专利名称：双峰驼肌球蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，是一种双峰驼肌球蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法。
背景技术：
肌球蛋白(myosin)肌原纤维粗丝的组成单位。存在于平滑肌中。在肌肉运动中起重要作用。其分子形状如豆芽状，由两条重链和多条轻链构成。两条重链的大部分相互螺旋形地缠绕为杆状，构成豆芽状的杆，重链的剩余部分与轻链一起，构成豆芽的瓣。被激活后，具有活性的、能分解ATP的ATP酶。其分子量约为51万。在粗丝中，都是分子的头朝向粗丝的两端，呈纵向线性缔合排列。肌球蛋白是由森特 吉奥尔吉(A Szent 一 Gyrgyi, 1942)分离出来的,但是相当于现在所说的肌动球蛋白物质是库恩(W. Khne，1859)最初从蛙抽提出来的，并被命名为肌球蛋白。肌球蛋白的ATP酶活性是由苏联的V. A. Engelhardt夫妇(1939)发现的。肌球蛋白作为细胞骨架的分子马达，是一种多功能蛋白质，其主要功能是为肌肉收缩提供力。纤丝滑动学说(sliding filament theory)认为肌肉收缩是由于肌动蛋白细丝与肌球蛋白丝相互滑动的结果。在肌肉收缩过程中，粗丝和细丝本身的长度都不发生改变，当纤丝滑动时，肌球蛋白的头部与肌动蛋白的分子发生接触、转动，最后脱离的连续过程，其结果使细丝进行相对的滑动。1986年Spudic h实验室首次建立体外模拟滑动体系，测试肌球蛋白与肌动蛋白相互滑动产生的力。在1994年F iner等人成功地用双光钳进行单分子运动测试，这样就可以在单分子水平上进行肌丝滑动研究以及测试其产生力量的大小，从而对肌球蛋白进行了更深入的研究。2005年，E1-Mounayri等比较了不善运动的人、经常参加运动的人和优秀的越野滑雪选手股外肌单根肌纤维MHC组成，研究发现，与经常参加运动和优秀的越野选手相比，不善运动人的肌纤维以I型和II a型MHC为主，另外还含有比例相对较高的(约20%) II b型MHC和II a/ II b共存型MHC ;经常参加运动的人股外肌含有I型MHC的纤维明显增加，含有II b以及II a/ II b共存型MHC的纤维明显减少。
有“沙漠之舟”之称的骆驼由于沙漠地面极为松软，限制了骆驼的狂奔疾驰，而沙漠食物的匮乏以及水源的奇缺，又使骆驼不得不具有较快的行走速度和持久的耐力。长期自然选择的结果，使骆驼的体形结构又比其他动物特殊，其颈部较长，呈“乙”字形，有利于保持身体平衡；体躯较短，前腿长，支持面小而重心高，便于躯体的前移和迈出较大的步伐；后肢短而呈刀状，具有较强的推动力和耐久力。由于骆驼同其他动物相比有持久的耐力，可以适应沙漠中食物的匮乏及水源的奇缺，肌球蛋白是肌肉运动中非常重要的一种蛋白，所以研究骆驼的肌球蛋白有非常重要的意义
发明内容
本发明提供了一种双峰驼肌球蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法，肌球蛋白作为细胞骨架的分子马达，是一种多功能蛋白质，其主要功能是为肌肉收缩提供力，通过利用该双峰驼肌球蛋白的基因编码序列构建系统发生树，可以直观的表现出双峰驼肌球蛋白序列与其他物种肌球蛋白序列的差异，对研究双峰驼及其他物种以及人类的耐力运动提供一定的理论依据促进运动生理学的发展。本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的一种双峰驼肌球蛋白基因，该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列。下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进 上述基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中21-5939位的序列。本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的一种含有双峰驼肌球蛋白基因的重组蛋白。下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进
