专利名称：抗her2蛋白单克隆抗体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种抗HER2蛋白的单克隆抗体，产生该抗体的杂交瘤细胞株，以及该抗体的免疫检测用途。
背景技术：
HER2基因又称为ERBB2基因，编码一种具有酪氨酸激酶活性的蛋白，是表皮生长因子受体家族的一个成员，能增强激酶活性，促进细胞的分裂、增殖和转化。HER2基因主要是在人体的胚胎发育时期表达，参与多种组织器官的生长发育，而在成人正常组织中此基因常以单拷贝存在，表达水平较低。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，发病率约10%_15%，病人最后多死于远处转移。HER2基因作为肿瘤发生的癌基因，与乳腺癌的侵袭转移及预后密切相关；在乳腺癌中可见到该基因的异常扩增或过表达，有研究指出在20% 30%的侵袭性乳腺癌患者中有HER2扩增；HER2蛋白的高表达出现在乳腺癌发生的早期阶段。临床前研究发现，HER2的高表达提高了乳腺癌细胞的转移潜能，表现出较多的侵袭性临床病理特征。2003年NCCN乳腺癌诊疗指引已明确建议，对原发性浸润性乳腺癌组织病理学检查中常规进行HER2检测，有助于药物的使用和评估预后。另外，除乳腺癌外，在其他许多上皮来源的肿瘤如卵巢癌和胃癌等肿瘤细胞中，HER2基因也常常有异常扩增或过表达。目前临床上通常通过免疫组织化学病理实验检测肿瘤细胞中HER2蛋白的表达状况，而免疫组化实验的核心为一抗，即可特异性结合HER2蛋白的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性高的抗HER2蛋白的单克隆抗体具有重要的意义
发明内容
本发明要解决的技术问题为提供一种结合特异性较高的抗HER2蛋白的单克隆抗体，产生该抗体的杂交瘤细胞株，及该抗体在制备用于检测HER2蛋白的免疫检测工具中的应用。为解决上述技术问题，本发明提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏日期为2012年11月29日，保藏编号为 CGMCC N0.6908。本发明还提供了一种特异性结合HER2蛋白的单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞株产生。本发明所述单克隆抗体的制备方法如下:(I)重组表达载体的构建:根据HER2基因的ORF全序列(如SEQ ID N0.1所示)设计引物进行PCR扩增，基因两侧分别引入限制性内切酶位点SgfI和Mlul，并在其C末端引入Myc-DDK标签序列(标签序列如SEQ ID N0.2所示),插入表达载体pCMV6_Entry,构建HER2重组表达质粒(简称为pCMV6-HER2)；
(2) HER2重组蛋白的表达与纯化:以pCMV6_HER2质粒转染HEK293T细胞，裂解离心取上清，DDK亲和层析柱纯化，获得纯化的HER2重组蛋白；(3)单抗的筛选与制备:采用上述HER2重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗HER2特异性抗体的杂交瘤细胞株，即为本发明杂交瘤细胞株,其所分泌的抗体亚型鉴定为IgG2a;制备小鼠腹水，通过亲和层析柱纯化HER2单抗。分别通过Western Blot(结果见图3)、免疫组化实验(结果见图4、图5)验证该单抗的灵敏度和特异性。发明人还通过OriGene高密度蛋白芯片验证了上述单克隆抗体的特异性:OriGene高密度蛋白芯片上包含10400种HEK293T细胞蛋白过表达裂解物，每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵,每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。将本发明单克隆抗体与上述芯片杂交并确定阳性信号位点，结果显示:本发明单克隆抗体特异性结合HER2蛋白，与其他蛋白无交叉反应。本发明还提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括上述单克隆抗体；可用于检测组织细胞中HER2蛋白的表达状况。上述免疫组化检测试剂盒，还包括用于免疫组化检测的其它常规试剂；如采用免疫酶标法的免疫组化试剂盒还包括封闭试剂，针对上述单克隆抗体的生物素标记的二抗，酶标抗生物素组分和底物。本发明的另 一个目的在于提供一种上述单克隆抗体在制备用于检测HER2蛋白的免疫检测工具中的应用。所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。