专利名称：多糖粘液形成菌的靶基因缺失的制作方法
技术领域：
本发明涉及鞘氨醇胶多糖制备领域。特别地，其涉及用于改进制备鞘氨醇胶的菌株的定点基因方法。
背景技术：
鞘氨醇单胞菌(sphingomonas)菌株，例如ATCC53159和ATCC31461产生大量的荚膜多糖。尽管在某些条件下，多糖可以由细胞释放[5，6]，但在具有丰富碳源的生长过程中(如发酵)，多糖牢固附着于细胞表面。提高丢坦糖胶(diutan)和吉兰糖胶(gellan)发酵产率的尝试受到荚膜性质的多糖的限制，所述荚膜性质的多糖可以破坏营养素的吸收。另夕卜，如果用于多糖的生物合成的位点数量有限，就会有由各细胞能产生多糖的最大量。已经观察到多糖吉兰糖胶与细胞凝集有关，这是由于不产生任何多糖的突变体在悬浮液中均匀地生长[3]。这些细胞凝集块可以干扰多种技术，例如通过光密度测定细胞数量，细胞的离心(例如用于分离DNA或蛋白质)，以及用于多糖纯化的细胞分离或裂解。先前尚未确定与鞘氨醇单胞菌中多糖附着于细胞表面有关的附着机制和基因。已经分离了以粘液形式产生多糖的鞘氨醇单胞菌菌株ATCC31461、ATCC31555、ATCC31554和ATCC21423的诱导突变体，但是未确定突变基因，且未公开诱导和筛选突变体的方法[10]。已经分离了用于吉兰糖胶[3，8]、 丢坦糖胶[I]和鞘氨醇胶S-88[9]生物合成的基因。许多这些基因的功能通过生物化学试验给出或者通过与数据库例如GenBank中的已知功能的基因的同源性给出。例如，已经鉴定了与四糖重复单元[7，8]的装配和前体dTDP-L-鼠李糖[3，9]的合成有关的基因。预期仅影响多糖附着于细胞表面的基因仍具有产生多糖的表型(即固体培养基和粘性发酵液上的粘液样菌落)。除了不在基因簇中的用于吉兰糖胶合成的四种基因外，还描述了跨越21kb的18种用于吉兰糖胶生物合成的基因的基因簇。Harding N.E., Y.N.Patel, and R.Coleman,2004。伊乐藻鞘氨醇单胞菌ATCC31461中具有吉兰糖胶多糖生物合成所需的基因的结构。JInd Microbiol Biotech31:70_82，参考文献 3。其 DNA 序列于 2003 年 6 月存放于 GenBank中(登录号AY217008)。基因簇中的基因有gelM、gelN以及gell。构建了大多数相邻基因gelM和gelN的缺失。通过插入灭活gell基因。gelM-gelN缺失株和gell突变株显示产生数量有所减少的吉兰糖胶和更具流动性的发酵液，且显示所产生的吉兰糖胶具有与野生株的吉兰糖胶相同的组成。多糖至细胞的附着未有报道。伊乐藻鞘氨醇单胞菌的gelR、gelS及gelG基因似乎以与S_88sps基因簇中相同的顺序存在于操纵子中，但不邻近18个基因的基因簇中的基因(参考文献3)。GelR蛋白较其S-88同源物稍小￠59和670个氨基酸相比)，具有49%的同源性，且与表层蛋白和其他膜蛋白具有同源性。gelR、gelS及gelG基因的DNA序列于2003年6月存放于GenBank中(登录号AY220099)。该报道中未构建gelR的突变(参考文献3)。Yamazaki等报道在基因spsR中具有突变的菌株仍为粘液样，表明它们产生多糖，但多糖不具有流变学或附着于细胞的特征([9]和 T.J.Pollock 等，DNA segments and methods for increasingpolysaccharide production.U.S.Patent N0.5, 854, 034)。Yamazaki描述了四种鞘氨醇单胞菌菌株的典型突变体，其产生作为粘液而非附着于细胞的多糖。美国专利第6，605，461号。Yamazaki未描述如何筛选粘液表型的诱变培养物。Yamazaki未鉴定出哪个基因或哪些基因被诱变。Sa-Correia综述了关于吉兰糖胶合成的基因的分离的工作。Sa-Correia 1.,A.M.Fialho, P.Videira, L.M.Moreira, A.R.Marques and H.Albano0 Gellan gumbiosynthesis in Sphingomonas paucimobilis ATCC31461:Genes, enzymes andexopolysaccharide production engineering.J Ind Microbiol Biotechnol.29:170-176。Sa-Correia描述了某些基因的部分测序，包括urf32和urf26(=上述的参考文献3的gelM和gelN)。这些基因的完整序列于2003年4月存放于GenBank (GenBank登录号AY242074)。这些基因的功能未有报道。在GenBank递交中，仅分别将基因urf32和urf26指定为推定的膜蛋白和推定的运输蛋白。未存放gell或gelR的序列。