专利名称：孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子，本发明还涉及该孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子的制备方法，本发明还涉及该孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子的用途。
背景技术：
自上世纪70年代美国哈佛医学院教授Folkman首次提出的“肿瘤生长依赖于血管形成”的观点以后，肿瘤新生血管的形成与肿瘤的生长、转移关系受到普遍关注。诸多研究表明，血管生成是一个由多种细胞因子参与的、动态的、协调的复杂过程，涉及一系列形态学改变(如内皮细胞激活，降解基底膜、内皮细胞的定向运动和增殖、新生微血管、内皮细胞新的基底膜合成、血管腔产生、芽式生长并形成血管襻等一系列步骤)及生物化学改变(如血管生成因子、细胞因子及相关抑制因子之间的调节失衡)。而肿瘤的生长与转移依赖血管生成，建立丰富的血液循环，以供应肿瘤组织异常旺盛的生化代谢以及瘤细胞的繁殖与转移。因此，血管生成是肿瘤生长、发展的必经之路，且与实体瘤的发生、转移有着密切的关系，而抑制新生血管生成，对于恶性肿瘤的防治具有重要意义。目前，人们已针对血管生成不同环节开发破坏或抑制血管生成，有效地阻止
肿瘤生长和转移的药物----肿瘤血管生成抑制剂(tumor angiogenesis inhibitor,
TAI),如针对血管内皮细胞抑制 其增殖、诱导其凋亡而达到抗肿瘤目的的endostatin和agiostain等；针对血管内皮生长因子(VEGF)或其受体(VEGFR)的药物avast in和ant1-huMAB-VEGFRl 等。软骨是一种无血管组织，对肿瘤侵噬具有一定的抵抗性，目前已从鲨鱼软骨中分离得到了多种血管生成抑制因子，如:1983年Lee和Langer首次报道从姥鲨的鳍和脊椎软骨中制备了新血管生成抑制因子SCAPI，1997年王路等从中国姥鲨软骨中获得新生血管抑制因子S⑶I，1998年Sheu等从青鲨软骨中分离纯化了相对分子量分别为10 kDa和14 kDa两条多肽组成的新血管生成抑制因子U-995，1999年王树森等从鲨鱼软骨中获得了相对分子量为32 680 Da的血管生成抑制因子CDAI，2000年美国加州大学的Liang等从鲨鱼软骨中分离纯化获得相对分子量大约为10 kDa的新型血管生成抑制因子SCF2，2000年和2001年沈先荣等从鲸鲨软骨中提取分离了两种高纯度血管生成抑制因子SCAIFl (18 kDa)和SCAIF80 (80 kDa)，2001年和2003年曾锋等以广东阳江鲨鱼软骨为原料，分离出新生血管生成抑制因子SCA1-a (12.6 kDa)和SCA1-c (17.4 kDa)。孔鳐与鲨鱼同属软骨鱼类，研究表明孔鳐软骨成分中亦含有与鲨鱼软骨血管生成抑制因子类似的抗肿瘤活性物质，如马润娣等从孔鳐软骨中制备了分子量为42 kDa血管生成抑制因子I (中国发明专利:公开号CN 1978464A)，王斌等从孔鳐软骨中制备了分子量为36.2 kDa血管生成抑制因子RCAIF-1(中国发明专利:公开号CN102167725 A)。但是，软骨鱼类血管生成抑制因子分子量多处于10-100 kDa之间，具有分子量大不能透过半透膜、易受体内酶和细菌以及体液的破坏、半衰期短、清除率高、生物利用度低等蛋白类药物的缺点，限制了软骨类血管生成抑制因子的深入开发。因此，寻找分子量小、活性显著和稳定性强的血管生成抑制因子成为软骨活性物质研究的重点。众所周知，蛋白质的生理功能取决于其特定的氨基酸序列，用合适的蛋白酶水解，就能释放出天然、高效、新颖和稳定性强的生物活性肽。基于此，以孔鳐软骨为实验材料，通过对酶解工艺和制备技术的综合应用，将有可能获得活性显著和稳定性强的血管生成抑制因子，为海洋抗肿瘤药物的开发提供候选药物。但是，申请人研究发现，以孔鳐软骨为原料，利用酶解技术制备多肽类血管生成抑制因子的工艺研究处于空白阶段，而以酶解产物为材料制备高活性多肽类血管生成抑制因子及其应用更是未见报道。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状提供孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子，该血管生成抑制因子能有效抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成，以及人肺癌细胞A-549和人肝癌细胞株Bel-7402的增殖。本发明所要解决的第二个技术问题是提供孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子的制备方法，该工艺科学合理、易于操作。本发明所要解决的第三个技术问题是提供孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子在制备抑制血管生成、防治肿瘤的药物中的应用。本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为:孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子，其特征在于该血管生成抑制因子的氨基酸序列为Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu SEQ ID NO:1 ，ESI/MS 检测给出分子离子峰793.11 Da ([M+H] + )。本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为:孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子的制备方法，其特征在于包括以下步骤:
I)以孔鳐软骨为原料，按固液比I g:5 10 mL加入到浓度为1.0 mol/L盐酸胍溶液中(含 0.02 mol/L MES 和 0.02 mol/L EDTA，pH 7.6)，于 4 °C振荡抽提 36 48 h 后，抽提溶液于4 °C以下，以4 000 r/min离心15 25 min，去除残渣收集上清液；上清液继续在4 °〇下12000 r/min离心2(T25 min，取上清液；将上清液装入截留分子量为3 kDa的透析袋中，利用Tris-HCl (pH 7.6)缓冲液于4°C下透析18 30 h，每隔6 h更换Tris-HCl (pH 7.6)缓冲液I次，透析袋内溶液即为孔鳐软骨粗提液。2)孔鳐软骨粗提液置于4 °C下预冷0.5 1 h，缓慢加入4 °C下预冷的丙酮至其浓度为30%，静置0.5 I h后，于4 °C以下9 000 r/min离心15 25 min，取离心上清液加入4 °C下预冷的丙酮至丙酮浓度达60%，静置0.5 1 h后，4 °C以下9 000 r/min离心15 25min，取沉淀置于截留分子量为3 kDa的透析袋内用Tris-HCl (0.02 mol/L,pH 7.6)缓冲液透析24 36 h，每隔6 h更换Tris-HCl (0.02 mol/L, pH 7.6)缓冲液I次，透析液冷冻干燥，得孔鳐软骨蛋白；
3)取冻干孔鳐软骨蛋白，按照料液比I g:3 5 mL加入Tris-HCl缓冲液(0.02 mol/L,pH 7.5 8.5)，按照软骨蛋白质量的2.0 3.0%加入胰蛋白酶，于温度35 45°C下酶解3 5 h，得孔鳐软骨蛋白酶解产物；
4)将制备的孔鳐软骨蛋白酶解产物先经灭酶处理得孔鳐软骨蛋白酶解液，再将酶解液依次经超滤、脱盐和层析，得到孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子。作为优选，所述步骤3)中的胰蛋白酶的酶活力> 2.5X IO4 U/g。作为改进，所述步骤4)中的灭酶处理为:将孔鳐软骨蛋白酶解产物升温至9(T95°C，并于此温度保持l(Tl5min后，冷却至室温，然后离心，得孔鳐软骨蛋白酶解液。再改进，所述步骤4)的超滤、脱盐和层析的具体过程为:
超滤:将孔鳐软骨蛋白酶解液于0.f0.15 MPa的工作压力和2(T25 °C的工作温度下采用I kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于I kDa部分，即为超滤酶解液；
脱盐:将超滤酶解液制成浓度为1(T20 mg/mL溶液，加入到大孔树脂层析柱，然后用质量浓度7(T80%乙醇进行洗脱，得脱盐酶解液。脱盐酶解液于50 1:以下低压旋蒸除去乙醇后，冷冻干燥得脱盐酶解物干粉；
层析:将上述脱盐酶解物干粉溶于双蒸水配成浓度为1(T20 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂分离，用水、0.09 0.11 mol/L,0.45 0.55 mol/L 和 0.90 1.10 mol/L NaCl 溶液进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成抑制作用最高组分为离子交换层析酶解物；将上述离子交换层析酶解物用双蒸水配成8 12 mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成抑制作用最高组分为凝胶层析酶解物，将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成45飞5 u g/mL的溶液，利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行纯化，根据对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的抑制作用得I个高血管生成抑制作用多肽 Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu (GEEGTMGL)。
优选,所述大孔树脂为DlOl。再优选，所述阴离子交换树脂为DEAE-52纤维素，所述凝胶为葡聚糖凝胶G_15 ;所述反相高效液相色谱条件为:进样量19 21 u g ;色谱柱为Zorbax C18 ;流动相:A水，B乙腈；梯度洗脱:0 %-50 % B，32min ；50%-100% B，2min ；100%- 100% B，3min ;紫外检测波长 220 nm。本发明为解决上述第三个技术问题所采取的技术方案为:孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子的应用，其特征在于 Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu (GEEGTMGL)在 I y g/只、10 yg/只、和100 Ug/只的浓度下，对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的抑制率分别为46.5%,68.7%和85.0% ;对人肺癌细胞A-549和人肝癌细胞株Bel-7402的IC50分别为
