专利名称：聚丙烯酸球刷的活性聚合制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及聚丙烯酸球刷的活性聚合制备方法及其应用，尤其涉及一种通过活性聚合合成路线制备聚丙烯酸球刷及其在蛋白高密度固定化中的应用，属于生物材料技术领域。
背景技术：
活性自由基聚合是上个世纪末在传统自由基聚合基础上逐步发展起来的一种聚合技术。目前获得较好发展的代表性方法有氮氧稳定自由基聚合法(NMP)、原子转移自由基聚合法(ATRP)和断裂-加成链转移自由基聚合法(RAFT)。通过活性自由基聚合法得到的聚合物具有可控的分子量和分子量分布，以及活性的端基，因此使得活性自由基聚合法成为合成具有新型结构材料以及实现材料的结构控制的有力手段。球刷是将聚合物链的一端连接到球形固相载体表面所形成的复合结构。其中，聚丙烯酸球刷由于具有简单规整的结构、丰富的羧基功能基团、良好的分散稳定性以及环境响应特性而得到了广泛的研究与应用。早期主要使用常规自由基聚合法合成聚丙烯酸球刷。近几年随着活性自由基聚合技术的发展，活性自由基聚合法逐渐成为合成聚丙烯酸球刷的主要方法。借助活性聚合技术可以实现对聚丙烯酸毛刷长度的裁制与调控，从而获得结构更为规整可控的球刷。对现有技术的文献检索发现，Rutnakornpituk等在《高分子》第52期987-995页发表的“用于叶酸偶联的聚丙烯酸接枝的磁性纳米颗粒”(Poly (acrylic acid)-graftedmagnetic nanoparticle for conjugation with folic acid, Polymer,52, (2011),987-995)中报道了利用ATRP法制备了聚丙烯酸球刷并实现了对叶酸的偶联。由于ATRP法并不适用于包括丙烯酸在内的带有羧基单体的聚合，因此该文献采用先聚合丙烯酸叔丁酯，然后在强酸性环境中脱除叔丁基的方法来获得聚丙烯酸球刷。这种方法虽然能够获得聚丙烯酸球刷，但显然增加了合成步骤，且由于需要在强酸性条件下进行脱保护，因此存在容易弓I起球刷结构破坏、颗粒团聚等问题。RAFT聚合法作为另一种代表性的活性自由基聚合方法，能够直接聚合丙烯酸，因而更加适合用于制备聚丙烯酸球刷。进一步的文献检索发现，Hong等在《材料化学杂志》第19期5155-5160页发表的“含有介孔球核与pH响应性壳层的智能纳米载体的制备及其在药物可控携载和释放中的应用”(Fabrication of smart nanocontainers with amesoporous core and a pH—responsive shell for controlled uptake and release,J. Mater. Chem.，2009，19，5155-5160)中报道了用RAFT聚合法合成聚丙烯酸球刷。这一工作首先是在介孔氧化硅的外层进行环氧修饰，并通过开环与偶联反应固定RAFT链转移试剂，然后借助RAFT聚合成功地在介孔氧化硅外表面形成聚丙烯酸球刷结构。但在这一工作中，RAFT链转移试剂的固定化共涉及三步表面化学反应，其合成路线仍较为繁琐。因此，本领域的技术人员致力于开发一种采用简便、高效而通用的活性聚合合成路线来合成聚丙烯酸球刷。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种借助RAFT聚合法合成聚丙烯酸球刷的简便、高效而通用的新合成路线。 为实现上述目的，本发明提供了一种聚丙烯酸球刷的活性聚合制备方法以及将该聚丙烯酸球刷材料实现在蛋白高密度固定化中的应用及其方法。具体地，本发明首先将RAFT链转移试剂通过一步反应固定到球形固相载体表面；然后，通过RAFT聚合方法在接枝有RAFT链转移试剂的载体表面形成聚丙烯酸毛刷结构，最终得到聚丙烯酸球刷。本发明是通过以下具体技术方案实现的一方面，本发明合成了一种新型结构的RAFT链转移试剂。本发明的RAFT链转移试剂为硅烷化RAFT链转移试剂，由于该RAFT链转移试剂带有硅烷结构，即RAFT试剂的离去基团带有硅烷功能基团，因此该硅烷化RAFT链转移试剂可以通过一步反应简便地固定到球形固相载体表面。本发明的硅烷化RAFT链转移试剂用下述通式(I)表示
