专利名称：一种艾塞那肽固相合成方法
技术领域：
本发明涉及多肽药 物合成技术领域，具体涉及一种艾塞那肽固相合成方法。
背景技术：
糖尿病(diabetes mellitus)是由于胰岛素绝对或相对不足引起的以高血糖和多并发症并存为特征的内分泌代谢性常见病、多发病，据世界卫生组织(WHO)最新公布数据显示，2007年全球糖尿病患者人数已达I. 8亿，且发病率仍逐年增加，预测到2025年，全球糖尿病患者人数将达3亿，成为继心脑血管和癌症之后的人类第三大杀手。糖尿病主要分为I型(膜岛素依赖型，insulin dependent diabetes, IDDM)和II型(非胰岛素依赖型糖尿病，non-insulin dependent diabetes, NIDDM),其中II型糖尿病患者占90%以上。II型糖尿病患者多存在胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足两方面异常，在发病的中晚期往往出现胰岛β细胞凋亡。目前临床使用的口服降糖药的作用机理多为增强胰岛素敏感性或促进胰岛素分泌以稳定血糖，均无法解决β细胞凋亡这一难题。然而，胰高血糖素样肽-I (Glucagon-like peptide 1，GLP-1)及其类似物药物的应用使得II型糖尿病的治疗获得突破性进展，有望为糖尿病治疗提供全新的选择方案。但由于GLP-I易被二肽酶(dipeptidyl pepidiase IV, DPP IV)迅速降解,在体内半衰期只有2分钟左右,故外源GLP-I难以获得临床使用。Exendin-4是一种从美洲希拉巨蜥(Heloderma suspectum)唾液中分离得到的含有39个氨基酸的天然多肽激素，与GLP-I有53%的序列同源性，不但具有类GLP-I促胰岛素分泌的功能，而且其体内稳定性也远高于GLP-1。根据Exendin-4的这一特点，美国Amylin公司和Eli Lilly公司联合开发了化学合成的药物Exendin_4(又称Exenatide,式I化合物，中文名艾塞那肽，商品名Byetta)。Byetta是世界上首个肠促胰岛素类似物药物，于2005年4月经美国FDA批准上市。研究表明，艾塞那肽不仅能很好地控制血糖，还可促进胰岛细胞的新生和增殖，减少β细胞凋亡，改善β细胞功能，具有非常明显的临床应用优势。此外，临床研究中发现艾塞那肽还能够减慢胃肠排空的速度，使人没有饥饿感而减少摄入食物，从而使人的体重下降。其结构式如下151015H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-20253035Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-PTo-Pro-Ser-NH2艾塞那肽的制备方法主要有生物合成法与化学合成法。生物合成法利用人工基因重组方式得到Exenatide全序列(如专利CN101501209A)。化学合成法通常可采用常规的全固相合成(如专利W02008109079A2、CN101357938A、CN101538324A)技术。全固相合成操作简单，对于一些片段较短的肽链是一个快捷高效的方法。然而，随着肽链的延长，其中疏水性强的肽段形成β-折叠的可能性很大，固相合成方法往往导致出现困难序列。此外，固相肽合成中还存在肽链与树脂载体之间的分子集聚(aggregation)现象,这都会造成偶联和脱保护效率大大降低。在艾塞那肽的固相合成中，主要的挑战有两处。