用bis-tris缓冲液的蛋白纯化的制作方法
【专利摘要】本发明提供用于小规模和大规模蛋白质纯化特别是单克隆抗体的两步色谱法，其仅使用由一种母液制得的四种缓冲溶液。
【专利说明】用BIS-TRIS缓冲液的蛋白纯化
【技术领域】
[0001]本发明涉及使用四种缓冲溶液的用于小规模和大规模蛋白质纯化，尤其是单克隆抗体的两步色谱过程。
[0002]发明背景
抗体纯化可能是生物生产最为昂贵的方面之一。单克隆抗体(mAbs)通常采用在各步骤使用特定缓冲体系的三步骤三树脂色谱方法来纯化。这种常规纯化方法包括捕获步骤，接着是离子交换步骤，并且结束于抛光步骤，并通常花费3至5个工作日(包括储存和开放阶段(open phase))。随着提高的细胞培养物效价和更大的细胞培养物体积用于生产，下游加工被视为行业瓶颈。这特别与单克隆抗体生产相关，在单克隆抗体生产中，关注点由批量体积转向下游加工能力。此外，早期的临床前期和临床阶段研究要求可以更快速制造的更大量抗体。因此，在行业中有需求减少用于抗体纯化的步骤数，并减少获得批量产品所花费的时间。
[0003]发明概述
发明人已经发现了用于纯化抗体的新方法，所述方法包括有限数量的步骤，同时仍能够以优异的纯度获得纯化抗体的高产率。纯化的蛋白质由此适于医疗应用。因此，该方法可用于纯化用于临床试验的蛋白质和/或用于包含该蛋白质的药物组合物的营销。
[0004]简而言之，这种方法仅包括两个色谱步骤:一个亲和色谱，和一个多峰树脂色谱(multimodal resin chromatography)。此外，已经发现,在这两个色谱步骤过程中使用的缓冲液可以由相同的母液起始制备。在其它方面，所有缓冲液可以由相同的化学物质组成，尽管各缓冲液中所述化学物质的浓度可以彼此不等。这些缓冲液有利地包含Bis Tris，例如与NaCl、乙酸和水组合。由于不需要任何缓冲液交换，该方法容易进行，并且高度适于自动化和/或用于以连续模式运行。此外，所有缓冲液可以由相同化学物质组成的事实能够极大减少制备色谱柱的时间，并减少了对人工干预的需要。本发明的方法进一步允许减少或取消开放阶段(即其中纯化系统开放以进行手工操作的步骤，如准备用于新缓冲液的色谱柱、稀释样品或调节其PH)，由此减少污染的风险。因此，本发明的方法能够快速生产批量产品并减少纯化系统的占用时间。由此适于放大试验和以工业规模纯化重组蛋白质。
[0005]已经建立了两种特定方案并对三种不同的抗体实施。在第一种方案中，在第一色谱步骤结束时使用Bis Tris溶液(参见实施例3、4和5)调节获得的粗蛋白质洗脱液的pH值。已经表明，该方案是通用的，只要其提供优异和可再现的结果，不考虑被纯化的特定抗体(参见实施例6)。在第二种方案中，在第一色谱步骤结束时获得的粗蛋白质洗脱液直接通过第二色谱柱，即没有经受任何处理如PH调节、缓冲液交换或稀释(参见实施例7)。在该方案中，两个色谱步骤后可接着流过膜吸附器。第二种方案具有极为快速(对100升原材料为大约7或8小时)的优点。此外，其可以完全自动化，以连续方式运行，并且不包含任何开放阶段。
[0006]本发明由此提供一种从溶液中纯化蛋白质的方法，该方法包括第一色谱步骤和第二色谱步骤，所述第一色谱步骤包括使平衡缓冲液流经第一色谱柱，使溶液流经第一色谱柱，使平衡缓冲液流经第一色谱柱，使清洗和卫生缓冲液流经第一色谱柱，使平衡缓冲液流经第一色谱柱，使用第一洗脱缓冲液从第一色谱柱中洗脱粗蛋白质洗脱液，和任选使用BisTris溶液调节该粗蛋白质洗脱液的pH值；所述第二色谱步骤包括使平衡缓冲液流经第二色谱柱，使粗蛋白质洗脱液流经第二色谱柱，使平衡缓冲液流经第二色谱柱，和使用第二洗脱缓冲液从第二色谱柱中回收纯化的蛋白质。