0.32 mg/mL 和 0.15 mg/mL ；Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu (GEEGTMGL)具有安全无毒副作用和活性强等优点，可用于制备抑制血管生成、防治肿瘤的药物。与现有技术相比，本发明的优点在于:本发明工艺科学合理，选用胰蛋白酶作为酶解用酶，通过生物酶解法同时融合膜超滤分级、大孔树脂脱盐和色谱精制，酶解过程易监控，同时制得的多肽类血管生成抑制因子具有较高的活性；与化学合成的多肽类血管生成抑制因子相比较，本发明制得的多肽类血管生成抑制因子具有安全无毒副作用和活性强等优点，可用于制备抑制血管生成、防治肿瘤的药物。
图1是本发明的脱盐酶解物的阴离子交换树脂DEAE-52纤维素层析 图2是本发明的离子交换层析酶解物的葡聚糖凝胶G-15层析 图3是本发明的葡聚糖凝胶G-15制备的凝胶层析酶解物的RP-HPLC分析 图4是本发明的Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu (GEEGTMGL)的反相高效液相色谱(RP-HPLC)；
图 5 是本发明的 Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu (GEEGTMGL)的质谱图(ESI/MS)。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子的制备方法，制备工艺流程如下:孔鳐软骨〃蛋白抽提〃酶解〃酶解物〃膜超滤〃大孔树脂脱盐〃离子交换层析〃凝胶过滤层析〃高效液相色谱分析、制备"孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子。实施例1:
1)以孔鳐软骨为原料，按固液比Ig:5 mL加入到浓度为1.0 mol/L的盐酸胍溶液中(含 0.02 mol/L MES 和 0.02 mol/L EDTA, pH 7.6)，于 4 °C振荡抽提 48 h，抽提溶液于 4°C以下，以4 000 r/min离心20 min，去除残渣收集上清液；上清液继续在4°C下12000 r/min离心25 min，取上清液；将上清液装入截留分子量为3 kDa的透析袋中，利用Tris-HCl(0.02 mol/L,pH 7.6)缓冲液于 4°C下透析静置 24 h，每隔 6 h 更换 Tris-HCl (0.02 mol/L，pH 7.6)缓冲液I次，透析袋内溶液即为孔鳐软骨粗提液；
2)孔鳐软骨粗提液置于4°C下预冷I h，缓慢加入4 °C下预冷的丙酮至其浓度为30%，静置I h后，于4 °C以下9 000 r/min离心15 min，取离心上清液加入4 °C下预冷的丙酮至丙酮浓度达60%，静置I h后，4 °C以下9 000 r/min离心25 min，取沉淀置于截留分子量为3 kDa的透析袋内用Tris-HCl (0.02 mol/L, pH 7.6)缓冲液透析24 h，每隔6 h更换Tris-HCl (0.02 mol/L, pH 7.6)缓冲液I次，透析液冷冻干燥，得孔鳐软骨蛋白；
3)取冻干孔鳐软骨蛋白，按照料液比Ig:3 mL加入Tris-HCl缓冲液(0.02 mol/L,pH8.0)，按照软骨粗蛋白质量的3.0%加入胰蛋白酶，于温度40 °C下酶解5 h，得孔鳐软骨蛋白酶解产物；
4)将步骤3)所得的酶解产物先经灭酶处理得酶解液，再将酶解液依次经超滤、脱盐和层析，得到孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子，利用氨基酸序列分析和质谱测定其结构，具体过程为:
①灭酶:将孔鳐软骨蛋白酶解产物升温至9(T95°C，并于此温度保持10 min后，冷却至室温，然后离心，得孔鳐软骨蛋白酶解液。②超滤:将孔鳐软骨蛋白酶解液于0.r0.15 MPa的工作压力和2(T25 °C的工作温度下采用I kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于I kDa部分，即为超滤酶解液；
③脱盐:将超滤酶解液制成浓度为15 mg/mL溶液，加入到大孔树脂层析柱，然后用质量浓度80%乙醇进行洗脱，得脱盐酶解液。脱盐酶解液于50 °C以下低压旋蒸除去乙醇后，冷冻干燥得脱盐酶解物干粉；④阴离子交换层析:将上述脱盐酶解物干粉溶于双蒸水配成浓度为15mg/mL的溶液，经过DEAE-52纤维素阴离子交换树脂分离，用水、0.1 mol/L、0.5 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成抑制作用最高组分为离子交换层析酶解物(F6)(图1)；
