专利名称：一种用扩张床吸附技术从乳清中提纯乳铁蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种用扩张床吸附技术从乳清中提纯乳铁蛋白的方法。
背景技术：
牛奶分离出酪蛋白制备奶酪后，剩余溶液即为乳清液。乳清液作为副产物，其水含量高，运输不便，经常通过喷雾干燥等方法制成乳清粉。乳清粉中的主要成分为乳糖和乳清蛋白。乳清蛋白中主要有乳球蛋白(β-Lg)、α-乳白蛋白(α-La)、牛血清白蛋白(BSA)、免疫球蛋白(IgG)，以及乳铁蛋白(Lf)、乳过氧化酶、生长因子和许多生物活性因子及酶，这些物质均具有一定的生物活性，尤其是乳铁蛋白因其特有的功能备受关注。乳铁蛋白等电点为8. O,分子质量8 O kDa，在乳清中含量约为O. 5 g/L。乳铁蛋白 具有抗菌、抗病毒、免疫调节等多种生物活性功能。中国专利CN 1486989 A公开了一种从牛初乳中分离纯化乳铁蛋白的方法，首先对牛初乳进行脱脂处理，并除去酪蛋白和球蛋白，将清液透析6小时后，采用肝素-琼脂糖树脂进行亲和层析，提纯乳铁蛋白。中国专利CN 101362792 A中也是采用亲和层析分离乳铁蛋白。由于亲和层析介质成本较高以及洗脱比较困难，不太适宜工业化大规模应用。中国专利CN 101724013 A和美国专利US 5，149，647均利用阳离子交换树脂提纯乳铁蛋白，首先制备乳清，然后对乳清进行微滤处理，再用阳离子交换层析从微滤的透过液中提纯乳铁蛋白。上面所述的亲和层析和阳离子交换层析，都采用固定床的方式，由于固定床填充密度高，在进料前，必须对其进行微滤或者透析等预处理，以除去不溶性颗粒，否则会造成层析柱堵塞。预处理过程增加设备投入，操作时间长，还会造成乳铁蛋白的损失，降低生产率。同时，固定床层析操作中，流速不能太高，否则柱压太大，使介质变形，影响层析的顺利进行。中国专利CN 1663961A提供了一种无需预处理料液的乳铁蛋白提取方法，把阳离子交换树脂在搅拌下直接与乳清溶液混合吸附，吸附完全后，再用滤布将树脂分离，并转移至NaCl溶液中浸泡以洗脱乳铁蛋白。该方法是典型的单级吸附，分离效率非常低，很难得到高纯度的乳铁蛋白，也难以进行工业化大规模生产。欧洲专利EP1480524 (Al)采用混合模式扩张床介质FastLine SALTO从牛乳中分离乳铁蛋白。先预处理除去牛乳中的酪蛋白，再把料液调节至PH4. 5后上样；洗脱分为两步，先用50 mN硼酸洗脱其他蛋白，再用O. 02 M NaOH洗脱得到乳铁蛋白。由于FastLineSALTO介质同时具有阳离子交换和疏水作用基团，乳铁蛋白的吸附选择性较差，而牛乳中蛋白组分复杂，免疫球蛋白和牛血清白蛋白等都能吸附，所以需要比较复杂的洗脱步骤才能得到纯度大于90%的乳铁蛋白，操作相对繁琐，耗时较长
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种操作简便、分离效率高、成本较低的用扩张床吸附技术从乳清中提纯乳铁蛋白的方法。用扩张床吸附技术从乳清中提纯乳铁蛋白的方法包括以下步骤
1)甜乳清粉加水溶解制成质量百分比浓度为20 80g/L的乳清溶液或采用市售液态乳清液，用NaOH调节pH至7. O 8. O ;
2)扩张床内装填阳离子交换层析介质，阳离子交换介质为StreamlineSP, StreamlineSP XL或Fastline SP ;用pH7. O 8. O的磷酸盐缓冲液从下向上通过床层，平衡扩张床，床层稳定膨胀时，膨胀率介于I. 8 2. 6 ;
3)通入步骤I)的溶液进行吸附，然后通入步骤2)所用的缓冲液冲洗直至没有蛋白洗出，再用含O. I I M NaCl的pH7. O 10. O的磷酸盐缓冲液或者碳酸盐缓冲液洗脱，收集 洗脱液，其纯度为88 93%，乳铁蛋白回收率为47% 86% ；
4)最后用O.2 O. 5 M NaOH在位清洗，并用pH7. O的磷酸盐缓冲液使介质再生。所述的步骤3)中，通入步骤I)的溶液进行吸附时，保持操作流速与平衡扩张床时流速相同，或者保持床层的膨胀率相同。本发明的有益效果如下