[0007]本发明还提供一种从溶液中纯化蛋白质的方法，该方法包括第一色谱步骤和第二色谱步骤，所述第一色谱步骤包括使平衡缓冲液流经第一色谱柱，使溶液流经第一色谱柱，使平衡缓冲液流经第一色谱柱，使用第一洗脱缓冲液从第一色谱柱中洗脱粗蛋白质洗脱液，和任选使用Bis Tris溶液调节该粗蛋白质洗脱液的pH值；所述第二色谱步骤包括使平衡缓冲液流经第二色谱柱，使该粗蛋白质洗脱液流经第二色谱柱，使平衡缓冲液流经第二色谱柱，使清洗和卫生缓冲液流经第二色谱柱，使平衡缓冲液流经第二色谱柱，和使用第二洗脱缓冲液从第二色谱柱中回收纯化蛋白质。
[0008]在本发明的一个实施方案中，该Bis Tris溶液是IM的Bis Tris溶液。在其它实施方案中，各缓冲液包含Bis Tris和/或各缓冲液包含不同浓度的相同化学物质。在另一个实施方案中，各缓冲液包含Bis Tris、乙酸、NaCl和水。
[0009]在本发明的一个实施方案中，该第一色谱柱是蛋白质A柱，该第二色谱柱是多峰树脂色谱柱。在本发明的另一实施方案中，该第一色谱柱是多峰树脂色谱柱，该第二色谱柱是蛋白质A柱。在本发明的其它实施方案中，用于从溶液中纯化蛋白质的方法不包括任何包括使该溶液流经阴离子交换色谱(AEX)柱的色谱步骤。
[0010]在本发明的一个实施方案中，被纯化的蛋白质是抗体。在另一个实施方案中，该抗体是单克隆抗体。
[0011]在本发明的一个实施方案中，该方法进一步包括在步骤(b)之后使该粗蛋白质洗脱液流经膜吸附器。在其它实施方案中，该方法进一步包括在步骤(b)之后的纳滤步骤和/或在该纳滤步骤后的超滤和渗滤步骤。
[0012]在本发明的某些实施方案中，该第一洗脱缓冲液包含20mM Bis Tris和20mM NaCl，用乙酸调节至pH 3.5 ;该第二洗脱缓冲液包含20mM Bis Tris和20mM NaCl，用乙酸调节至pH4.5 ;该平衡缓冲液包含20mM Bis Tris和20mM NaCl,用乙酸调节至pH 7.4 ;并且该清洗和卫生缓冲液包含20mM Bis Tris和IM NaCl，用乙酸调节至pH 7.4。在本发明的其它实施方案中，该第一洗脱缓冲液包含20mMBis Tris和20mM NaCl，用乙酸调节至pH 4.5 ;该第二洗脱缓冲液包含20mM Bis Tris和20mM NaCl，用乙酸调节至pH 3.5 ;该平衡缓冲液包含20mMBis Tris和20mM NaCl，用乙酸调节至pH 7.4 ;并且该清洗和卫生缓冲液包含20mM Bis Tris和IM NaCl，用乙酸调节至pH 7.4。
[0013]本发明提供包含一种试剂盒，其包含多峰树脂色谱柱和/或蛋白质A柱；和至少一种包含或由Bis Tris、乙酸、NaCl和水组成的缓冲液。在某些实施方案中，该试剂盒用于使用本发明的方法从溶液中纯化蛋白质。
[0014]本发明还提供一种试剂盒，其包含多峰树脂色谱柱和/或蛋白质A柱；以及用于制备至少一种包含或由Bis Tris、乙酸、NaCl和水组成的缓冲液的说明书。在某些实施方案中，该试剂盒用于使用本发明的方法从溶液中纯化蛋白质。
[0015]本发明进一步提供了包含或由Bis Tris、乙酸、NaCl和水组成的缓冲液用于通过至少一个色谱步骤从溶液中纯化蛋白质的用途。在某些实施方案中，该色谱步骤是多峰树脂色谱步骤和/或蛋白质A色谱步骤。还提供了包含或由Bis Tris、乙酸、NaCl和水组成的缓冲液用于通过本发明的方法从溶液中纯化蛋白质的用途。
[0016]本发明进一步提供了用于制备平衡缓冲液的方法，包括生成具有20mM Bis Tris和20mM NaCl的最终浓度的100升溶液；用乙酸将该溶液的pH调节至7.4 ;和收集50升该溶液。本发明还提供了用于制备清洗和卫生缓冲液的方法，包括用乙酸将来自制备平衡缓冲液剩余的50升溶液的pH调节至4.5 ;和收集25升该溶液。本发明进一步提供了用于制备洗脱缓冲液的方法，包括用乙酸将来自清洗和卫生缓冲液制备的剩余25升溶液的pH调节至3.5。本发明进一步提供了用于制备洗脱缓冲液的方法，包括向来自洗脱缓冲液制备的剩余25升溶液中添加当量IM的NaCl。通过本文中公开的方法制备的缓冲液可用于使用本发明的方法从溶液中纯化蛋白质。