Coleman描述了用于丢坦糖胶生物合成的基因的分离和某些基因功能的研究。R.Coleman,2001,Cloning and analysis of Sphingomonas sp.ATCC53159polysaccharidegenes.Master’ s Thesis, San Diego State University。描述了 dpsM 和 dpsN 基因(由Coleman命名为orf3和orf4)，但未指明功能。描述了来自鞘氨醇单胞菌菌株ATCC31554的用于S-88多糖的生物合成的基因簇。Yamazaki M., L Thorne, M.Mikolajczak, R.ff.Armentrout 和 T.J.Pollock.1996.Linkageof genes essential for synthesis of a polysaccharide capsule in Sphingomonasstrain S88.J Bacterioll78:2676_2687 和美国专利第 5，854，034 号。未描述基因 urf32和urf26的功能(dpsM、gelM和dpsN、gelN的同源物)和spsl (gell、dpsl的同源物)。将spsR基因(gelR、dpsR的同源物)描述为编码与细菌和真菌多糖裂解酶大不相似的蛋白。其DNA序列存放于GenBank中(登录号U51197)。本领域仍需要改进制备工业上实用的鞘氨醇胶的方法和改进鞘氨醇胶的性质。
发明内容
本发明提供了一种制备鞘氨醇单胞菌属细菌的方法，所述鞘氨醇单胞菌属细菌含有选自鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因M和N的一种基因或两种基因的突变，所述方法包括:分离鞘氨醇单胞菌属的第一种细菌的基因组D`NA片段，其中所述片段含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因M和/或N的全部或部分；诱导所述片段突变以形成突变的片段；将所述突变的片段导入鞘氨醇单胞菌属的第二种细菌，其中所述第二种细菌含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N ;分离所述第二种细菌的子代，其中所述突变的片段已经整合入基因组并置换所述第二种细菌的鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N。在本发明所述制备鞘氨醇单胞菌属细菌的方法的实施方案中，可通过扩增来分离所述基因组DNA的片段。在本发明方法的实施方案中，可通过合成来分离所述基因组DNA的片段。在本发明方法的实施方案中，可通过由基因组DNA的纯化来分离所述基因组DNA的片段。本发明提供了一种制备鞘氨醇单胞菌属细菌的方法，所述鞘氨醇单胞菌属细菌含有选自鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因M和N的一种基因或两种基因的突变，所述方法包括:分离鞘氨醇单胞菌属的第一种细菌的基因组DNA的两个非连续片段，其中所述片段侧邻或含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因M和/或N ;将所述两个非连续片段连接在一起；将所述连接的非连续片段导入鞘氨醇单胞菌属的第二种细菌，其中所述第二种细菌含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N ;分离所述第二种细菌的子代，其中所述连接片段已经整合入基因组并置换所述第二种细菌的鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N。在本发明所述制备鞘氨醇单胞菌属细菌的方法的实施方案中，可通过扩增来分离所述基因组DNA的片段。在本发明方法的实施方案中，可通过合成来分离所述基因组DNA的片段。在本发明方法的实施方案中，可通过由基因组DNA的纯化来分离所述基因组DNA的片段。本发明提供了一种组合物，其含有丢坦糖胶多糖，所述丢坦糖胶多糖赋予流体对于由菌株ATCC53159产生的等量丢坦糖胶增加的粘度。在本发明的一个实施方案中，所述增加的粘度可以为大于菌株ATCC53159至少30%。在本发明另一个实施方案中，所述增加的粘度可以为大于菌株ATCC53159至少40%。在本发明又一个实施方案中，所述增加的粘度可以为大于菌株ATCC53159至少50%。在本发明再一个实施方案中，所述增加的粘度可以为大于菌株ATCC53159至少60%。在本发明再一个实施方案中，所述增加的粘度可以为大于菌株ATCC53159至少70%。在本发明再一个实施方案中，所述增加的粘度可以为大于菌株ATCC53159至少80 %。