可辨认感染性普立昂蛋白质的单株抗体及其用途

可辨认感染性普立昂蛋白质的单株抗体及其用途
【专利摘要】本发明是关于可用于特异性辨认感染性普立昂蛋白(PrPSc)的单株抗体，本发明的单株抗体特征在于不需要经过蛋白水解酶的反应，就能够直接特异性地辨认PrPSc蛋白，可提供用来建立一种高特异性及高灵敏度的普立昂疾病检测方法与套组。
【专利说明】可辨认感染性普立昂蛋白质的单株抗体及其用途
【技术领域】
[0001]本发明关于可专一性辨认感染性普立昂蛋白质(scrapie prion protein, PrPsc)的单株抗体，特别地，是关于可与普立昂蛋白质C端以β褶版(Psheet)为主的片段结合的单株抗体，及其用于检测普立昂疾病的用途。
【背景技术】
[0002]普立昂疾病(prion diseases)又称作传染性海绵体脑部病变(Transmissiblespongiform encephalopathies,以下简称TSE),病理特征是在脑部会出现海绵状空洞、神经元细胞死亡、星状细胞增生、组织染色出现淀粉斑块(amyloid plaque);临床特征通常在长时间的潜伏下会出现渐进式的行为、运动失调、痴呆等(Ludlam, C.A.，Lancet351:1289-1290，1998; Soto, C.，Nature reviews Microbiology2:809-819，2004)，虽与其他神经性退化疾病如阿兹海默(Alzheimer disease)、帕金森氏症(Parkinson disease)相似,但是独特的地方在于其具有传染性，会严重影响动物如羊骚痒症(Scrapie)、狂牛症(bovinespongiform encephalopathy,以下简称 BSE),以及人类如库贾氏症(Creutzfeldt-Jakobdisease, CJD)、Gerstmann-Straussler-Scheinker 氏症(GSS)、致死性家族失眠症(Fatalfamilial insomnia, FFI)等。人类的普立昂疾病的致病原因可分为遗传性:GSS、FF1、fCJD ；后天获得:Kuru、iCJD、vCJD ;未知:sCJD，动物则是因为有吃自己同类尸体的习惯，而有传染性紹脑病变(Transmissible mink encephalopathy),及因牛误食羊骚痒症(Scrapie)的羊制成的肉骨粉，而产生的狂牛症(BSE)。 [0003]在公元1986年，英国首次爆发从未出现过造成大量牛只死亡的疾病，即为后来所知的狂牛症(Wells, G.A.，et al., The Veterinary recordl21:419-420，1987),接着几年也开始在其他国家陆续出现案例，造成大规模流行。目前研究显示，BSE的爆发可能是因为在作为牛饲料添加的肉骨粉中，含有大量的羊搔痒症病原所致，这也暗示TSE似乎会跨越种别差异，而造成另一物种的疾病发生，人类的库贾氏病在1920年代初期被发现，为一种相当罕见的疾病，发生率约为每百万人口 0.5~I名病例。此病的病理症状与狂牛症类似。
[0004]过去几年来各国已经确信BSE是严重的问题，目前在病原的鉴定上，主要的检体来源都是“死后”的脑部组织，仅可由严重感染的牛只脑部组织做成乳剂后，以人工接种感染小鼠来证实BSE的病原是可传播感染的；但这类接种感染的方式却最少须150几天的感染期才能证实有无感染成立。而现今WHO及OIE所承认的诊断方法，是以死后检查临床疫情、症状、显微病理变化、免疫组织化学染色技术及西方免疫墨点转溃法等，来作为普立昂疾病的诊断依据(Hardt, M., et al., Journal of comparative pathologyl22:43-53，2000;Ingrosso, L., et al., Trends in molecular medicine8, 273—280，2002)。以下将分别叙述现有常用的几个TSE检测方法:
[0005]1.西方免疫墨点转溃法:原理是依据？冲&被蛋白酶K水解后会产生27~30kDa(PrPres)大小的讯号，将脑组织均质液与蛋白酶K反应后，接着利用单株抗体6H4(抗原决定位:DYEDRYYRE)侦测，此方法的好处是可以减少检测上的错误率，因为相对于用酵素免疫分析法(ELISA)全长PrPG部分没被水解掉进而干扰PrP27_30讯号的现象，此外也可以发现新的PrPse种(strain)。
[0006]2.CEA/BioRad检测:是将脑组织先经过一连串去活性(denaturation)及浓缩步骤后，进行利用两种单株抗体三明治型的酵素免疫分析法。此方法较其他方法的侦测灵敏度高，可到0.5-2.0pmol，但是相对于其他方法，从纯化到浓缩脑组织液需要耗费相对多的时间及人力，也同样有会受到未完全被水解掉的PrPe片段干扰的困扰。
[0007]3.结构依据(conformation dependent)免疫分析:是利用抗体对于原始及变性后的PrP有不同的键结能力，而建立的三明治酵素免疫分析法。抗体会辨认只在PrPse变性后才出现的结构依据抗原决定位(conformational epitope),特别是不用依赖蛋白水解酵素，故对于蛋白酶K敏感的PrPse株(strain)仍旧可以侦测的到，但缺点是相对于其他快速检测方式，其需要较多的处理步骤。
[0008]上述方式都具有潜在性的问题，由于其侦测极限过高(目前具备最低侦测极限的检测方法是CEA/Biorad检测)，而使许多牛只可能处于PrPse潜伏阶段，还未出现任何临床症状，以致所获得的化学检测结果呈现伪阴性(false negative)。另外，类似的情况也会发生在人类，目前对于“活着”的CJD患者的症状出现前(pre-symptom)检测仍旧在发展中，所以同样的问题在于，如果vCJD患者在未知的状态下进行手术、捐赠器官、输血等医疗行为，而鉴于PrPse耐高温、不怕杀菌剂的特性，其一旦附着在手术器具上，便无法清除干净，接着就会发生传染造成医源性(iatrogenic) CJD案例的发生。另外，根据PrPse的特性,检体取得后通常需要经过蛋白水解酶的处理，但是这样的处理会使得原本存在少量的PrPse损失，逃过侦测极限而得到另外一种伪阴性的发生。总结上述，目前仍需要发展一种于临床症状发生前、活体状态下，采取的检体不需要经过蛋白水解酶的处理，而能够直接特异性地辨认PrPsc,并且提升侦测极限的检测方法。
[0009]发展专一结合PrPse结构的抗体，是一直以来研究普立昂疾病的重点，而普立昂蛋白的特点在于，它并不像其他感染性物质如病毒、细菌能够引起强烈的免疫反应，在PrP蛋白正常表达的动物(Prnp+/+)于普立昂疾病发生的过程，因为正常B细胞、T细胞表面即有广泛分布的PrPe,而PrPse的初级结构可能与PrPe相似，使得B细胞有免疫耐受性而没有免疫反应(Bueler, H., et al., Cell73, 1339-1347, 1993;Kascsak, R.J., et al., Journalof virology61:3688, 1987;Prusinerj S.B.,et al., The Journal of infectiousdiseases167:602-613，1993) 0
[0010]这几年来尝试不同策略，但仍旧无法发展出专一性高的辨认PrPse抗体，最早在1997年，Korth的团队利用重组牛蛋白制造出15B3，该抗体虽然可以免疫沉淀牛、小鼠、人类的PrPse而非PrPG，但是在实际应用上却因为其对于普立昂蛋白质相对弱的结合能力，而使其无法实现于临床诊断(Korth，C.，et al.，Nature390:74, 1999)。