\S
O Z厂V、人^R
/ O ' 1
(I)其中=RSC2-C12的直链烷基(_CnH2n+1，n = 2-12)、或苄基(-C7H7);例如乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、异戍基、新戍基、正己基、2_甲基羊基、正癸基、或正十_■烧基等。另一方面，本发明提供了一种聚丙烯酸球刷及其合成路线。本发明所述的聚丙烯酸球刷，包括作为聚丙烯酸球刷的球核结构的球形固相载体，该聚丙烯酸球刷为在固相载体的表面接枝聚丙烯酸的毛刷结构。其中，所述球形固相载体的表面带有羟基功能基团，且能与硅烷化试剂发生偶联反应。在本发明中，球形固相载体为本领域常用的微球，优选采用《胶体与界面科学杂志》1968年第26期62-69页报道的方法制备得到的单分散氧化娃微球。在本发明中，合成聚丙烯酸球刷的路线使用如上所述的硅烷化RAFT链转移试剂，该合成路线包括以下步骤步骤一，制备硅烷化RAFT链转移试剂；步骤二，通过一步法在微球表面接枝步骤一制备得到的硅烷化RAFT链转移试剂；步骤三，通过RAFT聚合方法在接枝有RAFT链转移试剂的载体表面形成聚丙烯酸毛刷结构，最终得到聚丙烯酸球刷。在本发明的具体实施方式
中，步骤一中制备硅烷化RAFT链转移试剂的具体过程如下首先，将R-SH与碱溶于有机溶剂中，于10_60°C下反应10_60分钟；然后将二硫化碳逐滴加入该体系中，加完于10-60°C下继续反应10-60分钟，溶液变为淡黄色或黄色；再向体系中加入对氯4-苯基三甲氧基硅烷，于10-60°C下继续反应2-24小时，溶液变为黄色或深黄色，有大量固体析出；浓缩有机相，加入非极性有机溶剂，过滤，将得到的黄色或深黄色液体浓缩后通过柱层析纯化，得到硅烷化RAFT链转移试剂。其中，所述碱与R-SH的摩尔比优选为I : 1-4 ;R_SH与二硫化碳的摩尔比优选为I : 1_4 ;R-SH与对氣4-苯基二甲氧基娃烧的摩尔比优选为I : 1-4。在本发明中，所述碱优选为氢氧化钠、碳酸钠、磷酸钾或氢氧化钾等无机碱。有机溶剂优选为四氢呋喃、乙醇、甲苯、二氯甲烷或丙酮等；非极性有机溶剂优选为二氯甲烷、丙酮或甲苯等。在本发明的较佳实施方式中，步骤一中，浓缩液进行柱层析时淋洗剂为乙酸乙酯(EA)-石油醚(PA)、乙酸乙酯-正己烷、或二氯甲烷-石油醚体系；淋洗剂的配比优选为I 1-100。在本发明的较佳实施方式中，步骤二中通过一步法在微球表面接枝步骤一制备得到的硅烷化RAFT链转移试剂的具体过程如下将微球与硅烷化RAFT链转移试剂分散在乙醇中，通过油浴加热的方式使体系回流反应24小时，产物经乙醇洗涤后稳定分散在乙醇中，得到表面由硅烷化RAFT链转移试剂修饰的微球。在本发明的另一较佳实施方式中，步骤三中制备聚丙烯酸球刷的具体过程如下
将制备得到的表面由硅烷化RAFT链转移试剂修饰的微球重新分散在N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)中，加入丙烯酸、自由的RAFT链转移试剂、偶氮二异丁腈，通过油浴加热的方式使体系在70°C下发生聚合反应3小时，产物经乙醇洗涤后稳定分散在乙醇中，得到聚丙烯酸球刷。在本发明中，所述自由的RAFT链转移试剂是指与上述硅烷化RAFT链转移试剂结构类似，但不含硅烷功能基团的RAFT链转移试剂。其结构可以是例如C6H5CH2SCS2C2H5'C6H5CH2SCS2C3H7,C6H5CH2SCS2C4H9,C6H5CH2SCS2C12H25 或 C6H5CH2SCS2CH2C6H5,但并不限于上述结构中的一种。另一方面，本发明还提供了一种根据如上所述合成路线所制备得到的聚丙烯酸球刷的应用，尤其提供了该聚丙烯酸球刷材料在蛋白高密度固定化中的应用。本发明的聚丙烯酸球刷材料在实现蛋白高密度固定化中的应用方法，包括以下步骤步骤一，对聚丙烯酸球刷进行活化；步骤二，将蛋白固定在活化后的聚丙烯酸球刷上；步骤三，对步骤二形成的球刷与蛋白的复合物进行洗涤、封闭与保存。