在本发明再一个实施方案中，所述增加的粘度可以为大于菌株ATCC53159 至少 90%。本发明提供了一种分离和纯化的鞘氨醇菌属细菌，其含有选自鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因M和N的一种基因或两种基因的缺失。在本发明的一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以是伊乐藻菌种。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以不是伊乐藻菌种。在本发明又一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以是与作为ATCC53159存放的细菌相同的菌种的鞘氨醇单胞菌亚种。在本发明再一个实施方案中，所述鞘氨醇胶多糖可以是丢坦糖胶。在本发明再一个实施方案中，所述鞘氨醇胶多糖可以是吉兰糖胶。在本发明再一个实施方案中，所述鞘氨醇胶多糖可以不是吉兰糖胶。在本发明再一个实施方案中，所述鞘氨醇胶多糖可以是韦兰糖胶。在本发明再一个实施方案中，所述鞘氨醇胶多糖可以是鼠李糖胶。本发明的实施方案还提供了一种培养物发酵液，其含有本段上述的所有细菌，并且已经进行从培养物发酵液中除去细菌的步骤。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以不含有外源性DNA。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以含有一些或全部gelM缺失。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以含有一些或全部gelN缺失。在本发明`另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以含有一些或全部dpsM缺失。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以含有一些或全部dpsN缺失。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以含有一些或全部gelM和gelN缺失。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以含有一些或全部dpsM和dpsN缺失。
本发明提供了一种制备鞘氨醇胶多糖的方法，其包括在适于制备鞘氨醇胶多糖的条件下于培养基中培养含有选自鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因M和N的一种基因或两种基因的缺失的分离和纯化的鞘氨醇菌属细菌，由此在所述培养基中制备鞘氨醇胶多糖。所述方法还可以包括从所述培养基中的细菌分离鞘氨醇胶多糖的步骤。在本发明的一个实施方案中，所述分离步骤可通过离心进行。在本发明另一个实施方案中，所述分离步骤可通过沉降进行。在本发明另一个实施方案中，所述分离步骤可包括使用碱处理培养基。在本发明另一个实施方案中，所述物理分离步骤可包括使用酶处理培养基。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇胶多糖可以是丢坦糖胶。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇胶多糖可以是吉兰糖胶。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇胶多糖可以不是吉兰糖胶。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以是伊乐藻菌种。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以不是伊乐藻菌种。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以是与作为ATCC53159存放的细菌相同的菌种的鞘氨醇单胞菌亚种。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇胶多糖可以是韦兰糖胶。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇胶多糖可以是鼠李糖胶。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以含有一些或全部gelM缺失。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以含有一些或全部gelN缺失。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以含有一些或全部dpsM缺失。