[0017]将由下列详述及所附权利要求更充分地理解公开的纯化方法的这些和其它特征与优点。要注意的是，权利要求的范围由其中的叙述限定，而并非由该描述中所提出的特征与优点的具体讨论来限定。
[0018]附图概述
当与下列附图结合阅读时能够最好地理解公开的纯化法的实施方案的下列详述。
[0019]图1显示了用于配制实施例3至6中公开的纯化法的缓冲液的方案的示意图。
[0020]图2显示了两步纯化法的示意图。
[0021]图3显示了两步 纯化法用于大规模纯化柱的示意图。
[0022]图4显示了 “一天一批”大规模纯化的示意图。
[0023]图5显示了 “一天一批”大规模纯化的结果。
[0024]图6显示了用于配制实施例7中公开的纯化法的缓冲液的方案的示意图。
[0025]各方面与实施方案的详细描述
基于混合模式树脂(亦称多峰树脂)的可用性，本发明人已经开发了一种仅使用两个色谱步骤的新的纯化方法。换句话说，该方法仅包含两个涉及流经色谱柱的步骤。
[0026]本发明涉及用于从溶液中纯化蛋白质的方法，包括或由以下步骤组成:
(a)第一色谱步骤，包括:
-使所述溶液流经第一色谱柱；
-使用第一洗脱缓冲液从第一色谱柱中洗脱粗蛋白质洗脱液；和
(b)第二色谱步骤，包括:
-使在步骤(a)结束时获得的粗蛋白质洗脱液流经第二色谱柱；
-使用第二洗脱缓冲液从第二色谱柱中回收纯化的蛋白质，
其中各缓冲液包含Bis Tris。
[0027]更具体而言，两个上述色谱步骤各自可以包含或由以下步骤组成:
-使平衡缓冲液流经该色谱柱；
-使溶液或粗蛋白质洗脱液流经色谱柱(如上所述);
-使平衡缓冲液流经该色谱柱；
-任选地使清洗和卫生缓冲液流经该色谱柱；
-任选使平衡缓冲液流经该色谱柱；-使用洗脱缓冲液从该色谱柱中洗脱该粗蛋白质洗脱液或回收纯化的蛋白质(如上所
述)，
其中各缓冲液包含Bis Tris。
[0028]如上所述，上述本发明的方法仅包含两个色谱步骤。更具体而言，该方法可以避免使该溶液流经阴离子交换色谱(AEX)柱的色谱步骤和/或用于抛光的色谱步骤。即使本发明的方法仅包含两个色谱步骤，该方法也能够获得适于药物用途并特别适于施用于人类的纯化蛋白质。
[0029]除了将纯化法中的步骤数量由三个减少到两个(并因此缩短了完成该纯化过程所需的总时间)，公开的方法将用于纯化的缓冲液数量由七种减少到四种。此外，该缓冲液包含相同的组分(即Bis Tris、NaCl、乙酸和水)，这极大地便利了缓冲液的制备。除了允许纯化多种mAb外，公开的纯化方法还简化了 mAb纯化，提高了总产率，并减少了原材料、商品成本和加工时间。
[0030]与常规蛋白质纯化方法不同，如上所述，本文中公开的方法使用四种缓冲液:平衡缓冲液、清洗缓冲液和两种洗脱缓冲液。公开的方法中使用的缓冲液用相同的化合物基质由母液制得，这极大地便利了缓冲液的制备。
[0031]本文中所用的“本发明的缓冲液”指的是包含Bis Tris的缓冲液。Bis Tris是本领域技术人员公知的化合物，其IUPAC名称是2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)丙-1，3- 二醇，其CAS编号为6976-37-0。本发明的此类缓冲液可以对应于平衡缓冲液、对应于清洗和卫生缓冲液和/或对应于洗脱缓冲液。
