一种从马齿苋中提取的活性糖蛋白及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种从马齿苋中提取的活性糖蛋白及其制备方法，所述方法包括以下步骤：首先利用NaCl溶液提取马齿苋中的活性糖蛋白，获得提取液，然后用超滤器对提取液进行浓缩和脱盐，获得浓缩液，再用无水乙醇沉淀，最后冻干，获得所述活性糖蛋白。本发明的有益效果在于：所述方法获得的活性糖蛋白的得率大，纯度高，同时，所述活性糖蛋白与现有技术相比，其抑制氧自由基和清除羟自由基的活性有很大提高。
【专利说明】一种从马齿苋中提取的活性糖蛋白及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及活性糖蛋白的提取，尤其涉及的是一种从马齿苋中提取的活性糖蛋白及其制备方法。
【背景技术】
[0002]马齿苋是一种野生植物，广泛分布在我国大部分地区，其茎和叶可食用，每100g新鲜的马齿苋中含有蛋白质约2.4g，脂肪0.5g，碳水化合物3g，纤维lg，同时还含有Vbl、Vb2、VC、VE、胡萝卜素、黄酮类等有效成分，具有很高的营养价值和药用价值。
[0003]实验证明，马齿苋多糖和糖蛋白都具有较强的抗氧化和清除氧自由基的能力，可用于治疗肠炎、痢疾、阑尾炎、乳腺炎等多种严重疾病，外用可治疗丹毒及毒蛇咬伤，素有“天然抗生素”的美称，同时，马齿苋多糖和糖蛋白还能预防各类肿瘤疾病的发生。现有技术中，对马齿苋多糖的研究很多，但对活性糖蛋白及其提取方法的研究和报道很少，尤其是如何在提高得率和纯度的情况下保证糖蛋白的活性，一直是现有技术中存在的不足之处。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种从马齿苋中提取的活性糖蛋白及其制备方法，该方法提取的活性糖蛋白的得率和纯度最佳。
[0005]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0006]一种从马齿苋中提取活性糖蛋白的方法，包括以下步骤:
[0007](I)取新鲜马齿苋，洗净后，每克马齿苋中加入2ml的NaCl溶液，研磨至浆状，然后在每克马齿苋中再加入8ml的NaCl溶液，搅拌均匀，获得研磨液，其中，所述NaCl溶液的质量百分比为O~6% ；
[0008](2)将上述研磨液搅拌，离心，获得上清和沉淀；
[0009](3)取上述沉淀，每克沉淀中加5ml的NaCl溶液，重复步骤(2)；
[0010](4)重复步骤(3) I~3次，获得上清，合并上清，得到提取液；
[0011](5)利用超滤器对上述提取液进行浓缩、脱盐，当所述提取液的体积减小到原体积五分之一时，即为浓缩液；
[0012](6)将浓缩液中加入无水乙醇，沉淀4小时后离心，获得沉淀，将所述沉淀冻干，得灰白色粉末，即为活性糖蛋白，其中，所述无水乙醇的终浓度的体积百分比为30%~90%，步骤(I)~(6)的整个提取过程的温度在40°C以下。
[0013]优选地，所述步骤(1)中，NaCl溶液的质量百分比为4.5%，活性糖蛋白的得率和纯度随着NaCl溶液的质量百分比的增加而增加，当NaCl溶液的质量百分比为4.5%时，再增加NaCl溶液的浓度，活性糖蛋白的得率和纯度增加不明显，进一步地，当NaCl溶液的浓度的质量百分比超过12%时，活性糖蛋白的纯度下降。
[0014]优选地，所述步骤(2)中，搅拌转速为200rpm，搅拌时间为4小时。
[0015]优选地,所述步骤(2)或步骤(3)中，离心转数为3000rpm,离心时间为20min。[0016]优选地，所述步骤(5)中，超滤器的截流分子量为5000道尔顿。
[0017]优选地,所述步骤(6)中，离心转数为2000rpm,离心时间为20min。
[0018]优选地，所述步骤(6)中，无水乙醇为4~10°C预冷的无水乙醇；一般情况下，活性糖蛋白提取过程中的温度不能超过40°C，若超过40°C，所述活性糖蛋白抑制氧自由基的活性会快速降低，而乙醇和水混合时会产生热效应，因此，本发明中使用4~10°C预冷的无水乙醇沉淀浓缩液，可以保证活性糖蛋白的最大活性。
[0019]优选地，所述步骤(6)中，无水乙醇的终浓度的体积百分比为70% ;—般情况下，沉淀乙醇的浓度越高，则所述活性糖蛋白的得率越高，但纯度却越低，根据所得到的糖蛋白的净量(得率X纯度)计算可知，当无水乙醇的终浓度的体积百分比为70%时，所述的净量最大，即提取的效果最佳。
[0020]一种从马齿苋中提取的活性糖蛋白，其特征在于，所述活性糖蛋白是利用上述任一方法制备获得。
[0021]本发明相比现有技术具有以下优点:本发明提供了一种从马齿苋中提取的活性糖蛋白及其制备方法，该活性糖蛋白具有抑制氧自由基和清除羟自由基的活性，用该方法提取的活性糖蛋白的得率大，纯度高，能最大限度保持所述活性；实验证明，该活性糖蛋白的所述活性与现有技术相比提高了 100倍。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1是NaCl溶液的浓度对马齿苋糖蛋白得率的影响的曲线图；