一处是肽链中部从第26到第19个氨基酸的序列中存在多个疏水性氨基 酸，形成第一个“困难序列”区，固相合成实践表明，第26位的Leu、第23位的He、第21位的Leu及第19位的Val缩合都非常困难，即便使用了改善的反应条件，如变换缩合反应体系、延长反应时间、多次重复缩合等，结果亦收效甚微。第二个“困难序列”区涉及到三个连续的谷氨酸残基。在固相合成中，重复的谷氨酸序列在带上侧链保护基后，疏水性大大增加，导致在树脂上产生扭曲的部分，这使得难以在该重复的谷氨酸序列上继续偶联其他氨基酸以延长肽链。在化学合成法中，W02009053315A1公开了一种采用固相和液相结合合成艾塞那肽的方法。固液结合的方法因为缩短了片段的长度，因此单个片段在固相上的合成较为容易，且纯度较高，有利于最终产物的纯化。然而，在液相中进行片段缩合时容易出现片段溶解困难、C-端消旋化以及二级结构导致的缩合困难等问题。另外，每个片段的合成必须使用相对较贵的全保护肽树脂，大大增加了成本。鉴于艾塞那肽重要的药学应用价值，有必要提供更有效的艾塞那肽合成方案，能够克服以上方法的缺陷并适合工业规模的生产。
发明内容
发明目的本发明的目的是提供一种成本低、适于工业化生产的艾塞那肽的合成方法。技术方案本发明提供了一种艾塞那肽固相合成方法，其特征在于包括以下步骤(I)用固相合成方法由Fmoc-Ser (tBu)-OH和取代度为O. 3-1. 2mmol/g的氨基树脂为起始原料，反应制得Fmoc-Ser (tBu)-氨基树脂；(2) Fmoc-Ser (tBu)-氨基树脂在Fmoc脱保护试剂作用下脱去Fmoc后,在偶联体系作用下于偶联溶剂中依肽序依次连接Fmoc氨基酸以及至少一个氨基保护的Fmoc氨基酸或酰胺N上临时取代的二肽，并在Fmoc脱保护试剂作用下依次脱去Fmoc，制得侧链全保护的艾塞那妝氣基树脂；(3)对侧链全保护的艾塞那肽氨基树脂在裂解体系作用下裂解脱除侧链保护基，冰乙醚沉淀，即得艾塞那肽。其中，步骤(I)中，所述氨基树脂为Rink Amide树脂、Rink Amide-AM树脂、RinkAmide-MBHA树脂或Sieber Amide树脂；氨基树脂和Fmoc-Ser (tBu) -OH的质量摩尔比为Ig : (O. 5-5) mmol ;反应时间O. 5_2h，反应温度为10_40°C。其中，步骤(2)中，所述氨基保护的Fmoc氨基酸为2_羟基_4_甲氧基苄基(Hmb)、2，4- 二甲氧基苄基(Dmb)或2，4，6-三甲氧基苄基(Tmb)保护的氨基酸，所述酰胺N上临时取代的二肽为伪脯氨酸或酰胺N上临时取代基为2-羟基-4-甲氧基苄基、2，4- 二甲氧基苄基、2，4，6-三甲氧基苄基保护的二肽；其中，Hmb的结构式为权利要求
1.一种艾塞那肽固相合成方法，其特征在于包括以下步骤 (1)用固相合成方法由Fmoc-Ser(tBu)-OH和取代度为O. 3-1. 2mmol/g的氨基树脂为起始原料，反应制得Fmoc-Ser (tBu)-氨基树脂； (2)Fmoc-Ser (tBu) -氨基树脂在Fmoc脱保护试剂作用下脱去Fmoc后，在偶联体系作用下于偶联溶剂中依肽序依次连接Fmoc氨基酸以及至少一个氨基保护的Fmoc氨基酸或酰胺N上临时取代的二肽，并在Fmoc脱保护试剂作用下依次脱去Fmoc，制得侧链全保护的艾塞那妝氣基树脂； (3)对侧链全保护的艾塞那肽氨基树脂在裂解体系作用下裂解脱除侧链保护基，冰乙醚沉淀，即得。
2.根据权利要求I所述的一种艾塞那肽固相合成方法，其特征在于步骤(I)中，所述氨基树脂为 Rink Amide 树脂、Rink Amide-AM树脂、Rink Amide-MBHA树脂或 Sieber Amide树脂。