[0032]更具体而言，本发明的此类缓冲液可以包含或由不同浓度的相同化学物质组成(其中之一是Bis Tris)。在一个具体实施方案中，该缓冲液包含或由Bis Tris、乙酸和水组成。在一个更具体的实施方案中，该缓冲液包含或由Bis Tris、乙酸、NaCl和水组成。换句话说，此类缓冲液包含或由不同浓度的Bis Tris、乙酸、NaCl和水组成。
[0033]该洗脱缓冲液可以例如包含或由15至25 mM (例如20 mM)Bis Tris和15至25 mM(例如20 mM) NaCl组成，用乙酸调节至包括3至4 (例如3.5)的pH。此类洗脱缓冲液尤其适用于亲和色谱柱如蛋白质A柱。
[0034]该洗脱缓冲液还可以包含或由15至25 mM (例如20 mM) Bis Tris和15至25 mM(例如20 mM) NaCl组成，用乙酸调节至包括4至5 (例如4.5)的pH。此类洗脱缓冲液尤其适用于多峰树脂色谱柱如Capto Adhere。
[0035]该洗脱缓冲液还可以包含或由15至25 mM (例如20 mM)Bis Tris和150至250 mM(例如200 mM)NaCl组成，用乙酸调节至包括8至9的pH。此类洗脱缓冲液尤其适于与多峰树脂色谱柱如Capto MMC 一起使用。
[0036]该平衡缓冲液可以包含或由15至25 mM (例如20 mM)Bis Tris和15至25 mM (例如20 mM) NaCl组成，用乙酸调节至包括7至8 (例如7.4)的pH。
[0037]该清洗和卫生缓冲液可以包含或由15至25 mM (例如20 mM) Bis Tris和0.9 to
1.1 mM (例如I M) NaCl组成，用乙酸调节至包括7至8 (例如7.4)的pH。
[0038]更具体地，用于公开的方法的一种平衡缓冲液含有20 mM Bis Tris和20 mM NaCl，用2 mM乙酸调节至pH 7.4。用于公开的方法的一种清洗缓冲液含有20 mM Bis Tris和I MNaCl，用2 mM乙酸调节至pH 7.4。用于公开的方法的第一洗脱缓冲液含有20 mM Bis Tris和20 mM NaCl，用275 mM乙酸调节至pH 3.5。用于公开的方法的第二洗脱缓冲液含有20 mMBis Tris 和 20mMNaCl，用 35 mM 乙酸调节至 pH 4.5。
[0039]上述缓冲液制剂的优点包括相对于传统纯化方法能够以更大的相容性使mAb产物通过公开的方法中使用的两个色谱柱，同时最小化不需要的相互作用，限制pH和电导率降低，并有助于提高产率。除了使用减少数量的缓冲液之外，公开的方法的另一方面是使用Bis-Tris缓冲液。
[0040]本文中所用的术语“多肽”或“蛋白质”指的是具有天然蛋白质(即由天然存在和具体地非重组细胞产生的，或基因工程改造或重组细胞所产生的蛋白质)的序列的分子，并包含具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子，或缺失、添加和/或取代天然序列的一个或多个氨基酸的分子。在某些方面，待纯化蛋白质是抗体。
[0041]本文中所用的术语“抗体”指的是完整抗体，或其与完整抗体竞争特定结合的结合片段。结合片段包括但不限于？(&13)、？(&13’)、？(&13’)2、？￥和单链抗体。术语“重链”包括具有足够的可变区序列以赋予对抗原的特异性的任何免疫球蛋白多肽。
[0042]本文中所用的术语“重链”涵盖全长重链及其片段。全长重链包括可变区结构域VH和三个恒定区结构域CH1、CH2和CH3。该VH结构域位于多肽的氨基末端，CH3结构域位于羧基末端。
[0043]本文中所用的术语“轻链”涵盖全长轻链及其片段。全长轻链包括可变区结构域VL和恒定区结构域CL。类似重 链，轻链的可变区结构域在多肽的氨基末端。本文中所用的术语“轻链”包括具有足够的可变区序列以赋予对抗原的特异性的任何免疫球蛋白多肽。