因此，开始修正采用全长片段(不包含N端)的免疫原策略，制造β褶版为主的重组蛋白、增加酪胺酸(tyrosine)残基，根据不同的物种酪胺酸-酪胺酸-精胺酸(tyrosine-tyrosine-arginine)重复序列设计合成胜肽片段(Paramithiotis, et al.2003),使用羊搔痒症相关纤维丝(scrapie-associated fribril, SAF) (Morel, N., et al., The Journal of biologicalchemistry279:30143-30149, 2004)也生产出能够辨认PrPse的抗体，但之后的实验却发现其仍旧能够辨认PrPG。截至目前，虽然生产出许多的抗PrP抗体能够辨认各种形式的PrP，但是对于纯化原始状态(native)PrPSc;的辨认，仅只剩下微弱的讯号。

【发明内容】

[0011]于是，本发明的一方面，是关于一种特异性辨认感染性普立昂蛋白(PrPSc)的单株抗体，其特征在于与包含普立昂蛋白的胺基酸141-182(SEQ ID N0.1)的肽片段结合。
[0012]于本发明的一具体实施态样，所述的单株抗体可辨识在结构上以β褶版为主的普立昂蛋白。于本发明的一具体实施态样，所述的普立昂蛋白形成β寡聚体。
[0013]于本发明的一些具体实施态样，所述的单株抗体与包含普立昂蛋白的胺基酸141-152 (SEQ ID N0.2)的肽片段结合。于本发明的一些具体实施态样，所述的单株抗体与包含普立昂蛋白的胺基酸171-182 (SEQ ID N0.3)的肽片段结合。
[0014]本发明的另一方面，是关于一种特异性侦测感染性普立昂蛋白(PrPse)的抗体的制造方法，其包含制备一种在结构上以β褶版为主的重组型普立昂蛋白；将所得的重组型普立昂蛋白免疫小鼠产生抗体；及分离及纯化出该抗体。所述的抗体包单株抗体及多株抗体。
[0015]于本发明的一具体实施态样，所述的重组型普立昂蛋白在结构上会自动由α转变成β褶版形式为主，且自动聚合成β寡聚体。于本发明的另一具体实施态样，所述的重组型普立昂蛋白包含Ser-132、Asn-181、Cysl79、Cys-214四个位点的突变。
[0016]本发明的又一方面，是关于一种特异性侦测感染性普立昂蛋白(PrPse)的诊断套组，其特征在于包含本 发明的单株抗体。
[0017]本发明的又另一方面，是关于一种普立昂疾病检测方法，其包含取得脑部组织样本；及利用本发明的单株抗体进行免疫分析，侦测样本中是否存在感染性普立昂蛋白(PrPscO。于本发明的一些具体实施态样，所述的脑部组织样本为脑组织均质液。于本发明的其他具体实施态样，所述的脑部组织样本为脑部组织切片。
[0018]于本发明的一具体实施态样，所述的感染性普立昂蛋白(PrPse)在结构上以β褶版为主的普立昂蛋白。于本发明的另一具体实施态样，所述的感染性普立昂蛋白形成β寡聚体。
【专利附图】

【附图说明】
[0019]图1显示利用ELISA分析(A)及西方墨点法(western blot)分析(B),确认A2、A3、3B融合瘤细胞在HAT培养筛选下抗体的分泌情况。
[0020]图2显示抗-m β PrP单株抗体mAb_A2、A3及3B的抗体异构型分析结果。
[0021]图3显示利用点转溃(dot plot)方式比较单株抗体A.A2、B.A3、C.3B对于不同量的小鼠β PrP和重组牛PrP的辨认差异。
[0022]图4显示以ELISA的方式比较Α2 (A)、A3 (B) R 3Β (C)对于小鼠β PrP及a PrP辨识的差异的结果。
[0023]图5为用胜肽扫描(peptide scan)分析单株抗体抗体抗原决定位序列结果。其中A-C将93-230的小鼠PrP序列分成22段，并将这些胜肽片段覆盖于96免疫酵素分析盘内，进行ELISA分析。D为藉由胜肽扫描所得到抗原决定位，相对抗体的示意图。
[0024]图6为以西方墨点转溃法分析mAb_A2、A3、3B对正常小鼠脑组织均质液及感染性小鼠脑组织均质液的辨识。其中样品包括，有(+)或无(-)经过50 μ g/mL蛋白酶K处理的正常小鼠脑组织均质液，NBH(lane3, 4，7，8，11，12，14，15)，及感染性PrPsc (10%22L)小鼠脑组织均质液(lanel, 2，5，6，9，10 及 13)。