上述重组蛋白的氣基酸序列具有SEQ ID NO. 2所不的序列。上述重组蛋白为具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。上述重组蛋白通过设计一对引物从双峰驼肌球蛋白中得到双峰驼肌球蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下
反引物，SEQ ID NO. 4 (反向):5，- ATGGGCAAGC TGCTCCAGCA GC -3，，
正引物，SEQ ID NO. 3 (正向):5，- CTGGCTGCTG GAGCAGCTTG CC -3，。本发明的技术方案之三是通过以下措施来实现的一种双峰驼肌球蛋白基因的克隆方法，其特征在于按下述步骤进行
第一步，总RNA提取，采取双峰驼组织样品后，对组织样品进行组织总RNA提取；
第二步，引物设计及合成，引物对的核苷酸序列信息如下
正引物，SEQ ID NO. 3 (正向)5’ - ATGGGCAAGC TGCTCCAGCA GC -3’，
反引物，SEQ ID NO. 4 (反向):5，- CTGGCTGCTG GAGCAGCTTG CC -3，；
第三步，RT-PCR扩增，利用反转录试剂盒对组织样品中的蛋白基因进行反转录，并对待扩增的DNA片段进行RT-PCR扩增；
第四步，蛋白基因的克隆，首先对PCR扩增的DNA片段进行回收，然后将回收的DNA片段同T载体连接形成感受态细胞，将感受态细胞进行转化培养成单菌落，取少量该单菌落进行PCR扩增，对扩增后的单菌落鉴别T载体上是否含有目的DNA片段，若有目的DNA片段，将单菌落放入培养基中进行过夜培养，最后对质粒进行回收。本发明双峰驼肌球蛋白基因是一种在肌肉运动中起重要作用的蛋白的基因，与骆驼能适应沙漠中食物的匮乏以及水源的奇缺，有较快的行走速度和持久的耐力有很大关系，是非常重要的一种蛋白质，同时，本发明研究双峰驼的肌球蛋白序列及进化树可以直观的表现出双峰驼肌球蛋白序列与其他物种此蛋白序列的差异，为以后研究双峰驼及其他物种中的耐力研究提供实验数据，对研究双峰驼及其他物种以及人类的耐力运动提供一定的理论依据促进运动生理学的发展。因此本发明具有很大的应用价值。
图1.双峰驼肌球蛋白基因RT-PCR产物电泳图
图2.构建系统发生树所用肌球蛋白氨基酸同源性比较 图3.不同物种肌球蛋白氨基酸序列系统进化树
具体实施例方式本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述
实施例1，一种双峰骑肌球蛋白基因，该基因的核昔酸序列具有SEQ ID NO.1所不的序 列。该序列是肌原纤维粗丝的组成单位，存在于平滑肌中，在肌肉运动中起重要作用的蛋白的基因，本发明中的双峰驼肌球蛋白基因的核苷酸序列是通过以双峰驼肝脏组织中总RNA为模板，参考人、鼠、牛等物种的肌球蛋白基因的同源序列设计引物，进行反转录PCR而获得的基因核苷酸序列SEQ ID NO.1。可根据实际需要，对上述双峰驼肌球蛋白基因作进一步优化或/和改进
双峰驼肌球蛋白基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1中21-5939位所示的序列。在SEQ ID NO.1中，RT-PCR产物长度为5953bp，电泳结果见附图1，其中21-23位为起始密码子ATG，5937-5939位为终止密码子TGA，21-5939位为编码蛋白质区域(CDS)。实施例2，一种双峰驼肌球蛋白基因的重组蛋白。可根据实际需要，对上述双峰驼肌球蛋白基因的重组蛋白作进一步优化或/和改进:
重组蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID N0:2所示的序列。将双峰驼肌球蛋白基因核苷酸序列中的编码序列(CDS)按通用密码子翻译成的重组蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO. 2。重组蛋白为具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。通过设计一对引物从双峰驼肌球蛋白中得到双峰驼肌球蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下