[0044]天然存在的抗体结构单元通常包含四聚体。此类四聚体各自通常由两个相同的多肽链对组成，各对具有一个全长轻链(通常具有大约25 kDa的分子量)和一个全长重链(通常具有大约50-70 kDa的分子量)。各轻链和重链的氨基末端部分通常包括大约100至110个或更多氨基酸的可变区，该可变区通常负责抗原识别。各链的羧基末端部分通常限定了负责效应子功能的恒定区。人轻链通常分类为K和λ轻链。重链通常分类为μ、δ、gamma、α或ε，并且分别将抗体的同种型限定为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有几个子分类，包括但不限于IgGU IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有包括但不限于IgMl和IgM2的子分类。IgA类似地细分为包括但不限于IgAl和IgA2的子分类。在全长轻链和重链中，可变区和恒定区通常通过大约12或更多个氨基酸的“ J”区接合，重链还包括大约10个或更多个氨基酸的“D”区。
[0045]各个轻/重链对的可变区通常构成抗原结合位点。可变区通常表现出通过三个高变区(也称为互补决定区或⑶R)连接的相对保守的框架区(FR)的相同的一般结构。来自各个对的两个链的CDR通常通过可能使得能够结合至特定表位的框架区对准。由N端至C端，轻链和重链可变区二者通常包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。通常根据 Kabat 等人，1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5版，U.S.Department of Health and Human Services, NIH 出版号 91-3242 的定义将氨基酸分配到各结构域。双特异性或双功能抗体通常是具有两种不同的重链/轻链对和两种不同的结合位点的人工杂交抗体。
[0046]F(ab)片段包含一个重链的CHl与可变区和一个轻链。F(ab)分子的重链不能与另一重链分子构成双硫键。F(ab’)片段含有一个轻链和在CHl与CH2结构域之间含有更多恒定区的一个重链，以使得能够在两个重链之间形成链间双硫键以形成F(ab’ )2分子。Fv区包含来自重链和轻链的可变区，但是缺少恒定区。单链抗体是其中重链和轻链可变区已经通过柔性联结子连接以形成单一多肽链(其构成抗原结合区)的Fv分子。在某些实施方案中，除了“多特异性”或“多功能”抗体之外的二价抗体应理解为包含具有相同抗原特异性的结合位点。
[0047]可以通过公开方法纯化的单克隆抗体(mAbs)可以通过多种技术制得，包括常规单克隆抗体方法，例如，本领域公知的标准体细胞杂交技术。尽管原则上体细胞杂交程序是优选的，可以使用制造单克隆抗体的其它技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌性转化。该单克隆抗体例如可以对应于鼠类、嵌合、人源化或全人抗体。
[0048]在一个具体实施方案中，通过本发明的方法纯化的抗体是选自以下的单克隆抗体:特异性结合到人β_淀粉样蛋白质的初原纤维形式上的抗体(例如人源化抗体)、特异性结合到细菌表面多糖聚-N-乙酰基葡糖胺(PNAG)上的抗体(例如全人抗体)、和特异性结合到CD38跨膜糖蛋白上的抗体(例如人源化抗体)。
[0049]本文中所用的术语“回收蛋白质”指的是在使用公开的纯化方法后收集蛋白质。公开的纯化方法可以使用多种标准蛋白质色谱技术实现，所述色谱技术例如但不限于亲和色谱、离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、凝胶过滤色谱和多峰树脂色谱。