(I)扩张床允许料液中含有不溶颗粒，无需微滤等预处理，节省固液分离设备投入，简化流程，减少乳铁蛋白的损失，提闻收率。(2)扩张床的操作流速比固定床方式要高得多，可提高生产效率。(3)阳离子交换介质的选择性好，特异吸附乳铁蛋白，洗脱条件温和，步骤简单易行。(4)仅需一步吸附洗脱就可从粗乳清中提纯得到纯度基本大于90%的乳铁蛋白，工艺简单，适于工业化生产。(5)从廉价的乳清中高效提取高附加值的乳铁蛋白，具有较大的经济效益。
图I是用扩张床吸附技术从乳清中提纯乳铁蛋白的方法的流程 图2是实施例I中收集组分的SDS-PAGE电泳图谱，其中泳道I为蛋白MarkerProteinRuler IV ；2为20 g/L甜乳清粉(原料)；3为穿透液；4为浓缩后的洗脱液；5为Img/mL 标准乳铁蛋白(购自 sigma) ；6 为 LMW-SDS Marker Kit (GE Healthcare)；
图3是实施例5中梯度洗脱谱 图4是实施例6中梯度洗脱谱图。
具体实施例方式本发明采用扩张床阳离子交换吸附技术，只需一步层析，就能提纯乳铁蛋白，得到纯度在90%以上的乳铁蛋白。该方法无需对料液进行微滤等预处理，可直接上样至扩张床；介质的选择性好，能特异性吸附乳铁蛋白；洗脱条件温和，步骤简便。利用本发明的方法，一步分离就能直接从乳清中提纯乳铁蛋白，工艺简单，设备投资低，适合工业化生产，具有一定的经济效益。用扩张床吸附技术从乳清中提纯乳铁蛋白的方法包括以下步骤1)甜乳清粉加水溶解制成质量百分比浓度为20 80g/L的乳清溶液或采用市售液态乳清液，用NaOH调节pH至7. O 8. O ;
2)扩张床内装填阳离子交换层析介质，阳离子交换介质为StreamlineSP, StreamlineSP XL或Fastline SP ;用pH7. O 8. O的磷酸盐缓冲液从下向上通过床层，平衡扩张床，床层稳定膨胀时，膨胀率介于I. 8 2. 6 ;
3)通入步骤I)的溶液进行吸附，然后通入步骤2)所用的缓冲液冲洗直至没有蛋白洗出，再用含O. I I M NaCl的pH7. O 10. O的磷酸盐缓冲液或者碳酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱液，其纯度为88 93%，乳铁蛋白回收率为47% 86% ；
4)最后用O.2 O. 5 M NaOH在位清洗，并用pH7. O的磷酸盐缓冲液使介质再生。所述的步骤3)中，通入步骤I)的溶液进行吸附时，保持操作流速与平衡扩张床时 流速相同，或者保持床层的膨胀率相同。实施例I
1)甜乳清粉加水溶解制成质量百分比浓度为50g/L的乳清溶液IL，用NaOH调节pH至 7.0 ;
2)扩张床内装填阳离子交换层析介质，阳离子交换介质为FastlineSP ;用pH7. O的磷酸盐缓冲液从下向上通过床层，平衡扩张床，床层稳定膨胀时，膨胀率为2. O ；
3)通入步骤I)的溶液进行吸附，然后通入步骤2)所用的缓冲液冲洗直至没有蛋白洗出，再用含O. 5 M NaCl的pH7. O的磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱液，其纯度为90%，乳铁蛋白回收率为83%;
4)用O.2 M NaOH在位清洗介质，最后用pH7. O的磷酸盐缓冲液重新平衡介质。步骤3)中，通入步骤I)的溶液进行吸附时，保持操作流速与平衡扩张床时流速相同。步骤3)得到的洗脱液经超滤浓缩后与其他组分一起进行SDS-PAGE电泳检测，谱图结果如图2。实施例2
1)甜乳清粉加水溶解制成质量百分比浓度为20g/L的乳清溶液IL，用NaOH调节pH至 8.0 ;
2)扩张床内装填阳离子交换层析介质，阳离子交换介质为FastlineSP ;用pH8. O的磷酸盐缓冲液从下向上通过床层，平衡扩张床，床层稳定膨胀时，膨胀率为2. 6 ；
3)通入步骤I)的溶液进行吸附，然后通入步骤2)所用的缓冲液冲洗直至没有蛋白洗出，再用含I M NaCl的pH8. O的磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱液，其纯度为93%，乳铁蛋白回收率为47% ；
4)用O.2 M NaOH在位清洗介质，最后用pH7. O的磷酸盐缓冲液重新平衡介质。步骤3)中，通入步骤I)的溶液进行吸附时，保持操作流速与平衡扩张床时流速相同。实施例3
1)甜乳清粉加水溶解制成质量百分比浓度为80g/L的乳清溶液IL，用NaOH调节pH至 7. 5 ;