在本发明的优选实施方式中，聚丙烯酸球刷材料在实现蛋白高密度固定化中的具体应用方法如下步骤一，将聚丙烯酸球刷重新分散到缓冲液中，加入I-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和琥珀酰亚胺(NHS)，该体系在室温下混合15分钟，得到活化后的聚丙烯酸球刷，用该缓冲液洗涤三次；步骤二，将活化后的聚丙烯酸球刷与蛋白在缓冲液中混合，在37°C下恒温反应2小时，得到球刷与蛋白的复合物；步骤三，首先，用含有对氨基基团具有淬灭作用的封闭液洗涤复合物三次；然后将复合物分散在封闭液中并在4°C下混合过夜；最后，用保存液洗涤复合物三次，最终将复合物分散在该保存液中。在本发明的较佳实施方式中，步骤一中，反应物的用量优选为聚丙烯酸球刷I 2mg/mL, EDC 25mg/mL, NHS 25mg/mL ;步骤二中，可根据球刷羧基的含量加入不同浓度的蛋白以获得球刷的饱和蛋白结合量，在达到蛋白饱和结合量之前，加入的蛋白均能以共价键结合的方式固定到球刷表面。优选地以每100个羧基结合2个蛋白为基准投料量，以该基准反应比附近来估算饱和结合量。在本发明的具体实施方式
中，所述缓冲液是指但不限于10mM的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液，该缓冲液的pH为7. 2 7. 6，含有或不含有O. 05wt. %的吐温 -20。所述封闭液是指但不限于含有O. lwt. % BSA(牛血清白蛋白)、0· 2wt. % BSA或
O.5wt. %甘氨酸的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液，该封闭液的pH为7. 2 7. 6。所述保存液是指但不限于含有O. lwt. % BSA和O. 05wt. %吐温-20的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲溶液，该保存液的pH为7. 2 7. 6。本发明采用新型的合成方法合成了聚丙烯酸球刷。与传统合成路线相比，该合成路线大大缩短了合成的步骤与时间，提高了反应效率，并且使得所得到的聚丙烯酸球刷具有较高的接枝密度和羧基含量，为蛋白固定化提供了更多的位点。当将采用本发明方法制备得到的聚丙烯酸球刷用于蛋白的固定化应用时，可实现大幅度提高蛋白固定化能力。经检测采用本发明合成的聚丙烯酸球刷对链霉亲和素蛋白(SA)的结合量高达1950 μ g/mg球刷，与已有文献报道的非球刷结构的聚丙烯酸改性氧化硅微球对SA的固定化能力相比，其对SA蛋白的固定化能力提高了 45倍。以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
图I是本发明的实施例2的RAFT链转移试剂修饰的氧化硅微球的紫外-可见分光光度光谱图。
具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。在实施例中，所采用的试剂除另有说明外均为市售商品。其中，微球为采用《胶体与界面科学杂志》1968年第26期62-69页报道的方法制备得到的单分散氧化硅微球。实施例I合成硅烷化RAFT链转移试剂
权利要求
1.一种聚丙烯酸球刷的活性聚合制备方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一、合成硅烷化RAFT链转移试剂；步骤二、将所述硅烷化RAFT链转移试剂通过一步反应接枝固定到球形固相载体表面； 步骤三、通过RAFT聚合方法在所述接枝有RAFT链转移试剂的载体表面形成聚丙烯酸 毛刷结构，最终得到聚丙烯酸球刷；其中，所述球形固相载体为表面带有羟基基团的微球；所述硅烷化RAFT链转移试剂的分子结构如下
2.如权利要求1所述的制备方法，其中，步骤一的具体过程如下将R-SH与无机碱溶于有机溶剂中，于10-60°C下反应10-60分钟；然后将二硫化碳逐 滴加入该体系中，加完于10-60°C下继续反应10-60分钟；再向体系中加入对氯4-苯基三 甲氧基硅烷，于10-60°C下继续反应2-24小时；浓缩有机相，加入非极性有机溶剂，过滤，将 得到的液体浓缩后通过柱层析纯化，得到硅烷化RAFT链转移试剂；其中，所述无机碱与R-SH的摩尔比为1 : 1-4 ;R-SH与二硫化碳的摩尔比为1 : 1-4; R-SH与对氯4-苯基三甲氧基硅烷的摩尔比为1 : 1-4。