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以含有一些或全部dpsN缺失。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以含有一些或全部gelM和gelN缺失。在本发明另一个实施方案中，所述鞘氨醇菌属细菌可以含有一些或全部dpsM和dpsN缺失。本发明提供了一种制备鞘氨醇单胞菌属细菌的方法，所述鞘氨醇单胞菌属含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因I的突变，所述方法包括:分离鞘氨醇单胞菌属的第一种细菌的基因组DNA片段，其中所述片段含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因I的全部或部分；诱导所述片段突变以形成 突变的片段；将所述突变的片段导入鞘氨醇单胞菌属的第二种细菌，其中所述第二种细菌含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的野生型基因I ;分离所述第二种细菌的子代，其中所述突变的片段已经整合入基因组并置换所述第二种细菌的鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的野生型基因I。在本发明所述制备鞘氨醇单胞菌属细菌的方法的实施方案中，可通过扩增来分离所述基因组DNA的片段。在本发明方法的实施方案中，可通过合成来分离所述基因组DNA的片段。在本发明方法的实施方案中，可通过由基因组DNA的纯化来分离所述基因组DNA的片段。本发明提供了一种制备鞘氨醇单胞菌属细菌的方法，所述鞘氨醇单胞菌属细菌含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因I中的突变，所述方法包括:分离鞘氨醇单胞菌属的第一种细菌的基因组DNA片段，其中所述片段侧邻或含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因I ;将所述突变的片段导入鞘氨醇单胞菌属的第二种细菌，其中所述第二种细菌含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的野生型基因I ;分离所述第二种细菌的子代，其中所述片段已经整合入基因组并置换所述第二种细菌的鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的野生型基因I。在本发明所述制备鞘氨醇单胞菌属细菌的方法的实施方案中，可通过扩增来分离所述基因组DNA的片段。在本发明方法的实施方案中，可通过合成来分离所述基因组DNA的片段。在本发明方法的实施方案中，可通过由基因组DNA的纯化来分离所述基因组DNA的片段。本发明提供了一种制备鞘氨醇单胞菌属细菌的方法，所述鞘氨醇单胞菌属含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因R的突变，所述方法包括:分离鞘氨醇单胞菌属的第一种细菌的基因组DNA片段，其中所述片段含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因R的全部或部分；诱导所述片段突变以形成突变的片段；将所述突变的片段导入鞘氨醇单胞菌属的第二种细菌，其中所述第二种细菌含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的野生型基因R ;分离所述第二种细菌的子代，其中所述突变的片段已经整合入基因组并取代所述第二种细菌的鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的野生型基因R。在本发明所述制备鞘氨醇单胞菌属细菌的方法的实施方案中，可通过扩增来分离所述基因组DNA的片段。在本发明方法的实施方案中，可通过合成来分离所述基因组DNA的片段。在本发明方法的实施方案中，可通过由基因组DNA的纯化来分离所述基因组DNA的片段。