本发明还提供了上述单克隆抗体在制备用于诊断HER2相关性肿瘤的病理诊断试剂盒中的应用。由于HER2蛋白的异常表达或扩增与人类多种恶性肿瘤有关，因此使用本发明单克隆抗体检测细胞中HER2蛋白的表达或扩增状况，可用于辅助诊断HER2相关性肿瘤。所述HER2相关性肿瘤为乳腺癌、胃癌、食管癌、大肠癌、膀胱癌、子宫内膜癌、卵巢癌、甲状腺癌或非小细胞肺癌。本发明所述针对HER2的特异性单抗，可与HER2蛋白特异结合，提高了实验的特异性和可靠性，并建立了基于该单克隆抗体的免疫组织化学技术，主要用于乳腺癌、大肠癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、食管癌、非小细胞肺癌等肿瘤的辅助诊断。保藏信息用于保藏的杂交瘤细胞株的科学描述为:抗人Her2单克隆抗体杂交瘤细胞株；保藏单位全称:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位简称:CGMCC ；保藏单位地址:北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期:2012年11月29日；保藏编号:CGMCCN0.6908。
图1为Western blot验证HER2重组质粒在HEK293T细胞中的表达；左边泳道的上样样品为转染PCMV6空载体的HEK293T细胞裂解液，右边泳道的上样样品为转染PCMV6-HER2重组质粒的HEK293T细胞裂解液，杂交所用一抗为抗DDK标签抗体；图2为HER2重组蛋白的SDS-PAGE鉴定图；图3为本发明单克隆抗体在4种不同细胞系中的Western blot结果；图4为以本发明单克隆抗体为一抗，免疫组化法检测膀胱癌组织中HER2蛋白的表达；图5为以本发明单克隆抗体为一抗，免疫组化法检测乳腺癌组织中HER2蛋白的表达;图6为使用origene蛋白芯片对本发明HER2单抗的特异性鉴定图。
具体实施例方式为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例1抗HER-2单克隆抗体的制备一、HER2重组表达质粒的构建以从ATCC获得的质粒BC167147.1 (含SEQ ID N0.1所示HER20RF序列)为模板，设计两条引物并分别引入酶切位点Sgf1、MluI，以及C末端Myc-DDK标签(标签序列如SEQ ID N0.2所示)，并克隆入表达载体pCMV6-Entry，构建HER2重组表达质粒(简称为PCMV6-HER2)。二、HER2重组蛋白的表达与纯化1、转染 HEK293T 细胞HEK293T细胞以1:3传至直径IOcm的细胞培养皿中继续培养；取7.5ml DMEM (无血清及抗生素)培养基至50ml管中，加入300 u IPEI MegaTranl.0混匀，然后加入75 y g上述HER2重组质粒(pCMV6-HER2) DNA混匀并静置30分钟；分别取515 上述混合液至各细胞培养皿中，于37°C、5%C02培养箱中继续培养。转染24小时后，每培养皿细胞添加25 iU2M丁酸钠至终浓度5mM。2、裂解细胞转染48小时后，进行细胞裂解。吸去培养基，加入Iml PBS进行漂洗，吸去PBS。加入Iml裂解缓冲液，使用前加入蛋白酶抑制剂PI和PMSF。置于冰盒中在摇床上振荡，收集所有培养皿中的裂解液，4°C离心，收集上清。3、DDK亲和层析柱纯化
以孔径为0.45 u m,直径为33mm的PVDF膜滤器过滤离心后的裂解液上清并转入15ml管中，加入混合好的Sepharose Beadslml,封口后放入360度混勻器中，于4°C结合2小时；取出15ml管，将裂解液倒入BIO-RAD层析柱中，并接住穿透液，滴尽后穿透液取样WB检测，见图1 (图1显示:HER2重组质粒在HEK293T细胞中正常表达)；以裂解缓冲液冲洗柱料1-2次，滴尽后再用TBST冲洗Beads3次，滴尽后用0.1M Glycine (pH3.5)洗脱，第一次200 yl，滴尽不收集，第二、三次各500 yl，第四次250 yl，收集至一个1.5mlTube中，并迅速加入NaH2PO4 CpH=Il.0)中和至pH7.0左右，每管加入甘油至终浓度为10%，Tween-80至终浓度为0.1%。纯化后HER2重组蛋白用SDS-PAGE鉴定，结果见图2。三、单抗的筛选与制备1、动物免疫:上述纯化的HER2重组蛋白以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄BALB/c小鼠，免疫剂量为50 u g/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50ii g/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。