[0050]在公开方法的某些实施方案中，第一或第二色谱柱是蛋白质A柱。该蛋白质A柱经由树脂配体与蛋白质之间的亲和力起作用，实现杂质的高效去除。在公开的方法中使用蛋白质A柱的另一优点在于mAbs对蛋白质A具有通用的亲和力。在公开的方法的一个实施方案中，该蛋白质A柱是MabSelect Sure树脂(GE Healthcare)。
[0051]在公开方法的其 它实施方案中，第一或第二色谱柱是多峰(混合模式)树脂色谱柱。该多峰树脂与所述目标蛋白质经由几种机制相互作用，所述机制具有mAb:离子相互作用、疏水性相互作用和氢键相互作用。更具体地，在多峰树脂色谱柱中，该mAb:离子相互作用是mAb:阳离子相互作用，与发生在传统阴离子交换色谱(AEX)柱中的mAb:阴离子相互作用相反。
[0052]在公开的方法的一个特定实施方案中，该多峰树脂是Capto Adhere树脂(GEHealthcare)ο Capto adhere是具有基于高度交联的琼脂糖的基质的多峰阴离子交换剂。下面总结了 Capto adhere 的特性(参见 GE Healthcare Life Sciences,数据文件 28-9078-88AC)。
【权利要求】
1.用于从溶液中纯化蛋白质的方法，其包括: (a)第一色谱步骤，包括: -使所述溶液流经第一色谱柱； -使用第一洗脱缓冲液从所述第一色谱柱中洗脱粗蛋白质洗脱液；和 (b)第二色谱步骤，包括: -使在步骤(a)结束时获得的所述粗蛋白质洗脱液流经第二色谱柱； -使用第二洗脱缓冲液从所述第二色谱柱中回收纯化的蛋白质， 其中各所述缓冲液包含Bis Tris。
2.权利要求1所述的方法，其中两个色谱步骤的各个包括: -使平衡缓冲液流经所述色谱柱； -使所述溶液或所述粗蛋白质洗脱液流经所述色谱柱； -使平衡缓冲液流经所述色谱柱； -任选地使清洗和卫生缓冲液流经所述色谱柱； -任选地使平衡缓冲液流经所述色谱柱； -使用洗脱缓冲液从所述色谱柱中洗脱所述粗蛋白质洗脱液或回收纯化的蛋白质， 其中各所述缓冲液包含Bis Tris。
3.权利要求1或2所述的方法，其中各所述缓冲液由不同浓度的相同化学品组成。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中各所述缓冲液由BisTris、乙酸、NaCl和水组成。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中用于从溶液中纯化蛋白质的所述方法仅包括两个色谱步骤。
6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述色谱柱之一是亲和色谱柱。
7.权利要求6所述的方法，其中所述亲和色谱柱是蛋白质A柱。
8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述色谱柱之一是多峰树脂色谱柱。
9.权利要求1至8中任一项所述的方法,其中步骤(a)进一步包括使用BisTris溶液调节所述粗蛋白质洗脱液的pH。
10.权利要求9所述的方法，其中将所述pH调节至包括6至7的值。
11.权利要求1至8中任一项所述的方法，其中使在步骤(a)结束时获得的所述粗蛋白质洗脱液直接流经第二色谱柱，而不经受任何处理，如PH调节、缓冲液交换或稀释。
12.权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述方法包括以下步骤: (a)第一色谱步骤，包括: (i)使平衡缓冲液流经第一色谱柱； (?)使所述溶液流经所述第一色谱柱； (iii)使平衡缓冲液流经所述第一色谱柱； (iv)使清洗和卫生缓冲液流经所述第一色谱柱； (v)使平衡缓冲液流经所述第一色谱柱； (vi)使用第一洗脱缓冲液从所述第一色谱柱中洗脱粗蛋白质洗脱液；和 (vii)任选地使用BisTris溶液调节所述粗蛋白质洗脱液的pH ； 和(b)第二色谱步骤，包括: (i)使平衡缓冲液流经第二色谱柱； (?)使来自步骤(a)的所述粗蛋白质洗脱液流经所述第二色谱柱； (iii)使平衡缓冲液流经所述第二色谱柱；和 (iv)使用第二洗脱缓冲液从所述第二色谱柱中回收纯化的蛋白质。