本发明提供了一种制备鞘氨醇单胞菌属细菌的方法，所述鞘氨醇单胞菌属细菌含有选自鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因R的一种基因或两种基因的突变，所述方法包括:分离鞘氨醇单胞菌属的第一种细菌的基因组DNA片段，其中所述片段侧邻或含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因R ;将所述片段导入鞘氨醇单胞菌属的第二种细菌，其中所述第二种细菌含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的野生型基因R ;分离所述第二种细菌的子代，其中所述片段已经整合入基因组并取代所述第二种细菌的鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的野生型基因R。在本发明所述制备鞘氨醇单胞菌属细菌的方法的实施方案中，可通过扩增来分离所述基因组DNA的片段。在本发明方法的实施方案中，可通过合成来分离所述基因组DNA的片段。在本发明方法的实施方案中，可通过由基因组DNA的纯化来分离所述基因组DNA的片段。根据本发明的一个实施方案，提供了一种制备细菌的方法。所述细菌是鞘氨醇单胞菌属，并含有选自鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的M、N、I或R基因的一种或多种基因的突变。在某些出版物中(例如参考文献8和9)，所述基因M和N还分别称为urf2、urf26基因(未知的阅读框)。分离了鞘氨醇单胞菌属的第一种细菌的基因组DNA片段。所述片段含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因M和/或N或I或R的全部或部分。诱导所述片段中的片段以形成突变的片段。将所述突变的片段导入鞘氨醇单胞菌属的第二种细菌。所述第二种细菌含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N或I或R。分离了所述第二种细菌的子代，其中突变的片段整合入所述第二种细菌的鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因组并置换的野生型基因M和/或N或I或R。鞘氨醇单胞菌可以是伊乐藻菌(伊乐藻菌)或者不是伊乐藻菌。根据本发明另一个实施方案，提供了制备鞘氨醇单胞菌属细菌的另一种方法，所述鞘氨醇单胞菌属细菌含有选自鞘氨醇多糖生物合成基因簇的基因M、N、I和R的一种或多种基因的突变。分离了鞘氨醇单胞菌属的第一种细菌的基因组DNA的两个非连续片段。所述片段侧邻或包括鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因M和N。相似地，可分离侧邻基因I或R的片段。将所述两个非连续片段连接在一起。将所述连接的非连续片段导入鞘氨醇单胞菌属的第二种细菌。所述第二种细菌含有鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的野生型基因M和/或N或I或R。分离了所述第二种细菌的子代，其中所述连接的片段整合入所述第二种细菌的鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因组并置换野生型基因M和/或N或I或R。鞘氨醇单胞菌可以是伊乐藻菌或者不是伊乐藻菌。根据本发明又一个实施方案，提供了一种组合物。所述组合物含有吉兰糖胶多糖，所述吉兰糖胶多糖赋予改进的流变学性质，包括凝胶强度。根据本发明又一个实施方案，提供了一种组合物。所述组合物含有丢坦糖胶多糖，所述丢坦糖胶多糖赋予液体较由ATCC53159菌株产生的等重的丢坦糖胶增加的粘度。根据本发明又一个实施方案，提供了分离和纯化的鞘氨醇单胞菌属的细菌。所述细菌含有选自鞘氨醇胶多糖生物合成基因簇的基因M、N、I或R的一种或多种基因的突变。所述细菌可以在适于产生鞘氨醇胶多糖的条件下于培养基中培养而在所述培养基中产生鞘氨醇胶多糖。所述细菌的培养物发酵液可以直接或在使用乙醇沉淀之后用作增粘剂或胶凝剂。可选地，所述培养物发酵液可进行下述步骤:在其用作增粘剂或胶凝剂之前从所述培养物发酵液去除细菌或从所述发酵液回收。所述鞘氨醇单胞菌可以是伊乐藻菌或者不是伊乐藻菌。一经阅读该说明书，对本领域技术人员来说显而易见的这些和其他实施方案提供了本领域用于制备增粘剂和胶凝剂的新的方法、菌株以及组合物。附图简述
图1.鞘氨醇单胞菌菌株ATCC31554、ATCC31461和ATCC53159中多糖生物合成的基因簇的比较。图2.S60WTC gelM-gelN突变体的粘液形成特征。图3.S60WTC gelN和gel I突变体的粘液形`成特征。图4.dp SN的缺失位点的DNA序列(SEQ ID NO: 19)，和融合肽的氨基酸序列(SEQID NO:20)。图5A-5C.dp SN突变体的粘液形成特征。图6A-6B.dpsM突变体的粘液形成特征。