[0025] 图7显示利用实验室自制的三株可辨认PrP的单株抗体_A2、A3、3B对已感染22LPrPse病变的小鼠脑部切片和正常小鼠健康的脑部切片(normal control)进行免疫组织染色，所呈现的结果为小脑区域。免疫前(Pre-1mmune)组是利用BALB/c小鼠免疫前血清，在此作为阴性对照组(Negative control),左侧标示为所使用的抗体,包括免疫前、A2、3B、A3 ;下方标示为显微镜放大倍率，前两栏为感染性小鼠切片，第三栏是正常小鼠脑部切片。
【具体实施方式】
[0026]本发明的其他特色及优点将于下列实施范例中被进一步举例与说明，而该实施范例仅作为辅助说明，并非用于限制本发明的范围。
[0027]根据本发明所呈现的各种实施例，下述各种仪器、装置、方法和其相关结果者，实施例中为了方便读者阅读所使用的标题或副标题，并不被限制在本发明的范围之内。
[0028]实施例1:单株抗体的制造及特性分析
[0029]单株抗体的制造
[0030]首先将小鼠普立昂蛋白的四个位点Ser-132、Asn-181、Cysl79、Cys-214作突变，得到重组小鼠普立昂蛋白，接着以电子顺磁光谱(Electron paramagneticresonance, EPR)、旋光光谱仪(Circular dichroism)进行分析发现,该重组的小鼠普立昂蛋白在低盐pH=7室温的状态下，会自动由α转变成β褶版形式为主，且自动聚合成β寡聚体。因此将所制得会自发性结构转变的小鼠普立昂蛋白，即小鼠PPrP(被认为结构近似于PrP”，做为免疫小鼠的免疫原，制造出独特的单株抗体。
[0031 ] 每只BALB/c小鼠以50 μ g的大肠杆菌生产的重组小鼠普立昂蛋白，结构以β褶版为主(mouse PPrP，简称πιβ PrP)加入IX PBS将体积带大到250ul，并加入250ul完全Freund’s佐剂，在注射筒内混合均匀，以腹腔注射的方式将抗原打入小鼠的体内，接着2周后进行追加注射，每只小鼠再以50 μ g的πιβ PrP加入IXPBS将体积带大到250ul，并加入250ul不完全Freund’s佐剂(Incomplete Freund’s adjuvate)，在注射筒内混合均匀，以腹腔注射的方式将抗原打入小鼠的体内，之后每次追加注射后I周采集血液并分离血清进行酵素免疫分析法，于第5次追加注射后，抽血后分离出血清进行酵素免疫分析法，决定小鼠，准备进行细胞融合。
[0032]施打πιβ PrP重组蛋白过后，会促使脾脏内的B细胞产生特定抗体，与癌化细胞融合行成可在体外培养且具特定抗体的细胞株，本实验利用抗原免疫的小鼠(BABL/c mice)的脾脏与骨髓瘤细胞株NS-1进行融合。接着将细胞培养于HAT培养基(HAT growthmedium)，分装到6个96孔培养盘中，静置7~14天观察细胞生长状况。以3种限制性稀释(快速稀释细胞法，慢速稀释细胞法及细胞计数法)的方式，得到单一母细胞所产生的单株抗体，并以酵素免疫分析法及西方墨点法进行特异性确认。最后我们分别得到3株πιβ PrP单株抗体细胞，Α2、A3及3Β (图1)。
[0033]接着将单株抗体细胞株殖入小鼠腹腔内生长，由腹水取得高浓度的单株抗体。由于单株抗体细胞培养液中的HAT培养基对于小鼠是具有毒性的，所以须将筛选出的单株抗体细胞更换成一般RPMI培养液，才能殖入小鼠体内得到高浓度的单株抗体。之后进行腹水中的单株抗体纯化，将0.5ml蛋白G/A琼脂糖(protein G plus protein A agarose)装到管柱内，以ImllXPBS清洗琼脂糖，将IXPBS等量混合均匀的腹水共6ml加到管柱内，重复流过管柱3~5次，加入5ml的IXPBS清洗琼脂糖，再加入IOml0.5M NaOAC (pH=3)+0.01%迭氮化钠(sodium azide)到管柱，纯化出抗体，重复3-5次,加入2.5ml2M Tris base+0.01%迭氮化钠到第一批纯化抗体，平衡酸碱值；加入5mll0mM甘胺酸(pH=3)+0.01%迭氮化钠到管柱，纯化出抗体，重复3-5次，加入1.25ml2MTris base+0.01%迭氮化钠到第二批纯化出的抗体，平衡酸碱值。取出浓缩离心管，将二批抗体混合，使用浓缩管浓缩至Iml以下，浓度定量后，分装每管100 μ g的量(用于嗜菌体呈现技术)，其余存放在_20°C /_80°C。