13.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述第一色谱柱是亲和色谱柱。
14.权利要求13所述的方法，其中所述亲和色谱柱是蛋白质A柱。
15.权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述第二色谱柱是多峰树脂色谱柱。
16.权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述方法包括以下步骤: (a)第一色谱步骤，包括: (i)使平衡缓冲液流经第一色谱柱； (?)使所述溶液流经所述第一色谱柱； (iii)使平衡缓冲液流经所述第一色谱柱； (iv)使用第一洗脱缓冲液从所述第一色谱柱中洗脱粗蛋白质洗脱液；和 (V)任选地使用Bis Tris溶液调节所述粗蛋白质洗脱液的pH ； 和 (b)第二色谱步骤，包括: (i)使平衡缓冲液流经第二色谱柱； (?)使来自步骤(a)的所述粗蛋白质洗脱液流经所述第二色谱柱； (iii)使平衡缓冲液流经所述第二色谱柱； (iv)使清洗和卫生缓冲液流经所述第二色谱柱； (v)使平衡缓冲液流经所述第二色谱柱；和 (vi)使用第二洗脱缓冲液从所述第二色谱柱中回收纯化的蛋白质。
17.权利要求1至11和16中任一项所述的方法，其中所述第一色谱柱是多峰树脂色谱柱。
18.权利要求1至11、16和17中任一项所述的方法，其中所述第二色谱柱是亲和色谱柱。
19.权利要求18所述的方法，其中所述亲和色谱柱是蛋白质A柱。
20.权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是抗体。
21.权利要求20所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
22.权利要求20或21所述的方法，其中所述单克隆抗体选自特异性结合到人β-淀粉样蛋白质的初原纤维形式上的抗体、特异性结合到细菌表面多糖聚-N-乙酰基葡糖胺(PNAG)上的抗体、和特异性结合到⑶38跨膜糖蛋白上的抗体。
23.权利要求1至22中任一项所述的方法，其在步骤(b)之后进一步包括使所述粗蛋白质洗脱液流经膜吸附器的步骤(c )。
24.权利要求23所述的方法，其中所述膜吸附器是耐盐性相互作用的色谱法膜吸附器。
25.权利要求1至24中任一项所述的方法，其在步骤(b)或(c)之后进一步包括纳滤步骤。
26.权利要求25所述的方法，其在所述纳滤步骤之后进一步包括超滤和渗滤步骤。
27.权利要求1至15和20至26中任一项所述的方法，其中所述第一洗脱缓冲液包含15至25 mM Bis Tris和15至25 mM NaCl，用乙酸调节至包括3至4的pH。
28.权利要求1至15和20至27中任一项所述的方法，其中所述第二洗脱缓冲液包含15至25 mMBis Tris和15至25 mM NaCl，用乙酸调节至包括4至5的pH。
29.权利要求1至15和20至27中任一项所述的方法，其中所述第二洗脱缓冲液包含15至25 mMBis Tris和150至250 mM NaCl，用乙酸调节至包括8至9的pH。
30.权利要求1至11和16至26中任一项所述的方法，其中所述第一洗脱缓冲液包含15至25 mMBis Tris和15至25 mM NaCl，用乙酸调节至包括4至5的pH。