2、细胞融合:骨髓瘤细胞采用BALB/c小鼠来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取上述免疫的小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；免疫小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混合，滴加37°C的50%PEG (PH8.0)lml，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入HAT培养基悬浮混匀，MC定容到50ml，分装到3.5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37°C、5% CO2恒温培养箱中进行培养。3、筛选 和克隆:融合7-10天内挑选细胞克隆，使用上述纯化的HER2重组蛋白进行ELISA测试，标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取0D280阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性；挑取阳性值高的单克隆定株，即为本发明杂交瘤细胞株。4、腹水单抗的制备与纯化:10-12周龄的雄性BALB/c小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，一周后每只小鼠用Iml注射器腹腔注射经PBS洗涤重悬的单克隆细胞悬液，细胞用量为5X106/只，每株抗体打2只小鼠。待小鼠腹水积聚后收集腹水，离心取上清，亲和层析法进行腹水纯化，根据抗体亚型选择相应柱料，本发明杂交瘤细胞株所分泌的抗体亚型为IgG2a，采用protein G进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、分装、冻存在_20°C。以本发明单克隆抗体为一抗，对H印G2、HeLa, A549、MCF7四种细胞系的蛋白裂解液进行杂交、显色，其结果如图3所示，由图3可见:HER2蛋白在HeLa、A549、MCF7细胞中均有表达。实施例2以本发明单克隆抗体为一抗的免疫组化试验1、取膀胱癌或乳腺癌组织进行石蜡包埋，使用Finesse组织切片机进行切片，组织厚度为6 m ;2、脱腊与水化:分析纯二甲苯3次X IOmin,无水乙醇3次X IOmin, 95%乙醇5min,85%乙醇5min, 75%乙醇5min,去离子水浸泡3minX 3次；3、加入抗原修复液(0.01M, pH6.0枸橼酸钠缓冲液)高压锅高压热修复2min，待高压锅温度降至约90°C时，打开高压锅，取出标本，然后自然冷却至室温。去离子水浸泡3minX 3 次。4、使用3%过氧化氢灭活组织内源性过氧化物酶,室温静置lOmin。去离子水浸泡5minX 3 次。5、加上封闭液(PBS+5%脱脂奶粉+5%正常山羊血清)，37°C孵育60min。6、去除封闭液，勿冲洗，加入1:150比例稀释的本发明单克隆抗体；置于湿盒中，37 0C 孵育 60min。PBST(含 0.l%Tween-20 )洗涤 2 次，每次洗涤 5min。PBST(含 0.02%Tween-20 )洗漆I次，每次洗漆5min。7、滴加 Polink-试剂盒 2 (Catlog N0.D37-15)中的试剂 1，37°C孵育 10-20 分钟。使用PBS洗涤3次，每次5min。滴加Pol ink-2试剂盒(Catlog N0.D37-15)中的试剂2，37°C孵育10-20分钟，使用PBS洗涤3次，每次5min。8、应用DAB溶液(中杉金桥ZL1-9019)显色，显色3 10min。蒸馏水洗涤。9、苏木精复染细胞核2min，蒸馏水漂洗，1%盐酸分化。蒸馏水漂洗3次，室温静置lmin。10、脱水和透明:75*% 乙醇 5min, 100% 乙醇 5minX3 次，85% 乙醇乙醇5min, 100%乙醇3X 5min ;二甲苯3X 5min,中性树胶封片。11、镜检，其结果分别见图4、图5。结果:由图4、图5可见，膀胱癌、乳腺癌组织经染色后，可见大量棕黄色颗粒，为HER2蛋白表达阳性细胞；并且，HER2阳性着色定位准确，染色信号强，未发现非特异染色。