[0034]抗-πιβ PrP单株抗体mAb_A2、A3、3B的异构型鉴定
[0035]将2.5μ g/ml免疫球蛋白覆盖在96孔免疫酵素分析盘内，一抗用培养中的融合瘤细胞A2、A3、3B的培养上清液，二抗使用不同免疫球蛋白(结合HRP辨识重链的抗_IgA、IgM、IgGl、IgG2a、IgG2b及IgG3抗体；结合HRP辨识轻链的抗_ κ链及λ链抗体)，测读490波长，可测得单株抗体的免疫球蛋白的重链与轻链。结果显示，本发明所制得的三株mi3PrP单株抗体Α2、Α3及3Β的免疫球蛋白，其重链为IgM，轻链为κ链(参见图2)。
[0036]使用点转溃(dot plot)方法比较单株抗体A2、A3与3B对于不同量的ηιβ PrP和重组牛PrP的辨认差异 [0037]利用点转溃(Dot blot)分析在原始的(native)结构状态下，相同物种的PrP蛋白会以不同的立体结构存在型式，ma PrP是以单体(monomer)存在，mβ PrP则以寡聚合体(oligomer)存在。将 5 μ g、I μ g、0.5 μ g、及 0.I μ g 的 ηιβ PrP 及 m a PrP 点在 PVDF 转溃膜上，接着加入5%牛奶阻断(blocking),使用不同倍率稀释的mAb A2、A3、3B单株抗体反应为一级抗体，以小鼠免疫前的血清作为负对照组，进行反应。结果参见图3。
[0038]由图3A显示,A2单株抗体在10 μ g/ml到50 μ g/ml浓度之间对于ηιβ PrP辨认的极限较好，能够侦测到0.1 μ g的蛋白，但是对于5m a PrP只侦测能到Iyg ;浓度I μ g/ml下的A2单株抗体对于10 μ g m a PrP有微弱的讯号，相对在πιβ PrP则没有。图3Β显示，A3单株抗体在10 μ g/ml到50 μ g/ml浓度之间对于mβ PrP的辨识讯号较对于m a PrP好,尤以星号标示处更为显著，但在抗体浓度I μ g/ml下，其对于该二蛋白的辨识度就无差异。图3C则显示，单株抗体3B在浓度I μ g/ml到20 μ g/ml浓度之间对于5 μ g ηιβ PrP的辨认情形较对于m a PrP的优,且3B单株抗体在浓度50 μ g/ml下,对于0.1 μ g ηιβ PrP的辨认情形比ma PrP好，其他则没有太大的差异。综合上述，mAb A2、A3、3B三个单株抗体对于ma PrP或mPPrP皆能够辨认,而该等单株抗体在10 μ g/ml到50 μ g/ml之浓度间,对于mPPrP的侦测极限较对于m a PrP的好。
[0039]ELISA分析抗-PrP单株抗体A2、A3、3B对于m β PrP及a PrP辨识的差异
[0040]亦进行ELISA分析，将各单株抗体对于不同蛋白的辨认情形以数值方式呈现。将200ng/well的小鼠β PrP、a PrP蛋白各自覆盖于免疫酵素分析盘的孔内，接着加入经不同倍率稀释的mAbs A2、A3、3B单株抗体为第一抗体，二抗为抗-小鼠IgM(l:4000)，进行反应，接着以OPD成色。结果显示，单株抗体A2、A3及3B在I μ g/ml到200 μ g/ml浓度之间，对于πιβ PrP的辨认较对于ma PrP的辨视能力好(参见图4)。在重组蛋白辨识的结果统合包括图1结果，可以知道在蛋白质存在自然(native)型式下，本发明的单株抗体可以辨认另外一个物种(牛)来源的PrP，并且对于单体及寡聚合体有不同的亲和性。