具体实施例方式在两种鞘氨醇单胞菌菌株中，已经鉴定了控制多糖附着于细菌细胞的的基因。gelM(dpsM)和gelN(dpsN)任一者或二者的缺失或gell的失活导致多糖作为粘液释放至培养基中而非作为荚膜多糖附着于细胞表面。粘液型多糖的形成使得细菌培养物易于处理，改进了在发酵过程中的混合，可以增加产量，且在某些情况下，改进多糖的流变学性质。定点诱变基于多种原因较随机诱变用于筛选粘液形成突变体更有利，所述多种原因包括速度和无关突变的避免。发现基因gelR的失活可以改进粘液形式的胶凝多糖的流变学性质(凝胶强度)。可以对任何鞘氨醇单胞菌菌株中的dpsM、dpsN、gelM、gelN和gell的直向同源物进行灭活以获得粘液形成表型。可以对gelR的直向同源物进行灭活以防止多糖降解，从而导致改进的流变学性质。合适的鞘氨醇单胞菌包括但不限于产生鼠李糖胶(rhamsan, ATCC31961)、韦兰糖胶(we I an, ATCC31555)、吉兰糖胶(ATCC31461)和丢坦糖胶(ATCC53159)的那些菌株，以及产生多糖的菌株S7 (ATCC21423)、S88 (ATCC31554)、S198(ATCC31853)和 NWl I (ATCC53272)。ATCC 号指美国典型培养物收藏所(AmericanType Culture Collection)的菌株的存放号。这些细菌通过伊乐藻菌ATCC31461和鞘氨醇单胞菌ATCC53159来举例说明，但也可以使用其他菌株。可使用的合适的鞘氨醇单胞菌包括adhaesiva鞘氨醇单胞菌，aerolata鞘氨醇单胞菌，alaskensis鞘氨醇单胞菌，aquatilis鞘氨醇单胞菌，aromaticivorans鞘氨醇单胞菌，asaccharolytica鞘氨醇单胞菌，aurantiaca鞘氨醇单胞菌，荚膜鞘氨醇单胞菌，chlorophenolica鞘氨醇单胞菌，chungbukensis鞘氨醇单胞菌，下水道鞘氨醇单胞菌，海胆鞘氨醇单胞菌，伊乐藻鞘氨醇单胞菌，faeni鞘氨醇单胞菌，herbicidovorans鞘氨醇单胞菌，koreensis鞘氨醇单胞菌，macrogoItabidus鞘氨醇单胞菌，mali鞘氨醇单胞菌，melonis鞘氨醇单胞菌,游泳池鞘氨醇单胞菌，parapaucimobilis鞘氨醇单胞菌，paucimobilis鞘氨醇单胞菌，pituitosa鞘氨醇单胞菌，樱桃鞘氨醇单胞菌，玫瑰鞘氨醇单胞菌，sanguinis鞘氨醇单胞菌，鞘氨醇单胞菌，stygda鞘氨醇单胞菌，subarctica鞘氨醇单胞菌，suberifaciens鞘氨醇单胞菌，地下鞘氨醇单胞菌，taejonensis鞘氨醇单胞菌，terrae鞘氨醇单胞菌，trueperi鞘氨醇单胞菌，ursincola鞘氨醇单胞菌，wittichii鞘氨醇单胞菌，xenophaga鞘氨醇单胞菌，yabuuchiae鞘氨醇单胞菌，以及矢野鞘氨醇单胞菌。可根据基因定位和鞘氨醇胶生物合成基因簇中的结构、根据总的同源性和/或根据结构域同源性鉴定直向同源物。通常，与dpsM、dpsN、gelM、gelN、gell或gelR基因之一的总的同源性的水平将大于44%,常大于55 %、66 %、77 %、88 %或98 %。直向同源物理想地与这四种基因的至少之一具有大于80 %的同源性。定点诱变可用于在所需的已知靶基因或基因组区产生突变。这消除了随机诱导的诱变或自发诱变的试验与误差。缺失的形成确保了突变将不会复原，例如可能在点(替代)突变和插入突变中可见的。缺失也具有不应用外源性DNA的益处，例如药物抗性标记或其他环境不需要的标记。
基因组DNA的分离片段是不连接在正常情况下与其结合的基因组DNA的DNA，其含有鞘氨醇胶生物合成基因簇的M和/或N、I或R或侧邻的DNA。作为非限制性实施例，所分离的DNA可通过由天然来源纯化、通过合成或通过扩增来获得。所分离的DNA通常位于体外的DNA片段上，但是所分离的DNA还可以位于载体上，例如质粒或转导噬菌体，其含有鞘氨醇单胞菌基因组的所需部分。侧邻的DNA通常来自紧邻M和/或N、I或R的约500bp基因或约l_2kb基因内的基因组区。本领域任何已知的方法可用于将突变引入所分离的片段，所述片段含有鞘氨醇胶生物合成基因簇的基因M和/或N、I或R的全部或部分。例如，可使用限制性内切酶和再连接非连续的核苷酸而引入缺失。可通过扩增和连接基因的两个非连续片段或侧邻靶基因的DNA的两个非连续片段来形成缺失。可以使用核酸内切酶消化和连接在所分离的片段中产生插入。化学诱变可用于基因组DNA的分离片段。可选择任何诱变方法并根据具体情况而使用。在诱导突变之后，基因组DNA的片段可再导入受者细菌。通常情况下，但不是一定，受者将是与片段的供者相同的物种。可使用本领域已知的任何方法用于将外源性DNA导入细菌。合适的方法包括但不限于电穿孔、接合、原生质体形成、氯化钙沉淀和转化、脂质体和病毒转导。可根据具体情况选择和使用任何核酸导入方法。如果导入受者细菌中的突变基因组DNA片段不具有复制自身的途径，那么它必须在受者细菌中整合入复制子以得到维护。通常,这种整合事件将整合整个摄入的质粒。可以检测导入的DNA上的标记，以鉴定所述DNA已经整合。为了检测整合的实现，可以筛选或选择所导入的DNA上的标记的丧失。实现该目的的合适的标记为本领域已知，且任何标记可用作此处的指示物。