[0023]图2是NaCl溶液的浓度对马齿苋糖蛋白纯度的影响的曲线图；
[0024]图3是无水乙醇的终浓度对马齿苋糖蛋白得率和纯度的影响的曲线图。
【具体实施方式】
[0025]下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0026]实施例1
[0027]1、提取活性糖蛋白的步骤:
[0028](I)取Ig新鲜马齿苋，洗净后，加入NaCl溶液2ml，研磨至浆状，再补加NaCl溶液8ml，搅拌均匀，获得研磨液；
[0029](2)将上述研磨液于200rpm下搅拌4小时,然后在3000rpm下离心20min,获得上
清和沉淀；
[0030](3)取上述沉淀，称得沉淀质量为0.8g，加入4ml的NaCl溶液，3000rpm下离心20min,获得上清和沉淀；
[0031](4)重复步骤(3)，获得上清，合并上清，得到提取液；
[0032](5)利用超滤器对上述提取液进行浓缩、脱盐，当所述提取液的体积减小到原体积五分之一时，即为浓缩液，其中，所述超滤器的截留分子量为5000道尔顿；
[0033](6)将浓缩液中加入25°C的无水乙醇，沉淀4小时，然后在2000rpm下离心20min，获得沉淀，将所述沉淀冻干，得灰白色粉末，即为活性糖蛋白，所述无水乙醇的终浓度为80%。
[0034]本实施例中，步骤(1)和步骤(3)中NaCl溶液的质量百分比设置为七个梯度小组:0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%。
[0035]2、活性糖蛋白得率的测定:
[0036]称取上述获得的活性糖蛋白的质量，除以新鲜马齿苋的质量，即为所述得率，结果如图1所示，图中可以看出，马齿苋糖蛋白的得率随着NaCl溶液的质量百分比的增加而增加，当NaCl溶液的质量百分比增大到4%时，所述得率的变化趋于平稳。
[0037]3、活性糖蛋白纯度的测定:
[0038]将上述获得的活性糖蛋白进行蛋白质电泳，得到糖蛋白纯度，结果如图2所示，图中可以看出，马齿苋糖蛋白的纯度随着NaCl溶液的质量百分比的增加而增加，当NaCl溶液的质量百分比增大到4%时，所述纯度的变化趋于平稳。[0039]实施例2
[0040]1、提取活性糖蛋白的步骤:
[0041 ] (I)取2g新鲜马齿苋，洗净后，加入NaCl溶液4ml，研磨至浆状，再补加NaCl溶液16ml，搅拌均匀，获得研磨液，所述NaCl溶液的质量百分比为4.5% ；
[0042](2)将上述研磨液于200rpm下搅拌4小时,然后在3000rpm下离心20min,获得上清和沉淀；
[0043](3)取上述沉淀，称得沉淀的质量为1.6g，加入步骤(1)中所述的NaCl溶液8ml，3000rpm下离心20min,获得上清和沉淀；
[0044](4)重复步骤(3) 3次，获得上清，合并上清，得到提取液；
[0045](5)利用超滤器对上述提取液进行浓缩、脱盐，当所述提取液的体积减小到原体积五分之一时，即为浓缩液，其中，所述超滤器的截留分子量为5000道尔顿；
[0046](6)将浓缩液中加入10°C预冷的上述无水乙醇，沉淀4小时，然后在2000rpm下离心20min，获得沉淀，将所述沉淀冻干，得灰白色粉末，即为活性糖蛋白。
[0047]本实施例中，步骤(6)中无水乙醇的终浓度的体积百分比设置为七个梯度小组:30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%。
[0048]2、活性糖蛋白的得率的测定:
[0049]称取获得的活性糖蛋白的质量，除以新鲜马齿苋的质量，即为所述得率，如图3所示，图中可以看出，马齿苋糖蛋白的得率随着无水乙醇的终浓度的增加而增加。
[0050]3、活性糖蛋白的纯度的测定:
[0051]将上述获得的活性糖蛋白进行蛋白质电泳，计算得到糖蛋白纯度，如图3所示，图中可以看出，当无水乙醇的终浓度的体积百分比为70%时，所述马齿苋糖蛋白的纯度最大，过高或过低，纯度都会降低。
[0052]实施例3
[0053]1、活性糖蛋白提取步骤:
[0054](I)取Ig新鲜马齿苋，洗净后，加入4ml的NaCl溶液，研磨至浆状，再补加8ml的NaCl溶液，搅拌均匀，获得研磨液，所述NaCl溶液的质量百分比为4.5% ；
[0055](2)将上述研磨液于200rpm下搅拌4小时,然后在3000rpm下离心20min,获得上清和沉淀；[0056](3)取上述沉淀，称得沉淀的重量为0.7g，加入步骤(1)中所述的NaCl溶液3.5ml,重复步骤(2)，获得上清和沉淀；
[0057](4)重复步骤(3) 2次，获得上清，合并上清，得到提取液；