反引物，SEQ ID NO. 4 (反向):5，- ATGGGCAAGC TGCTCCAGCA GC -3，，
正引物，SEQ ID NO. 3 (正向):5，- CTGGCTGCTG GAGCAGCTTG CC -3，。实施例3，一种双峰驼肌球蛋白基因的克隆方法，按下述步骤进行
第一步，总RNA提取
1.组织分离(Isolation)
从内蒙古阿拉善盟采得双峰驼，快速屠宰并取肝脏样，将组织样迅速放入液氮中冷冻后于一 70°C保存，拿回实验室准备提取组织总RNA ；
2.总RNA 的分离(Total RNA isolation)
(I)提取RNA的准备工作
玻璃制品用0.1M的NaOH浸泡过夜，用自来水反复冲洗，再用蒸馏水冲洗2遍，180°C烘烤4小时。匀浆器、电泳槽用3%的双氧水浸泡20-30分钟，再用0. 1%的DEPC水冲洗，由于未灭活的DEPC对PCR反应有影响，可用0. 5%的SDS处理。
Tip头、EP管用0. 1%的DEPC水浸泡过夜，高压灭菌使DEPC失活。双蒸水和溶液用DEPC处理，即每IOOml水或溶液加0.1mlDEPC液，室温放置过夜，高压灭菌30分钟DEPC失活。(2 )组织总RNA提取
取IOOmg在液氮中冻存的组织样放入有Iml Trizol (trizal reagent, invitrogenBRL, USA)的匀浆器管中匀浆。4°C 12000g离心10分钟，吸取上清液，15_30°C温育5分钟，加0. 2ml氯仿，盖上盖子，用手剧烈震荡15秒，15-30°C温育2_3分钟，4°C 12000g离心15分钟。吸取上清液，加0. 8ml异丙醇，混合均匀。15-30°C温育10分钟，4°C 12000g离心10分钟，离心管底部白色沉淀即为RNA。倒掉上清，加Iml 75%乙醇洗涤RNA，4°C 7500g离心10分钟，自然干燥或真空干燥RNA。溶于水(RNase free)中分装，_70°C保存。
(3)组织总RNA的鉴定
通过分光光度计上测定RNA含量并且用琼脂糖电泳分析RNA的质量，具体方法如下电泳槽用RNA清洗液(IOOmM NaOH, ImM EDTA)浸泡4 一 5小时，再用DEPC处理过的水反复冲洗数次后倒入IXTBE待用，琼脂糖凝胶用IXTBE配制。在IOul上样缓冲液(2XTBE，13%菲可，0. 1%溴酚兰，7M尿素)中加入Iul以上组织总RNA，65°C变性10分钟后立即放入冰水中2 — 3分钟，点样于琼脂糖凝胶中电泳。 第二步，引物设计及合成
根据 GenBanK 发表的人(Accession No: CAD91136.1)、鼠(Accession No:EDL10431.1)、牛(Accession No: NP_001179691.1)等物种的溶菌酶基因 mRNA 序歹lj ORF 侧翼同源序列，设计如下引物用于以双峰驼溶菌酶cDNA为模版的PCR扩增，以获得双峰驼溶菌酶基因cDNA序列。引物用Primer Premier 5. 0自行设计，由上海桑尼生物科技有限公司合成，该引物对的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:3 (正向)和SEQ ID NO:4 (反向)，序列信息如下
SEQ ID NO. 3 (正向)5，- ATGGGCAAGCTGCTCCAGCAGC -3，
SEQ ID NO. 4 (反向)5，- CTGGCTGCTGGAGCAGCTTGCC -3，
第三步，RT-PCR扩增
按大连宝生物反转录试剂盒(BcaBEST RNA PCR Kit Ver.1.1)要求进行反转录。反转录反应液组成IOul 2XBca 1st Buffer, 4ul 25Mm MgS04, Iul dNTP Mixture, 0. 5ulRnase Inhibitor (40U/ul),Iul BcaBEST Polymerase(22U/ul),Iul Oligo dT Primer,Iul RNA Sample,1. 5ul Rnase Free dH20,总体系为 20 ul。反转录反应条件65°C I 分钟，30°C 5分钟(15分钟-30分钟内匀速升温)，65°C 25分钟，98°C 5分钟，5°C 5分钟。