为了确定其中所导入的鞘氨醇胶基因取代了受者的野生型基因的分离株，可通过例如PCR测定DNA的大小或序列。如下文所证明的，通过鞘氨醇胶生物合成基因簇的基因M和/或N产生粘液形式的鞘氨醇胶，突变体可以较附着于细菌细胞上的形式具有改进的流变学性质。所述改进的流变学性质通过相同重量的材料提供更具粘力的能力而得到反映。所述改进可以是轻度的，例如至少5 %、10 %、15 %、20 %或25 %，或其可为更显著的，相对于由形成荚膜的亲代产生的鞘氨醇胶改进至少30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %或90 %。流变学性质可使用本领域已知的任何技术测定。合适的技术包括但不限于自来水溶液中的低切变率粘度(LowShear Rate Viscosity, LSRV),和高盐溶液中的海水粘度(Sea Water Viscosity, SWV)。由例如gelN突变体 产生的粘液形式的吉兰糖胶和推定的裂解酶基因gelR的突变相结合导致高凝胶强度的吉兰糖胶的形成。凝胶强度通常大于1000，而荚膜菌株通常产生凝胶强度为600至900但小于1000的吉兰糖胶。根据本发明的纯化细菌是已经被微生物学纯化的细菌，例如使用液体稀释技术或于固体培养基上划线以形成单菌落。微生物学领域已知的标准技术可用于该目的。根据本发明的突变体可使用用于亲代菌株相同或相似的技术来培养和增殖。所述突变体的液体培养物性质可以得到改进，允许增加通风和混合。所述突变体的培养物发酵液也可以提供较附着形式的多糖具有较高效的回收。另外，所述突变体还可以提供较附着形式的多糖具有改进的澄明度的产物。细菌可任选通过过滤、离心或通过沉降从所述突变体产生的多糖去除。所述培养物发酵液可根据需要在去除细菌之前或之后被化学、酶或温度(热或冷)处理。涉及吉兰糖胶附着于细胞表面的伊乐藻菌ATCC31461的基因为gelM和gelN(图1,SEQ ID NO:13)和gell (图1，SEQ ID NO:25)。已经构建了具有大部分基因gelM和gelN缺失从而产生粘液形成表型的菌株。已经构建了 gelN特定缺失,并构建了基因gell的插入。这两种突变均产生了粘液形成表型。在SEQ ID N0:13中，gelM和gelN的编码序列分别位于核苷酸501-1382和1366-2064。在SEQ ID NO:25中，gell的编码序列分别位于核苷酸501-1403。编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO:26。发现基因gelR的缺失导致粘液形式的吉兰糖胶的凝胶强度改进。在SEQ ID N0:27中，gelR的编码序列分别位于核苷酸478-2457。编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO:28。涉及丢坦糖胶附着于细胞表面的鞘氨醇单胞菌ATCC53159的基因为dpsM和dpsN(图1，SEQ ID NO:14)，并根据与gell的同源性推测dpsl。已经构建了 dpsM和dpsN的各基因的缺失，两者均产生了粘液形成表型。在SEQ ID NO:14中，dpsM和dpsN的编码序列分别位于核苷酸456-1337和1321-2019。编码的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:18和17。对于本领域技术人员来说显而易见的是，用于吉兰糖胶合成的相同或相似的方法也可以用于丢坦糖胶合成。基因dpsl和dpsR的这种突变可容易构建。在SEQ ID NO:29中，dpsl的编码序列分别位于核苷酸501-1472。编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO:30。在SEQ ID NO:31中，dpsR的编码序列分别位于501-2498。编码的氨基酸序列示于SEQ IDN0.32。
上述公开内容大体上描述了本发明。本文所公开的所有参考文献明确地通过引用并入。通过参考本文提供的下述具体实施例，可以获得更完整的理解，所述实施例仅用于说明目的，不意于限制本发明的范围。实施例1—吉兰糖胶粘液形成突变体的制备对于伊乐藻鞘氨醇单胞菌的突变体的构建，使用了名为SeOwtc1的ATCC31461的衍生物，其具有改进的DNA摄取。该菌株可容易地由本领域技术人员制备。PCR扩增用于扩增侧邻基因gelM-gelN的区域。见参考文献3。通过双交换同源性重组，将扩增的片段克隆至pL02载体中并通过接合导入S60wtc中以置换具有缺失的基因组上的基因gelM和gelNo载体pL02不在S60wtc中复制,所以对于卡那霉素抗性的最初选择选择了其中质粒通过同源重组整合入染色体的那些菌落。所述载体还含有基因sacB。该基因赋予了对蔗糖的敏感性。