3.如权利要求2所述的制备方法，其中，所述无机碱为氢氧化钠、碳酸钠、磷酸钾或氢 氧化钾；所述有机溶剂为四氢呋喃、乙醇、甲苯、二氯甲烷或丙酮；所述非极性有机溶剂为 二氯甲烷、丙酮或甲苯。
4.如权利要求2或3所述的制备方法，其中，所述浓缩液进行柱层析时淋洗剂为乙酸乙 酯-石油醚、乙酸乙酯-正己烷、或二氯甲烷-石油醚体系，淋洗剂的配比为1 : 1-100。
5.如权利要求1所述的制备方法，其中，步骤二的具体过程如下将所述球形固相载体与硅烷化RAFT链转移试剂分散在乙醇中，加热回流24小时，产物 经乙醇洗涤后分散在乙醇中，得到表面由硅烷化RAFT链转移试剂修饰的球形固相载体。
6.如权利要求1所述的制备方法，其中，步骤三的具体过程如下将表面由硅烷化RAFT链转移试剂修饰的球形固相载体分散在N，N- 二甲基甲酰胺中， 加入丙烯酸、自由的RAFT链转移试剂、偶氮二异丁腈，在70°C反应3小时，产物经乙醇洗漆 后分散在乙醇中，得到聚丙烯酸球刷；其中，所述自由的 RAFT 链转移试剂为 C6H5CH2SCS2C2H5、C6H5CH2SCS2C3H7、C6H5CH2SCS2C4H9、c6h5ch2scs2c12h25 或 c6h5ch2scs2ch2c6h5。
7.如权利要求1-6任一项所述的方法制备得到的聚丙烯酸球刷。
8.如权利要求7所述的聚丙烯酸球刷在蛋白高密度固定化中的应用。
9.一种如权利要求7所述的聚丙烯酸球刷在蛋白高密度固定化中的应用方法，其特征 在于，包括如下步骤步骤一，对聚丙烯酸球刷进行活化；步骤二，将蛋白固定在活化后的聚丙烯酸球刷上；步骤三，对步骤二形成的球刷与蛋白的复合物进行洗涤、封闭与保存。
10.如权利要求9所述的应用方法，其特征在于，具体应用过程如下步骤一，对聚丙烯酸球刷分散在缓冲液中，加入EDC和NHS，室温下混合后得到活化后的聚丙烯酸球刷，用所述缓冲液洗涤三次；步骤二，将所述活化后的聚丙烯酸球刷与蛋白在所述缓冲液中混合，并在37°C下反应2小时，得到球刷与蛋白的复合物；步骤三，用封闭液洗涤所述复合物；将复合物分散在所述封闭液中并在4°C下混合过夜；然后用保存液洗涤复合物，最终将复合物分散在所述保存液中；其中，所述缓冲液为IOmM的含有或不含有O. 05wt. %的吐温-20的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液，所述缓冲液的pH为7. 2 7. 6 ;所述封闭液为含有O. lwt. % BSA、0. 2wt. % BSA或O. 5wt. %甘氨酸的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲液；所述保存液为含有O. lwt. % BSA和O. 05wt. %吐温-20的磷酸二氢钠/磷酸氢二钠缓冲溶液。
全文摘要
本发明公开了一种聚丙烯酸球刷的活性聚合制备方法及其应用，尤其公开了一种通过活性聚合法制备聚丙烯酸球刷及其在蛋白高密度固定化中的应用。本发明首先合成一种新的硅烷化RAFT聚合链转移试剂，将该RAFT链转移试剂通过一步反应固定到球形固相载体表面后，再通过RAFT聚合法在接枝有该RAFT链转移试剂的载体表面形成聚丙烯酸毛刷结构，得到聚丙烯酸球刷。本发明的聚丙烯酸球刷材料经过活化后，进行蛋白固定得到球刷与蛋白的复合物，从而实现了在蛋白高密度固定化中的应用。本发明的方法大大缩短了聚丙烯酸球刷的合成步骤与时间，提高了反应效率；并使得聚丙烯酸球刷具有较高的接枝密度和羧基含量，为蛋白固定化提供了更多的位点。
文档编号C07K17/08GK102936321SQ201210438840
公开日2013年2月20日 申请日期2012年11月6日 优先权日2012年11月6日
发明者徐宏, 古宏晨, 瞿振元, 胡凤麟 申请人:上海交通大学