毛尖紫萼藓胁迫响应还原蛋白基因GPOsmC及其编码蛋白的制作方法
【专利摘要】毛尖紫萼藓胁迫响应还原蛋白基因GPOsmC及其编码蛋白，本发明涉及胁迫响应还原蛋白基因及其编码的氨基酸序列。本发明的目的在于提供一种毛尖紫萼藓胁迫响应还原蛋白基因及其编码的氨基酸序列。毛尖紫萼藓胁迫响应还原蛋白基因GPOsmC的基因序列如序列表Seq?ID?No：1所示。毛尖紫萼藓胁迫响应还原蛋白基因GPOsmC编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq?ID?No：2所示。本发明属于分子生物学领域。
【专利说明】毛尖紫萼藓胁迫响应还原蛋白基因GPOsmC及其编码蛋白
【技术领域】
[0001]本发明涉及胁迫响应还原蛋白基因及其编码的氨基酸序列，属于分子生物学领域。
【背景技术】
[0002]干旱灾害具有普遍性、区域性、季节性和持续性的特点，全球旱灾十分严重。据统计，在我国干旱造成的农作物减产已超过其它因素所造成减产的总和。干旱严重影响了植物的生长发育，不仅使其遗传潜力难以发挥，而且限制了植物的广泛分布，同时也使生态环境日益恶化，所以如何提高植物的抗旱能力成为现代研究的热点课题。植物的生长发育与环境的变化密切相关，干旱胁迫是影响植物正常发育的主要胁迫因子。因此，研究植物的耐旱特征、寻找植物抵御干旱胁迫的机制，对植物抗逆遗传研究具有重要意义。
[0003]苔藓植物是最古老的由水生向陆生过渡的植物类群，现存的种类数量仅次于被子植物，广泛分布于世界各地。苔藓植物对逆境环境有很强的适应性，可在干旱、高温等极端气候中生存。毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)属紫萼藓科(Grimmiaceae)紫萼藓属(Grimmia)，生于光照强烈的岩石上或林下石面上，在干燥几分钟后叶片就会卷缩，慢慢进入休眠状态，而复水后瞬间可恢复活力，是典型的小型耐旱藓类。它与其它高等植物不同，该植物结构相对简单，以配子体进行光合作用，而配子体为单倍体，对基因水平上研究其耐性提供了极大的便利。因此，从毛尖紫萼藓中克隆出与抗旱有关的基因，初步研究其潜在的生物学功能，可为深入研究该基因的抗旱相关机理和苔藓植物的耐旱机制提供理论依据，为创造新的抗旱性材料奠定基础。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种毛尖紫萼藓胁迫响应还原蛋白基因及其编码的氨基酸序列。
[0005]毛尖紫寻鲜胁迫响应还原蛋白基因GPOsmC的基因序列如序列表Seq ID No:1所
[0006]毛尖紫考鲜胁迫响应还原蛋白基因GPOsmC编码蛋白的的氣基酸序列如序列表Seq ID No:2 所示。
[0007]发明效果:
[0008]本发明以毛尖紫萼藓为材料，克隆出与抗旱紧密相关的胁迫响应还原蛋白基因，利用转基因技术提高转基因植株耐旱性，研究其基本的生物学特性和功能，为植物基因工程育种提供优良基因资源，同时为改良植物的抗逆性提供物质基础。
[0009]从转基因植株耐旱性鉴定中可以看出，转基因植株的抗旱能力与野生型植株有着较大的区别。通过测定转基因株系和野生型株系在干旱胁迫处理后各项生理指标的动态变化得知，烟草植物体内非常重要的渗透调节物质可溶性蛋白和可溶性糖的含量增加，转基因植株的可溶性蛋白的含量是对照的2.06倍，而转基因植株可溶性糖的含量是对照的2.73倍。干旱胁迫对植物的伤害在很大程度上是通过破坏生物膜的生理功能来引起的，使膜透性增加产生大量的MDA，在干旱20天时转基因植株MDA含量为对照的1.47倍。脯氨酸在受到干旱胁迫时植物体内主动积累参与植物的渗透调节，在干旱20天时转基因植株为对照的3.05倍。以上指标都表明转GpOsmC基因可能通过调节渗透物质的含量提高转基因烟草的抗旱性，以维持其正常的代谢过程。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为实施例中毛尖紫萼藓总RNA图；
[0011]图2为实施例中:V -RACE结果图；其中，M为DNA Marker，I为:V -RACE扩增结果;