3.根据权利要求I所述的一种艾塞那肽固相合成方法，其特征在于步骤(2)中，所述氨基保护的Fmoc氨基酸为2-羟基-4-甲氧基苄基、2，4- 二甲氧基苄基或2，4，6-三甲氧基苄基保护的氨基酸，所述酰胺N上临时取代的二肽为伪脯氨酸或酰胺N上临时取代基为2-轻基-4-甲氧基节基、2，4- 二甲氧基节基、2，4, 6- 二甲氧基节基保护的二妝；其中， 2-羟基-4-甲氧基苄基的结构式为
4.根据权利要求3所述的一种艾塞那肽固相合成方法，其特征在于所述伪脯氨酸包括 Fmoc-Gly-Thr (vMe’MePro)-0H、Fmoc-Phe-Thr (vMe’MePro)-0H、Fmoc-Thr (tBu) -Ser ( ΨΜ0>MePro) -OH、Fmoc-Leu-Ser (iyMe’MePro) -OH、Fmoc-Pro-Ser ( vMe’MePro) -OH 和 Fmoc-Ser (tBu) -Ser ( ￥Me,MePro) -OH。
5.根据权利要求3所述的一种艾塞那肽固相合成方法，其特征在于所述2-羟基-4-甲氧基苄基、2，4-二甲氧基苄基或2，4，6-三甲氧基苄基保护的氨基酸包括 Fmoc-(Hmb) Gly-OH、Fmoc-(Hmb) Leu-OH、Fmoc- (Hmb) Ala-OH ;Fmoc_ (Dmb) Gly-OH、Fmoc-(Dmb) Leu-OH、Fmoc-(Dmb) Ala-OH、Fmoc-(Tmb) Gly-OH、Fmoc- (Tmb) Leu-OH 和Fmoc-(Tmb)Ala-OH。
6.根据权利要求I所述的一种艾塞那肽固相合成方法，其特征在于步骤(2)中，偶联溶剂为DCM，DMF或NMP中的任意一个或一个以上的组合；偶联体系为HOBt、HOAt、HOOBt或Cl-HOBt中的任意一个或多个与DIC的组合，或为HOBt、HOAt, HOOBt或Cl-HOBt中的任意一个或多个与DPIEA或NMM中的任意一个或两个与HBTU、HATU、PyBOP或PyAOP中的任意一个或多个的组合。
7.根据权利要求I所述的一种艾塞那肽固相合成方法，其特征在于步骤(2)中，Fmoc脱保护试剂为哌啶，脱保护反应温度为10-50°C，反应时间为5-60min，Fmoc脱保护试剂与偶联溶剂的体积比为I: (3-5)。
8.根据权利要求I所述的一种艾塞那肽固相合成方法，其特征在于步骤(3)中，所述裂解体系包括三氟乙酸、1，2-乙二硫醇、水和三异丙基硅烷的混合溶液，其体积比为(90-95)(2-5)(2-5) :(1_5)。
9.根据权利要求I所述的一种艾塞那肽固相合成方法，其特征在于步骤(3)中，冰乙醚沉淀后，还包括纯化步骤，具体为将艾塞那肽溶于乙酸水溶液中，过滤，滤液经C18或CS柱梯度洗脱，流动相为水和乙腈，冻干，即得艾塞那肽。
全文摘要
本发明提供了一种艾塞那肽固相合成方法，包括以下步骤1)由Fmoc-Ser(tBu)-OH和取代度为0.3-1.2mmol/g的氨基树脂为起始原料，得到Fmoc-Ser(tBu)-氨基树脂；2)Fmoc-Ser(tBu)-氨基树脂脱去Fmoc保护基后，依肽序依次连接Fmoc氨基酸以及至少一个氨基保护的Fmoc氨基酸或酰胺N上临时取代的二肽，脱去Fmoc，制得侧链全保护的艾塞那肽氨基树脂；3)对树脂脱除侧链保护基，冰乙醚沉淀，即得艾塞那肽。该合成方法效率高、反应操作简单、后处理容易，适于工业化生产。
文档编号C07K1/04GK102942625SQ201210504949
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月30日 优先权日2012年11月30日
发明者苏贤斌, 钱依冰, 毛怡春, 叶青, 董海军 申请人:南京工业大学, 南京英沛生物技术有限公司