PCR扩增条件97°C变性5分钟；95°C 30秒一55°C 30秒一72°C I分钟，如此进行30次循环；72°C延伸10分钟，4°C保存。第四步，蛋白基因的克隆1、PCR扩增片段的回收片段回收按上海华舜小量胶回收试剂盒说明进行，操作过程如下尽可能小的割下含DNA的琼脂糖块，放入1.5mlEP管中。按每IOOmg琼脂糖加入300ulSl液的比例加SI液，50°C水浴10分钟。将溶化的琼脂糖液移入吸附柱，IOOOOg离心I分钟，倒掉管中液体。在吸附柱中加入500ul Wl液，IOOOOg离心15秒。倒掉管中液体，在吸附柱中加入500ul Wl液，静置I分钟后，IOOOOg离心15秒，倒掉管中液体。离心I分钟，将吸附柱放入一个干净的1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入30ulTl液，静置I分钟后，IOOOOg离心I分钟，EP管中液体即为回收的DNA。2、回收片段同T载体的连接连接用TaKaRa pMD18_T Vector试剂盒，操作过程如下在 EP 管中制备下列连接反应液pMD 18-T Vector (50ng/ul) 0. 5ul, DNA 20_40ng，Solution I 5ul，加dH20至10ul。将上述反应液在16°C反应30分钟(过夜也可以)，产物用于转化感受态细胞。3、质粒的转化从一70°C冰箱中取出保存的感受态细胞，冰浴助溶。IOOul感受态细胞加入IOul连接产物，冰浴30分钟。42°C水浴热应激90秒钟，立即置入冰浴中2分钟。加400ul液体LB培养基，37°C复活50分钟。取IOOul铺于LB平板上，平板含0. 1%(V/V)的氨节青霉Amp (100mg/ml)，37°C恒温培养10-15小时。4、转化菌落的PCR鉴定与培养用记号笔标记转化培养的单菌落，用灭菌的牙签蘸取单菌落。将牙签头放入在加有PCR反应液(不含模板)的EP管中晃动，使单菌落充当模 板。用获得该片段的PCR条件进行扩增，PCR产物同Marker —起进行琼脂糖凝胶电泳，鉴别T载体上是否含有目的片段，若得到目的片段，可用灭菌枪头挑取在平板上的与之对应的单菌落，放入40 ml LB液体培养基中，先在液体中加入0. 1%(V/V)的青霉素钠(100mg/ml)，37°C过夜摇菌培养，用于质粒回收。5、质粒的回收质粒回收用上海华舜小量质粒抽提纯化试剂盒，操作步骤如下将转化培养的菌液加入1. 5mlEP管中，4000转/分钟离心，倒掉液体获细菌沉淀。细菌沉淀不够时可再加一次菌液离心。在细菌沉淀中加入250ulPl液，振荡悬浮。加入250ulP2液，温和摇匀，室温静置4分钟。加入350ulP3液，温和摇匀。离心10分钟，将上清液小心移入吸附柱，离心15秒，倒掉液体。在吸附柱中加入500ulWl，离心15秒，倒掉液体。在吸附柱中加入500ulWl，静置I分钟，离心15秒，倒掉液体。离心I分钟，将吸附柱放入一个干净的1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入25-30ulTl液，静置I分钟后，离心I分钟，EP管中液体即为回收的质粒。6、质粒的酶切鉴定为了证明回收质粒确为插入目的片段的重组质粒，采用双酶切法鉴定。本研究具体操作如下根据TaKaRa pMD18_T Vector图，选择内切酶Bam H I和Hin d III,保证目的片段中无这两种酶的切点。组成如下酶切反应体系Bam H I lul, Hind III Iul，10XK Buffer 2ul，DNA 彡 lul，加 dH20 至 20ul。30°C反应 3 小时，琼脂糖凝胶电泳检测。实施例4，重组质粒的测序取20ul重组质粒于EP管中，封口膜密封，交生物技术公司测序。实施例5，双峰驼肌球蛋白基因序列信息与生物信息学分析和系统发生树构建1、双峰驼肌球蛋白的序列信息与生物信息学分析
本发明新的双峰驼嗅觉感受器⑶S的长度为5953 bp，详细序列见SEQ ID NO:1。根据全长CDS推导出双峰驼嗅觉感受器的氨基酸序列，共1972个氨基酸残基，详见SEQ IDNO:2,在线预测(http://www. expasy. ch/tools/pi_tool. html)结果显示，其分子量为227223. 04道尔顿，等电点(pi)为5. 63。2、肌球蛋白基因编码序列系统发生树构建