[0012]图3为实施例中GPOsmC PCR扩增结果图；其中,M为DNA Marker, I为PCR扩增结果;
[0013]图4为实施例中重组质粒PGpOsmC双酶切结果图；其中，M为DNA Marker，I为GpOsmC酶切产物；
[0014]图5为实施例中重组质粒PR1-GpOsmC双酶切结果图；其中，M为DNA Marker，I为PR1-GpOsmC酶切产物；
[0015]图6为实施例中烟草再生体系建立过程中共培养图；
[0016]图7为实施例中烟草再生体系建立过程中生芽培养图；
[0017]图8为实施例中烟草再生体系建立过程中伸长培养图；
[0018]图9为实施例中烟草再生体系建立过程中生根培养图；
[0019]图10为实施例中烟草再生体系建立过程中室外培养图；
[0020]图11为实施例中转基因烟草T1 RPCR结果图；其中，M:DNA Marker ; 1-15:转化植株；16:纯水对照；CK-:非转化植株；
[0021]图12为实施例中转基因烟草T1 RRT-PCR结果图；其中，M:DNA Marker ; 1-15:转化植株；16:纯水对照；CK-:非转化植株；
[0022]图13为实施例中干旱胁迫对土壤含水量的影响图；其中，A:转基因烟草土壤水分含量；B:野生型烟草土壤水分含量；
[0023]图14为实施例中干旱胁迫对1\代烟草可溶性蛋白含量的影响图；其中，A:转基因烟草可溶性蛋白含量变化；B:野生型烟草可溶性蛋白含量变化；C:未处理野生型烟草可溶性蛋白含量变化；
[0024]图15为实施例中干旱胁迫对T1代烟草可溶性糖含量的影响图；其中，A:转基因烟草可溶性糖含量变化；B:野生型烟草可溶性糖含量变化；C:未处理野生型烟草可溶性糖含量变化；
[0025]图16为实施例中干旱胁迫对1\代烟草丙二醛含量的影响图；其中，A:转基因烟草丙二醛含量变化；B:野生型烟草丙二醛含量变化；C:未处理野生型烟草丙二醛含量变化；
[0026]图17为实施例中干旱胁迫对1\代烟草脯氨酸含量的影响图；其中，A:转基因烟草脯氨酸含量变化；B:野生型烟草脯氨酸含量变化；C:未处理野生型烟草脯氨酸含量变化。
【具体实施方式】[0027]【具体实施方式】一:本实施方式的毛尖紫萼藓胁迫响应还原蛋白基因GPOsmC的基因序列如序列表Seq ID No: 1所不。
[0028]【具体实施方式】二:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:毛尖紫萼藓胁迫响应还原蛋白基因GPOsmC编码蛋白的的氣基酸序列如序列表Seq ID No:2所不。
[0029]其它步骤及参数与【具体实施方式】一相同。
[0030]本实施方式效果:
[0031]本实施方式以毛尖紫萼藓为材料，克隆出与抗旱紧密相关的胁迫响应还原蛋白基因，
[0032]利用转基因技术提高转基因植株耐旱性，研究其基本的生物学特性和功能，为植物基因工程育种提供优良基因资源，同时为改良植物的抗逆性提供物质基础。
[0033]从转基因植株耐旱性鉴定中可以看出，转基因植株的抗旱能力与野生型植株有着较大的区别。通过测定转基因株系和野生型株系在干旱胁迫处理后各项生理指标的动态变化得知，烟草植物体内非常重要的渗透调节物质可溶性蛋白和可溶性糖的含量增加，转基因植株的可溶性蛋白的含量是对照的2.06倍，而转基因植株可溶性糖的含量是对照的
2.73倍。干旱胁迫对植物的伤害在很大程度上是通过破坏生物膜的生理功能来引起的，使膜透性增加产生大量的MDA，在干旱20天时转基因植株MDA含量为对照的1.47倍。脯氨酸在受到干旱胁迫时植物体内主动积累参与植物的渗透调节，在干旱20天时转基因植株为对照的3.05倍。以上指标都表明转GpOsmC基因可能通过调节渗透物质的含量提高转基因烟草的抗旱性，以维持其正常的代谢过程。
[0034]实施例:
[0035]一、GpOsmC基因的克隆
[0036]1、以毛尖紫萼藓为材料，采用改良的SDS法提取总RNA。
[0037](I)取0.3g毛尖紫萼藓于液氮中快速研磨成粉末状，转至1.5mL离心管中，加入750 μ LSDS, 350 μ L Tris 饱和酚，350 μ L 氯仿，震荡 IOmin, 4°C 12000rpm 离心 IOmin ；