31.权利要求1至11和16至26中任一项所述的方法，其中所述第一洗脱缓冲液包含15至25 mMBis Tris和150至250 mM NaCl，用乙酸调节至包括8至9的pH。
32.权利要求1至11、16至26、30和31中任一项所述的方法，其中所述第二洗脱缓冲液包含15至25 mMBis Tris和15至25 mM NaCl，用乙酸调节至包括3至4的pH。
33.权利要求2至32中任一项所述的方法，其中平衡缓冲液包含15至25mM Bis Tris和15至25 mM NaCl，用乙酸调节至包括7至8的pH。
34.权利要求2至33任一项所述的方法，其中所述清洗和卫生缓冲液包含15至25mMBis Tris和0.9至1.1 mM NaCl,用乙酸调节至包括7至8的pH。
35.权利要求1至34中任一项所述的方法，其中以至少85%的产率回收所述纯化的蛋白质。
36.权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述回收的纯化的蛋白质表现出至少95%的纯度。
37.权利要求1至36中任一项所述的方法，其进一步包括将所述回收的纯化的蛋白质配制成药物组合物的步骤。
38.制备适用于权利要求1至37中任一项所述的方法的缓冲液的方法，其包括以下步骤: i)制得具有15至25mM Bis Tris和15至25 mM NaCl的最终浓度的溶液； ii)用乙酸将所述溶液的pH调节至包括7至8的值； iii)收集所述溶液的一半，由此获得平衡缓冲液； iv)用乙酸将来自步骤(iii)的剩余一半的溶液的pH调节至包括4至5的值； V)收集步骤(iv)获得的所述溶液的一半，由此获得洗脱缓冲液； vi)用乙酸将来自步骤(V)的剩余一半的溶液的pH调节至包括3至4的值，由此获得进一步的洗脱缓冲液； vii)收集步骤(iii)获得的所述平衡缓冲液溶液的一半并加入NaCl以获得0.9至1.1mM的最终NaCl浓度，由此获得清洗和卫生缓冲液。
39.制备适用于权利要求1至37中任一项所述的方法的缓冲液的方法，其包括以下步骤: i)制得具有15至25mM Bis Tris和15至25 mM NaCl的最终浓度的溶液； ii)用乙酸将所述溶液的pH调节至包括8至9的值； iii)收集所述溶液的四分之一，由此获得洗脱缓冲液；iv)用乙酸将来自步骤(iii)的剩余溶液的pH调节至包括7至8的值； V)收集步骤(iv)获得的所述溶液的三分之二，由此获得平衡缓冲液； vi)用乙酸将来自步骤(V)的剩余溶液的pH调节至包括3至4的值，由此获得进一步的洗脱缓冲液； vii)收集步骤(V)获得的所述平衡缓冲液的一半并加入NaCl以获得0.9至1.1 mM (例如I M)的最终NaCl浓度，由此获得清洗和卫生缓冲液。
40.试剂盒，其包含: Ca)多峰树脂色谱柱和/或亲和色谱柱，例如蛋白质A柱； 和 (b)包含或由Bis Tris、乙酸、NaCl和水组成的至少一种缓冲液。
41.试剂盒，其包含: Ca)多峰树脂色谱柱和/或亲和色谱柱，例如蛋白质A柱； 和(b)用于制备包含或由Bis Tris、乙酸、NaCl和水组成的至少一种缓冲液的说明书。
42.包含或由BisTris、乙酸、NaCl和水组成的缓冲液用于通过至少一个色谱步骤从溶液中纯化蛋白质的用途。
43.权利要求42所述的用途，其中所述色谱步骤是多峰树脂色谱步骤和/或亲和色谱柱，例如蛋白质A柱。
【文档编号】C07K1/22GK104039808SQ201280067326
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2012年5月23日 优先权日:2011年11月23日
【发明者】D.迪瑟, L.朗德里-比尔丹, B.莫特斯 申请人:赛诺菲