在GenBank上搜索并获得人、鼠等八种物种的八条肌球蛋白基因的编码蛋白序列，加上本发明获得的SEQ ID NO. 2序列，利用分子生物学软件MEGA4构建了系统发生树(见附图 3)。结果显示双峰驼肌球蛋白基因同牛、人的亲缘关系最近。与大熊猫的亲缘关系最远。
双峰驼的肌球蛋白核苷酸序列与其他物种的肌球蛋白氨基酸序列相似性评价在SEQ ID NO. 1，双峰驼肌球蛋白基因编码1972个氨基酸。双峰驼和人、鼠、牛等动物用Clustal X中对齐的肌球蛋白基因编码氨基酸序列同源性比较结果见附图2。其氨基酸序列与人、鼠、牛等物种肌球蛋白氨基酸序列相似性见表一。
序列表<110>新疆旺源驼奶实业有限公司〈120〉双峰驼肌球蛋白的蛋白编码序列〈160〉 4〈210〉 I〈211〉 5953〈212〉 DNA〈213〉阿拉善盟双峰驼 〈400〉 IIgaccgaccaa gaccatcact atgagttcag accaggaaat ggctgtcttt ggggaggctg60ctccttacct ccgaaagtct gaaaaggagc gcatcgaggc ccagaatagg ccctttgatg120ccaagacatc agtctttgtg gctgagccca aggaatcctt tgtcaaaggg acgatccaga180gcagagaagg agggaaagtg acggtgaaga ccgaaggagg agcgactctg acagtgaaag240atgaccaagt ctaccccatg aaccctccca aatttgacaa gatcgaggac atggccatga300tgacccacct gcacgagcca ggagtgctgt acaacctcaa agagcgttac gcagcctgga360tgatctacac ctactcgggc ctgttctgcg tcaccgtcaa cccctacaag tggctgccgg420tgtacaaccc cgaggtggtg acggcctaca gaggcaaaaa gcgccaggag gccccgcccc480acatcttctc catctctgac aatgcctatc agt·tcatgct gactgaccga gagaatcagt540caatcctgat caccggagaa tccggggctg ggaagacggt gaacacgaag cgtgtcatcc600agtactttgc aacaattgca gttactgggg agaagaagaa ggaggaatct ggcaaaatgc660aggggactct ggaagatcag atcatcagtg ccaaccccct actggaggcc tttggcaacg720ccaagaccgt gaggaatgac aactcctctc gctttggtaa attcatcaga atccactttg780gcactacagg aaaactggct tctgctgata ttgaaacata tctgctggag aagtctagag840ttactttcca gcttaaagct gaaaggagct atcatatttt ttaccagatc acatcaaaca900ggaagccaga actaattgaa atgcttctga ttaccaccaa cccatatgat tacccattcg960tcagtcaagg ggagatcagt gtgcccagca ttgatgatca ggaagaactg atagcgacag1020atagtgccat tgatattttg ggctttacta atgaagagaa ggtctccatc tacaagctca1080cgggggctgt gatgcactat ggaaacttga agttcaagca aaagcaacgt gaggagcaag1140cagagccaga tggcactgaa gttgctgaca aggcagccta cctccagagt ctgaactctg1200ctgacctgct caaagccctc tgctttccca gggtcaaggt cggcaacgaa ttcgtcacca1260aaggccagac tgtagagcag gtgaccaatg cggtgggtgc tctggccaga gctgtctacg1320agaagatgtt cctgtggatg gtcacccgca tcaaccagca gctggacacc aagcagcccc1380ggcagtactt catcggggtc ttggacatcg ctggctttga gatctttgat ttcaacagcc1440