这种对蔗糖的选择性可用于筛选丧失质粒的分离株并保留缺失或野生型基因的一个拷贝。_(1伊乐藻菌ATCC31461具有低的DNA摄取效率，特别是大质粒(约10_7)。分离具有增加的DNA摄取效率的ATCC31461的自发突变体。怀疑这些少数的细胞为成功的质粒受者，例如广泛宿主范围的质粒PLAFR3,表现受者群体具有增加的摄取该质粒DNA能力的突变。为了使得质粒丧失，在非选项性条件下增殖三种含有PLAFR3的转接合子(即无四环素抗生素)，连续传代约30代。检测了三种独立的质粒处理的菌株(即来自每一起始转接合子的四环素敏感性衍生物)，所有三种显示的增加的接合率(4.2X 10_3、0.6X 10_2以及1.5X 10_2)，表现与野生型菌株相比具有IO5倍的增加。该增加的接合率是稳定的且可再生的。这些菌株之一被命名为S60wtc。见参考文献3。)使用提供转移功能的pRK2013，并使用于YM_Sm(25ug/ml)_Km(7.5ug/ml)培养基上选择的转接合子，通过三亲代偶配将含有gelM-gelN缺失区域的质粒导入S60wtc。链霉素防止大肠杆菌菌株的生长。分离卡那霉素抗性质粒整合体。蔗糖敏感性用于选择消除载体的第二重组事件。在非选择性条件下，即无抗生素，将五个分离株传代两次。然后将整分等份铺于含有8%蔗糖的培养基上。分离蔗糖抗性菌落，并检测卡那霉素敏感性。分离基因组DNA，并使用PCR测定哪些Kms分离株保留了缺失。对于缺失的预期大小的扩增片段由四种菌株的基因组DNA产生。于YM培养基上纯化这四种缺失菌株。四种菌株均显示比野生型粘性较小、较软、较平坦且黄色较深。实施例2-gelM-gelN缺失菌株的特征在摇瓶发酵中评价gelM-gelN缺失分离株。与较坚固、粘度较大的S60wtc发酵液相比，Λ gelM-gelN培养物发酵液为液体且光滑。与S60wtc纤维相比，由突变菌株使用异丙醇沉淀产生较长、较厚的纤维。然而，缺失突变体的全部可沉淀物质的产量减少22%，且仅产生30%的野生型的发酵液粘度。所产生的吉兰糖胶具有正常的糖、甘油和乙酰基取代基组成。使用几种技术评价突变体的粘液形成`特征，包括显微镜评价、细胞凝集、细胞沉淀物形成以及热沉降试验，如图2所示。热沉降试验包括在高压灭菌器中加热吉兰糖胶发酵液10分钟以熔化吉兰糖胶，然后将热发酵液转移至大试管中并在95°C过夜培养(以维持发酵液为液体)。对于荚膜菌株，细胞附着多糖并保持悬浮。对于粘液形成菌，细胞未附着多糖并在过夜培养过程中沉降。通过该试验显示gelM-gelN缺失菌株为粘液形成菌株。对于离心试验，在含有I %葡萄糖的DM2培养基中过夜培养菌株并在Eppendorf离心机中以最大速度进行离心。基因gelM-N的失活导致细胞表面多糖的附着完全丧失，使得细胞可通过离心而沉淀。通过显微镜评价,大部分S60wtc Δ gelM_N细胞游离并具有动力，而S60wtc处于树胶基质中。在细胞培养物中，S60wtcAgelM-N细胞在悬浮液中生长，而S60wtc细胞形成凝块。实施例3——吉兰糖胶粘液形成突变体的构建构建了 gelN的缺失用于吉兰糖胶生物合成。将PCR引物设计成扩增gelN基因的上游DNA片段(500bp)和下游DNA片段(40Ibp) [3]。使用的引物示于表I中。表1.用于构建gelN缺失突变体的引物
权利要求
1.一种组合物，其含有丢坦糖胶多糖，所述丢坦糖胶多糖赋予流体对于由菌株ATCC53159产生的等量丢坦糖胶增加的粘度，其中所述丢坦糖胶多糖来自突变体鞘氨醇单胞菌菌株ATCC53159dpsM#l或dpsM#5，所述突变体鞘氨醇单胞菌菌株在dpsM基因中具有缺失突变。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述增加的粘度为大于菌株ATCC53159至少36% -49% ο
3.权利要求1所述的组合物，其中所述突变体鞘氨醇单胞菌菌株是粘液形成鞘氨醇单胞菌菌株。
4.权利要求3所述的组合物，其中所述突变体鞘氨醇单胞菌菌株产生的丢坦糖胶包含与野生型鞘氨醇单胞菌菌株ATCC53159所天然产生的丢坦糖胶相比较长的纤维。
5.权利要求3所述的组合物，其中所述丢坦糖胶是由鞘氨醇单胞菌菌株ATCC53159的变体产生的，其中所述变 体被遗传工程化以消除dpsM基因的表达。
全文摘要
本发明涉及鞘氨醇胶多糖制备领域。更具体地，本发明涉及一种粘液形成突变体鞘氨醇单胞菌菌株，其含有至少一种有利于粘液形式的多糖产生的基因修饰，其中所述突变体鞘氨醇单胞菌菌株含有基因M、基因N或这两个基因中的突变、插入或缺失。
文档编号C07G99/00GK103146034SQ20131004570
公开日2013年6月12日 申请日期2006年2月3日 优先权日2005年2月4日
发明者南茜·E·哈丁, 帕特洛·雅美尼, 拉塞尔·J·科尔曼 申请人:Cp凯尔科美国公司