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实施例3、本发明单克隆抗体的特异性检测OriGene高密度蛋白芯片上包含10400种HEK293T细胞蛋白过表达裂解物，每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵,每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。以下为使用OriGene蛋白(OriGene Cat PA100001)芯片对本发明单克隆抗体进行特异性鉴定的具体步骤:1、将一张蛋白芯片放在50ml离心管中，使用40ml去离子水浸润芯片，置于摇床上，室温混合30分钟；弃掉去离子水，使用IOmlPBST平衡芯片，室温处理10分钟。2、向50ml离心管中加入40ml5%脱脂牛奶(用PBST进行稀释)置于摇床上，室温封闭30分钟。3、使用封闭液(5%脱脂牛奶)稀释本发明单克隆抗体，稀释比例1:200。4、将洁净的封口膜粘贴到实验台上，滴加250-300 ill上述稀释的单克隆抗体在封口膜上。5、将蛋白芯片从封闭液中抽出，将蛋白芯片NC膜的一面朝下，从芯片的一边接触抗体，慢慢滑下，依靠液体表面张力，抗体将慢慢浸润芯片NC膜，直至整张NC膜浸润在单抗溶液中。整个操作过程避免产生气泡。将芯片移到4度环境下，静置，单抗孵育过夜。在芯片上加盖培养皿盖，其上黏附一张湿纸巾，以防止长时间孵育导致抗体蒸发。6、第二天将芯片移至50ml离心管中，使用PBST漂洗芯片两次，去除多余的抗体。使用40ml PBST (含0.l%Tween-20)洗涤芯片，置于摇床上混合均匀，洗涤三次，每次洗涤5min。7、使用封闭液(5% 脱脂牛奶)稀释二抗 DyLight649_conjugated AffiiniPureFragment Goat-ant1-Mouse IgG,稀释比例为 1:400。8、按照上述步骤4，步骤5进行二抗孵育操作。室温孵育I小时。在芯片上方用铝箔纸遮盖，以防止发生信号漂白。9、按照上述步骤6，使用PBST洗涤芯片。10、使用去离子水冲洗芯片，以去除残余的盐分和变性剂。11、室温干燥芯片，确保芯片完全干燥。
12、使用芯片扫描仪读取荧光信号。13、根据BSA_Cy3以及BSA_Cy5确定芯片方向以及阳性信号的位点。14、根据阳性信号位点找出对应蛋白裂解液ID，根据裂解液数据库信息，查找到对应蛋白名称，NCBI录入号(accession number),蛋白ID,蛋白大小等信息。芯片杂交结果如图6所示:实验组芯片上仅出现一个阳性信号点，对应蛋白为ERBB2 (即HER2蛋白);结论:本发明抗HER2单克隆抗体仅特异性结合HER2蛋白，而与其他蛋白无交叉反应。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保 护范围。
权利要求
1.一种特异性结合HER2蛋白的单克隆抗体，由保藏编号为CGMCC N0.6908的杂交瘤细胞株产生。
2.一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC N0.6908。
3.一种免疫组化检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的单克隆抗体。
4.如权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于检测HER2蛋白的免疫检测工具中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。
6.如权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于诊断HER2相关性肿瘤的试剂盒中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述HER2相关性肿瘤为乳腺癌、胃癌、食管癌、大肠癌、膀 胱癌、子宫内膜癌、卵巢癌、甲状腺癌或非小细胞肺癌。
全文摘要
本发明公开了一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCCNo.6908，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，包括该单克隆抗体的免疫组化试剂盒。本发明还涉及上述单克隆抗体在制备用于检测HER2蛋白的免疫检测工具中的应用，以及上述单克隆抗体在制备用于诊断HER2相关性肿瘤的试剂盒中的应用。本发明所述单克隆抗体可与HER2蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了HER2蛋白免疫检测的特异性和可靠性。
文档编号C07K16/40GK103102414SQ201310043630
公开日2013年5月15日 申请日期2013年2月4日 优先权日2013年2月4日
发明者何为无, 陈坚, 袁克湖, 马东辉, 王超, 方丽, 沈怡, 吴易潘 申请人:无锡傲锐东源生物科技有限公司