⑤凝胶色谱层析:将上述离子交换层析酶解物(F6)用双蒸水配成10mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成抑制作用最高组分为凝胶层析酶解物(F61)(图2)。⑥高效液相色谱精制:将上述制备的凝胶层析酶解物(F61)用双蒸水配成50U g/mL的溶液，利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行纯化(条件:进样量20 y g ;色谱柱为 Zorbax C18 (250 mm X 4.6 mm, 5 U m);流动相:A 水，B 乙腈；梯度洗脱:0 %-50 % B,32min ；50%-100% B，2min;100%- 100% B，3min ;紫外检测波长 220 nm ;根据对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的抑制作用得I个高血管生成抑制作用多肽。(见图3)。⑦结构检测=RP-HPLC检测收集的高血管生成抑制作用多肽为单一峰(见图4)，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu(GEEGTMGL)，ESI/MS 检测给出分子离子峰793.1lDa ([M+H] + )。 将上述制得的孔鳐软骨蛋白抗肿瘤多肽Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu(GEEGTMGL)进行人肺癌细胞A-549和人肝癌细胞株Bel-7402的增殖抑制实验。实验结果表明:该多肽对人肺癌细胞A-549和人肝癌细胞株Bel-7402的IC5tl分别为0.32 mg/mL和
0.15 mg/mLo将制得的多肽Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu (GEEGTMGL)作抑制鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的测定，测定方法参考贺国安、罗进贤、张添元等“改进的鸡胚绒毛尿囊膜技术一无气室孵育法”[记载于《中山大学学报(自然科学版)》，2003年第2册(第42卷):第126-128页]，测 定时滤纸片大小为3mmX3mm;加样前孵化时间为4天；加样量:Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu (GEEGTMGL)分别为 I iig/只、10 yg/只、0.8 u g/只；0.01mol/L pH 7.6的磷酸盐缓冲液(PBS)为阴性对照；5 u g/只的硫酸软骨素(CS)为阳性对照。加样后继续孵化24h，以给药点为中心，以半径间隔5 mm将CAM划分为3个区域，计数各区域的血管数，按下式计算血管生成抑制率:
血管生成抑制率=(对照组血管分支点数一给药组血管分支点数)/对照组血管分支点数 X 100%
结果表明，Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu (GEEGTMGL)显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成并呈剂量依赖关系，在I Ug/只、10 Ug/只、和100 Ug/只的浓度下，对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的抑制率分别为46.5%,68.7%和85.0% (表I)。表I孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu(GEEGTMGL)对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的抑制作用
SI I鸡胚数I用药量(yg/只)I血管分支点数(f士s) I抑制率(%)
对照 5 —— iT~6±3.8—
硫酸软骨素5 ~5 26.4±1.561.5
GEEGTMGL 5 —I 瓦.7±2.346 5
GEEGTMGL 5 —10 五.5±0.868 7
GEEGTMGL 丨5 |l00 |l0.3 + 0.6!85.0最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应 认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子，其特征在于该孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子的氨基酸序列为Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu SEQ ID NO: 1，ESI/MS检测给出分子离子峰取々793.1lDa ([M+H] + )。
2.—种权利要求1所述的孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子的制备方法，其特征在于包括以下步骤: 1)以孔鳐软骨为原料，按固液比Ig:5 10 mL加入到浓度为1.0 mol/L的盐酸胍溶液中(含 0.02 mol/L MES 和 0.02 mol/L EDTA，pH 7.6)，于 4 °C振荡抽提 36 48 h，抽提溶液于4 °C以下，以4 000 r/min离心15 25 min，去除残渣收集上清液；上清液继续在4°C下12000 r/min离心2(T25 min，取上清液；将上清液装入截留分子量为3 kDa的透析袋中，利用Tris-HCl (0.02 mol/L, pH 7.6)缓冲液于4°C下透析静置18 30 h，每隔6 h更换Tris-HCl (0.02 mol/L, pH 7.6)缓冲液I次，透析袋内溶液即为孔鳐软骨粗提液； 2)孔鳐软骨粗提液置于4°C下预冷0.5 1 h，缓慢加入4 °C下预冷的丙酮至其浓度为30%，静置0.5 I h后，于4 °C以下9 000 r/min离心15 25 min，取离心上清液加入4 °〇下预冷的丙酮至丙酮浓度达60%，静置0.5 I h后，4 °C以下9 000 r/min离心15 25 min，取沉淀置于截留分子量为3 kDa的透析袋内用Tris-HCl (0.02 mol/L,pH 7.6)缓冲液透析24 36 h，每隔6 h更换Tris-HCl (0.02 mol/L, pH 7.6)缓冲液I次，透析液冷冻干燥，得孔鳐软骨蛋白； 3)取冻干孔鳐软骨蛋白，按照料液比Ig:3 5 mL加入Tris-HCl缓冲液(0.02 mol/L,pH为7.5^8.5)，按照软骨粗蛋白质量的2.