[0058](5)利用超滤器对上述提取液进行浓缩、脱盐，当所述提取液的体积减小到原体积五分之一时，即为浓缩液，其中，所述超滤器的截留分子量为5000道尔顿；
[0059](6)将浓缩液中加入4°C的无水乙醇，所述无水乙醇的终浓度的体积百分比为70%,沉淀4小时,然后在2000rpm下离心20min,获得沉淀,将所述沉淀冻干,得灰白色粉末，即为活性糖蛋白。
[0060]2、活性糖蛋白与马齿苋多糖抑制氧自由基的活性检测:
[0061]检测方法为邻苯三酚法，检测结果如表1所示。
[0062]3、活性糖蛋白与马齿苋多糖清除羟自由基的活性检测(水杨酸法):
[0063]将获得的活性糖蛋白溶于蒸馏水中，配制成5种不同浓度的受试物溶液，分别为:
0.lmg/ml、0.2mg/ml、0.8mg/ml、lmg/ml、4mg/ml。取 Iml 的 9mmol/L 硫酸亚铁溶液、ImL 的9mmol/L水杨酸-乙醇、Iml受试物溶液,再加入Iml的8.8mmol/L过氧化氢启动整个反应，混匀，370°C水浴反应30min，在510nm下测定吸光度，记作Al ;用蒸馏水代替过氧化氢作为阳性对照，在510nm下测定吸光度，记作A2 ;用蒸馏水代替受试物作为阴性对照，加入过氧化氢启动整个反应，在510nm下测定吸光度，记作A0。实验重复三次，获得不同浓度的受试物溶液对羟基自由基的清除率的标准曲线，根据标准曲线计算获得活性糖蛋白的浓度为5Xl(T2mg/ml时的清除率:
[0064]清除率=[A0-(A1-A2) ]/A0*100%
[0065]同时，用上述方法测定马齿苋多糖的清除率，检测结果如表1所示。
[0066]将实施例3获得的活性糖蛋白与马齿苋多糖的抑制氧自由基和清除羟自由基清除的活性进行比较，结果如下:
[0067]表1:活性糖蛋白与马齿苋多糖的活性比较
【权利要求】
1.一种从马齿苋中提取活性糖蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)取新鲜马齿苋，洗净后，每克马齿苋中加入2ml的NaCl溶液，研磨至浆状，然后在每克马齿苋中再加入8ml的NaCl溶液，搅拌均匀，获得研磨液，其中，所述NaCl溶液的质量百分比为O~6% ； (2)将上述研磨液搅拌，离心，获得上清和沉淀； (3)取上述沉淀，每克沉淀加5ml的NaCl溶液，重复步骤(2)； (4)重复步骤(3)I~3次，获得上清，合并上清，得到提取液； (5)利用超滤器对上述提取液进行浓缩、脱盐，当所述提取液的体积减小到原体积五分之一时，即为浓缩液； (6)将浓缩液中加入无水乙醇，沉淀4小时后离心，获得沉淀，将所述沉淀冻干，得灰白色粉末，即为活性糖蛋白，其中，所述无水乙醇的终浓度的体积百分比为30%~90%，步骤(I)~(6)的整个提取过程的温度在40°C以下。
2.如权利要求1所述的一种从马齿苋中提取活性糖蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(I)中，NaCl溶液的质量百分比为4.5%。
3.如权利要求1所述的一种从马齿苋中提取活性糖蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，搅拌转速为200rpm，搅拌时间为4小时。
4.如权利要求1所述的一种从马齿苋中提取活性糖蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(2)或步骤(3)中，离心转数`为3000rpm,离心时间为20min。
5.如权利要求1所述的一种从马齿苋中提取活性糖蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，超滤器的截流分子量为5000道尔顿。
6.如权利要求1所述的一种从马齿苋中提取活性糖蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(6)中，离心转数为2000rpm,离心时间为20min。
7.如权利要求1所述的一种从马齿苋中提取活性糖蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(6)中，无水乙醇为4~10°C预冷的无水乙醇。
8.如权利要求1所述的一种从马齿苋中提取活性糖蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(6 )中，无水乙醇的终浓度的体积百分比为70%。
9.一种从马齿苋中提取的活性糖蛋白，其特征在于，所述活性糖蛋白是利用权利要求1~8任一方法制备获得。
【文档编号】C07K14/415GK103554237SQ201310477280
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月14日 优先权日:2013年10月14日
【发明者】孙锋, 张宽朝, 阮飞 申请人:安徽农业大学