体与NC膜上的靶抗原反应，结合上的抗体(一抗)再与辣根过氧化物酶(二抗)进行反应，最后通过酶与底物作用，显色反应来检测靶抗原，结果见图1。`
[0039]2.SDS-PAGE鉴定蛋白纯度及其表达量
[0040]根据文献报道CRM197蛋白分子量为63KD，采用12% SDS-PAGE进行分析，发酵液及其纯化过程中所得样品加入上样缓冲液煮沸上样，考马斯亮蓝染色后采用凝胶成像系统分析，凝胶成像系统为BIO-RAD Gel Doc XR+凝胶成像系统。
[0041]由凝胶成像系统分析图2，与标准品进行对比粗略可知CRM197蛋白的表达量为
[0042]
【权利要求】
1.一种CRM197蛋白的制备方法，包括如下步骤: 1)米用白喉棒杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)进行发酵培养； 2)发酵液通过连续流或者杯式离心机离心后，过中空纤维进行进澄清处理； 3)经过澄清之后的发酵液用IOkDa超滤膜进行超滤浓缩； 4)浓缩液经硫酸铵两次盐析后对沉淀进行复溶； 5)复溶液经离子交换捕获CRM197蛋白； 6)捕获后的蛋白经疏水分离进行进一步纯化； 7)浓缩至所需浓度保存。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤I所述白喉棒杆菌选自美国典型培养物保藏中心，菌株编号为ATCC 39255、ATCC39526、ATCC 11049、ATCC51926或ATCC51280 中的一种；优选 ATCC39255 或 ATCC51280。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤I所述白喉棒杆菌的培养方式为:I)将种子液接种至含CY培养基的发酵罐中，接种量为5%，在34.5°C，以亚硫酸钠饱和溶液标定溶氧电极0%,在30 0rpm,罐压维持0.1Mpa,通气量0.75m3/h的条件下标定溶氧为100 %，维持整个培养过程中的溶氧不低于3 %，维持发酵液pH为7.4，直至生物量不再增加；2)在囷体进入稳定期后发酵液蛋白pH开始上升，蛋白开始表达，此时控制发酵液pH为7.6以发酵液溶氧迅速上升为发酵终点。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述步骤4中的两次盐析过程为，超滤浓缩液采用20-50%饱和硫酸铵进行第一次盐析，离心去除沉淀后用60-85%饱和硫酸铵对上清液进行第二次盐析。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述步骤5中的离子交换色谱为阴离子交换，阴离子色谱填料为:Toyopearl DEAE-650S、DEAE.Fratogel EMD、Q.Sepharose.FF、CaptoQ Seharose.FF ;优选:Toyopearl DEAE-650S、Capto QSepharose.FF。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述步骤5中的离子交换过程为二次盐析沉淀复溶液经10-50M PB缓冲液超滤换液至Cond 10.0-2.0，pH调节至7.0-8.0上阴离子交换柱；洗脱液为:10mM-100M PB+0.5M KCL,采用梯度洗脱或25% B —步洗脱。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述步骤6中的疏水纯化所用其疏水填料为:Toyopearl Phenyl-650、FractogeIeEMD Propyl (S) >Phenyl.Sepharose.6FF (highsub)、Butyl sepharose 4FF ;疏水填料优选:ToyopearlPhenyl-650、Phenyl.Sepharose.6FF(highsub)。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述步骤6中的分离纯化过程中的平衡缓冲液为10~IOOmM PB, pH 7.0~7.6，I~2M硫酸铵；洗脱缓冲液为10~IOOmMPB，pH 7.0~7.6;洗脱方式为梯度洗脱或者两阶梯等度洗脱，其中两阶梯等度洗脱第一次洗脱的缓冲液为:10~50mM PB，pH 7.0,0.3-1.5M硫酸铵。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于:平衡缓冲液为10~50mMPB,pH 7.0，1.5M硫酸铵；洗脱缓冲液为10~IOOmM PB, pH 7.0~7.6 ;洗脱缓冲液为10~50mMPB, pH 7.0，洗脱方式为一步洗脱，先用预洗缓冲液洗脱杂蛋白以后，再用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，其中预洗缓冲液为50mM PB，PH 7.0,1.05M硫酸铵。
10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤7中所述浓缩为步骤6所得的纯化后的蛋白液，采用IOkDa或30kDa，超滤膜进行超滤浓缩，浓缩后保存方法为，加入I %~5%的抑肽酶和10~20umol/L EDTA后，-20°C冻存或者加入I %~5%的抑肽酶和10~20umol/L EDTA后再加入1% _5%的`蔗糖乳糖或麦芽糖冻干保存。
【文档编号】C07K1/30GK103627758SQ201210311131
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年8月28日 优先权日:2012年8月28日
【发明者】范宝庆, 李亚冰, 孙倩, 李军强, 曹小丹, 金永杰, 赵秋敏, 刘贺军, 李剑 申请人:天士力制药集团股份有限公司