(T3.0%加入胰蛋白酶，于温度35 45°C下酶解3飞h，得孔鳐软骨蛋白酶解产物； 4)将制备的孔鳐软骨蛋白酶解产物先经灭酶处理得孔鳐软骨蛋白酶解液，再将酶解液依次经超滤、 脱盐和层析，得到孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤3)中的胰蛋白酶的酶活力彡 2.5 X IO4 U/g。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤4)中的灭酶处理为:将孔鳐软骨蛋白酶解产物升温至9(T95°C，并于此温度保持l(Tl5min后，冷却至室温，然后离心，得孔鳐软骨蛋白酶解液。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤3)的超滤、脱盐和层析的具体过程为: 超滤:将孔鳐软骨蛋白酶解液于0.r0.15 MPa的工作压力和2(T25 °C的工作温度下采用I kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于I kDa部分，即为超滤酶解液； 脱盐:将超滤酶解液制成浓度为1(T20 mg/mL溶液，加入到大孔树脂层析柱，然后用质量浓度7(T80%乙醇进行洗脱，得脱盐酶解液，脱盐酶解液于50 1:以下低压旋蒸除去乙醇后，冷冻干燥得脱盐酶解物干粉； 层析:将上述脱盐酶解物干粉溶于双蒸水配成浓度为1(T20 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂分离，用水、0.09 0.11 mol/L,0.45^0.55 mol/L 和 0.90 1.10 mol/L NaCl 溶液进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制作用最高组分为离子交换层析酶解物；将上述离子交换层析酶解物用双蒸水配成8 12mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制作用最高组分为凝胶层析酶解物，将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成45飞5 u g/mL的溶液，利用反相高效液相色谱进行纯化，根据对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制作用得I个高血管生成抑制作用多肽Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu SEQ ID NO:1。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述大孔树脂为DlOl。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述阴离子交换树脂为DEAE-52纤维素，所述凝胶为葡聚糖凝胶G-15 ;所述反相高效液相色谱条件为:进样量19 21 u g ;色谱柱为 Zorbax C18 ;流动相:A 水，B 乙腈；梯度洗脱:0 %-50 % B，32min ；50%-100% B，2min ；100%- 100% B，3min ;紫外检测波长 220 nm。
8.权利要求1所 述的孔鳐软骨蛋白抗肿瘤多肽可用于制备抑制血管生成、防治肿瘤的药物用途。
全文摘要
本发明公开了孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子及其制备方法和用途，该多肽类血管生成抑制因子的氨基酸序列为Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu(GEEGTMGL)，ESI/MS检测给出分子离子峰m/z793.11Da([M+H]+)孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu(GEEGTMGL)能有效抑制鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)的血管生成，以及人肺癌细胞A-549和人肝癌细胞株Bel-7402的增殖。孔鳐软骨多肽类血管生成抑制因子Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu(GEEGTMGL)可用于制备抑制血管生成、防治肿瘤的药物。
文档编号C07K1/18GK103204907SQ20131004031
公开日2013年7月17日 申请日期2013年2月1日 优先权日2013年2月1日
发明者王斌, 胡发远, 罗红宇, 徐银峰 申请人:浙江海洋学院