[0041]实施例2:单株抗体的抗原决定位序列分析
[0042]胜肽扫描(peptidescan)分析
[0043]将93-230的mPrP序列分成22段，每段12个胺基酸组成，各有6个胺基酸重复，将这些胜肽片段覆盖于96免疫酵素分析盘内，进行ELISA分析，一抗使用纯化过的A2、A3、3B单株抗体，并利用抗-小鼠IgM结合HRP的多株抗体做为二次抗体。
[0044]利用胜肽扫描结果如图5，发现单株抗体A3的胜肽抗原决定位在141-152GNDWEDRYYREN (SEQ ID N0.2)，而单株抗体A2与3B的抗原决定位则是位在同一位置，171-182QNNFVHDAVCIT(SEQ ID N0.3)。
[0045]嗜菌体呈现技术
[0046]随机挑选经过四次筛选的嗜菌体群落并且抽取其DNA送定序整理结果如下，序列后的括号代表(出现次数/所挑选的全部序列数量)，粗体字代表交叉比对都有出现的序列，统整可能的序列于每个表格最下面一列，底线代表比对回去有的序列。
[0047]抗体:mAb-A2
[0048]
【权利要求】
1.一种特异性辨认感染性普立昂蛋白(PrPse)的单株抗体，其特征在于与具有普立昂蛋白的胺基酸141-182 (SEQ ID N0.1)的肽片段结合。
2.根据权利要求1所述的单株抗体，其特征在于，该单株抗体可辨识在结构上以β褶版为主的普立昂蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的单株抗体，其特征在于，该单株抗体可辨识形成β寡聚体的普立昂蛋白。
4.根据权利要求1所述的单株抗体，其特征在于，该单株抗体的抗原决定位位于普立昂蛋白的胺基酸141-152 (SEQ ID N0.2)。
5.根据权利要求1所述的单株抗体，其特征在于，该单株抗体的抗原决定位位于普立昂蛋白的胺基酸171-182 (SEQ ID N0.3)。
6.一种特异性侦测感染性普立昂蛋白(PrPse)的抗体的制造方法，其特征在于，包含: (a)制备一种在结构上以β褶版为主的重组型普立昂蛋白； (b)将所得的重组型普立昂蛋白免疫小鼠产生抗体；及 (C)分离及纯化出该抗体。
7.根据权利要求6所述的制造方法，其特征在于，该抗体包括单株抗体及多株抗体。
8.根据权利要求6所述的制造方法，其特征在于，该重组型普立昂蛋白在结构上会自动由α转变成β褶版形式为主，且自动聚合成β寡聚体。
9.根据权利要求6所述的制造方法，其特征在于，该重组型普立昂蛋白包含Ser-132、Asn-181、Cysl79、Cys-214 四个位点的突变。
10.一种特异性侦测感染性普立昂蛋白(PrPse)的诊断套组，其特征在于包含根据权利要求I所述的单株抗体。
11.一种普立昂疾病检测方法，其特征在于，包含: (a)取得脑部组织样本；及 (b)利用如权利要求1所述所述的单株抗体进行免疫分析，侦测样本中是否存在感染性普立昂蛋白(PrPsc)。
12.根据权利要求11所述的普立昂疾病检测方法，其特征在于，该脑部组织样本为脑组织均质液。
13.根据权利要求12所述的普立昂疾病检测方法，其特征在于，该免疫分析为西方墨点转溃法。
14.根据权利要求11所述的普立昂疾病检测方法，其特征在于，该脑部组织样本为脑部组织切片。
15.根据权利要求14所述的普立昂疾病检测方法，其特征在于，该免疫分析为免疫组织染色。
16.根据权利要求11所述的普立昂疾病检测方法，其特征在于，该感染性普立昂蛋白(PrPsc)在结构上以β褶版为主的普立昂蛋白。
17.根据权利要求16所述的普立昂疾病检测方法，其特征在于，该感染性普立昂蛋白形成β寡聚体。
【文档编号】C07K16/18GK103897056SQ201310662163
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2013年12月9日 优先权日:2012年12月25日
【发明者】陈宜民, 黄思惟, 林盈妤 申请人:法玛科技顾问股份有限公司