2)扩张床内装填阳离子交换层析介质，阳离子交换介质为StreamlineSP ;用pH7. 5的磷酸盐缓冲液从下向上通过床层，平衡扩张床，床层稳定膨胀时，膨胀率为1.8 ;
3)通入步骤I)的溶液进行吸附，然后通入步骤2)所用的缓冲液冲洗直至没有蛋白洗出，再用含O. 5 M NaCl的ρΗΙΟ. O的碳酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱液，其纯度为88%，乳铁蛋白回收率为86% ；
4)用O.2 M NaOH在位清洗介质，最后用pH7. O的磷酸盐缓冲液重新平衡介质。步骤3)中，通入步骤I)的溶液进行吸附时，保持操作流速与平衡扩张床时流速相同。实施例4
1)市售液态乳清液2L,用NaOH调节pH至7. 5 ;
2)扩张床内装填阳离子交换层析介质，阳离子交换介质为StreamlineSP XL ;用口!17. 5·的磷酸盐缓冲液从下向上通过床层，平衡扩张床，床层稳定膨胀时，膨胀率为2. O ；
3)通入步骤I)的溶液进行吸附，然后通入步骤2)所用的缓冲液冲洗直至没有蛋白洗出，再用含O. 5 M NaCl的pH7. 5的磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱液，其纯度为91%，乳铁蛋白回收率为85%;
4)用O.5 M NaOH在位清洗介质，最后用pH7. O的磷酸盐缓冲液重新平衡介质。所述的步骤3)中，通入步骤I)的溶液进行吸附时，保持膨胀率与平衡扩张床时膨胀率相同
实施例5
实施步骤同实施例1，不同的是洗脱条件改为含O. I I M NaCl的pH7. O磷酸盐缓冲液线性梯度洗脱，洗脱谱图如图3。洗脱液中乳铁蛋白纯度89%，回收率为84%。实施例6
实施步骤同实施例1，不同的是洗脱条件改为含O. I I M NaCl的O. 02 mol/L碳酸盐缓冲液(PH10. O)线性梯度洗脱，洗脱谱图如图4。洗脱液中乳铁蛋白纯度89%，回收率为85%。
权利要求
1.一种用扩张床吸附技术从乳清中提纯乳铁蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤 1)甜乳清粉加水溶解制成质量百分比浓度为20 80g/L的乳清溶液或采用市售液态乳清液，用NaOH调节pH至7. O 8. O ; 2)扩张床内装填阳离子交换层析介质，阳离子交换介质为StreamlineSP, StreamlineSP XL或Fastline SP ;用pH7. O 8. O的磷酸盐缓冲液从下向上通过床层，平衡扩张床，床层稳定膨胀时，膨胀率介于I. 8 2. 6 ; 3)通入步骤I)的溶液进行吸附，然后通入步骤2)所用的缓冲液冲洗直至没有蛋白洗出，再用含O. I I M NaCl的pH7. O 10. O的磷酸盐缓冲液或者碳酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱液，其纯度为88 93%，乳铁蛋白回收率为47% 86% ； 4)最后用O.2 O. 5 M NaOH在位清洗，并用pH7. O的磷酸盐缓冲液使介质再生。
2.根据权利要求I所述的一种用扩张床吸附技术从乳清中提纯乳铁蛋白的方法，其特征在于所述的步骤3)中，通入步骤I)的溶液进行吸附时，保持操作流速与平衡扩张床时流速相同，或者保持床层的膨胀率相同。
全文摘要
本发明提供了一种用扩张床吸附技术从乳清中提纯乳铁蛋白的方法。包括以下步骤1)甜乳清粉加水溶解制成乳清溶液或采用市售液态乳清液,用NaOH调节pH；2)扩张床内装填阳离子交换层析介质，用磷酸盐缓冲液从下向上通过床层，平衡扩张床；3)通入步骤1)的溶液进行吸附，再用含NaCl的缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；4)最后用NaOH清洗，并用缓冲液再生介质。本发明以扩张床吸附为核心分离方法，一步分离得到乳铁蛋白的纯度能达到88～93%之间，回收率在47%～86%之间，工艺简便高效，设备投资低，适合工业化生产。
文档编号C07K1/18GK102898516SQ20121041620
公开日2013年1月30日 申请日期2012年10月26日 优先权日2012年10月26日
发明者姚善泾, 杜巧燕, 林东强 申请人:浙江大学