[0038]SDS配方:2 % SDS, 0.0125mol/L 四硼酸钠，50mmol/L Tris-Cl，200mmol/L氯化钠，20mmol/L EDTA ；
[0039](2)取上清,分别加入350 μ L Tris饱和酹和氯仿,震荡IOmin, 4°C 12000rpm离心IOmin ；
[0040](3)重复步骤2 —次；
[0041](4)取上清,加入等体积氯仿,震荡IOmin, 4°C 12000rpm离心IOmin ；
[0042](5)取上清，加入1/2体积的8mmol/L LiCl，1/2体积75 %乙醇，于-20°C沉降Ih ；
[0043](6) 4°C 12000rpm离心20min，弃上清，用600 μ L75 %乙醇洗涤沉淀2次，冰浴晾干;
[0044](7)加适量DEPC处理水溶解沉淀，用I %琼脂糖凝胶电泳检查其完整性，检测结果如图1所示。
[0045]2、以RNA为模板，按照Promega公司M-MLV反转录酶说明书对2 μ g总RNA进行逆转录，合成cDNA第一链。
[0046]3、基因克隆
[0047]从毛尖紫萼藓干旱cDNA文库中获得的GpOsmC基因长为595bp，经NCBI Blast验证只有完整的Y端，无:V端，故设计:r -RACE引物GpOsmC-GSP和GpOsmC-NGSP，分别与通用引物UMP进行2轮PCR，进行3 ' -RACE扩增，操作步骤按SMART_ER?RACEcDNAAmplification Kit (Clontech)试剂盒说明书进行。将目的条带进行胶回收，回收产物与PMD-18T Simple Vector连接，转化到大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，筛选阳性克隆并测序。测序后得到658bp的特异性条带。如图2和3所示(图2为:V -RACE扩增结果；图3为PCR扩增结果)。
[0048]毛尖紫萼藓胁迫响应还原蛋白基因GPOsmC制备过程中设计的上游引物Y -RACE特异上游引物GPOsmC如序列表SEQ ID N0.3所示；
[0049]毛尖紫萼藓胁迫响应还原蛋白基因GPOsmC制备过程中设计的下游引物3' -RACE特异下游引物GPOsmC如序列表SEQ ID N0.4所示；
[0050]通用引物UMP核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.5所示；
[0051]全长验证引物上游GPOsmC-F引物核苷酸序列通用引物UMP核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.6 所示；
[0052]全长验证引物下游GPOsmC-R引物核苷酸序列通用引物UMP核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.7 所示；
[0053]二、含有目的基因GpOsmC表达载体的构建
[0054]1、提取含有GpOsmC基因的T载体质粒，用Nde I和BamH I双酶切将该基因从T载体上切下，获得带有粘性末端的GpOsmC基因的cDNA片段。结果如图4所示(泳道M为Marker2000，泳道1_2为PGpOsmC酶切产物)克隆载体双酶切反应体系如表1所示:
【权利要求】
1.毛尖紫萼藓胁迫响应还原蛋白基因GPOsmC，其特征在于毛尖紫萼藓胁迫响应还原蛋白基因GPOsmC的基因序列如序列表Seq ID No:I所不。
2.毛尖紫萼藓胁迫响应还原蛋白基因GPOsmC的编码蛋白，其特征在于所述的毛尖紫等鲜胁迫响应还原蛋白基因GPOsmC编码蛋白的氣基酸序列如序列表Seq ID No:2所不。
【文档编号】C07K14/415GK103627713SQ201310703539
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年12月19日 优先权日:2013年12月19日
【发明者】沙伟, 刘博 , 张梅娟, 安洪雪, 宋璐 申请人:齐齐哈尔大学