权利要求
1.一种双峰驼肌球蛋白基因，其特征在于该基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO.1所示的序列。
2.根据权利要求1所述的双峰驼肌球蛋白基因，其特征在于该基因的核苷酸序列具有 SEQ ID NO.1 中 21-5939 位的序列。
3.一种含有权利要求1或2所述的双峰驼肌球蛋白基因的重组蛋白。
4.根据权利要求3所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白的氨基酸序列具有SEQID NO. 2所示的序列。
5.根据权利要求3或4所述的重组蛋白，其特征在于该重组蛋白为具有SEQID NO. 2 所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
6.根据权利要求3或4所述的重组蛋白，其特征在于通过设计一对引物从双峰驼肌球蛋白中得到双峰驼肌球蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 (正向)5’ - ATGGGCAAGC TGCTCCAGCA GC -3’，反引物，SEQ ID NO. 4 (反向):5，- CTGGCTGCTG GAGCAGCTTG CC -3，。
7.根据权利要求5所述的重组蛋白，其特征在于通过设计一对引物从双峰驼肌球蛋白中得到双峰驼肌球蛋白基因，该引物对的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 (正向):5，- ATGGGCAAGC TGCTCCAGCA GC -3，，反引物，SEQ ID NO. 4 (反向):5，- CTGGCTGCTG GAGCAGCTTG CC -3，。
8.一种根据权利要求1或2所述的双峰驼肌球蛋白基因的克隆方法，其特征在于按下述步骤进行第一步，总RNA提取，采取双峰驼组织样品后，对组织样品进行组织总RNA提取； 第二步，引物设计及合成，引物对的核苷酸序列信息如下正引物，SEQ ID NO. 3 (正向)5’ - ATGGGCAAGC TGCTCCAGCA GC -3’，反引物，SEQ ID NO. 4 (反向):5，- CTGGCTGCTG GAGCAGCTTG CC -3，；第三步，RT-PCR扩增，利用反转录试剂盒对组织样品中的蛋白基因进行反转录，并对待扩增的DNA片段进行RT-PCR扩增；第四步，蛋白基因的克隆，首先对PCR扩增的DNA片段进行回收，然后将回收的DNA片段同T载体连接形成感受态细胞，将感受态细胞进行转化培养成单菌落，取少量该单菌落进行PCR扩增，对扩增后的单菌落鉴别T载体上是否含有目的DNA片段，若有目的DNA片段， 将单菌落放入培养基中进行过夜培养，最后对质粒进行回收。
全文摘要
本发明涉及基因工程技术领域，是一种双峰驼肌球蛋白基因、重组蛋白及其克隆方法，该双峰驼肌球蛋白基因，其特征在于该基因的核苷酸序列具有SEQIDNO.1所示的序列，该肌球蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:2。对包括SEQIDNO.1在内的九个物种的九条肌球蛋白基因的氨基酸序列构建了系统发生树，结果发现双峰驼与牛、人的肌球蛋白亲缘关系最近，与大熊猫的亲缘关系最远。同时，本发明研究双峰驼的肌球蛋白序列及进化树可以直观的表现出双峰驼肌球蛋白序列与其他物种此蛋白序列的差异，对研究双峰驼及其他物种以及人类的耐力运动提供一定的理论依据促进运动生理学的发展。
文档编号C07K14/47GK103014001SQ201210478250
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月22日 优先权日2012年11月22日
发明者陈钢粮 申请人:新疆旺源驼奶实业有限公司