一个棉花长纤维高表达基因（GhLFHE1）及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种分离的棉花长纤维高表达基因GhLFHE1、含有所述基因的表达载体、宿主和转化体以及所述基因在制备转基因植物中的应用，所述GhLFHE1基因可促进棉花纤维伸长，提高棉花纤维长度，增加纤维品质和产量，可用于改良棉花品种。
【专利说明】一个棉花长纤维高表达基因(GhLFHEI)及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程领域，具体地说，涉及一种棉花长纤维高表达基因及其应用。
【背景技术】
[0002]棉花是世界上主要的纤维作物之一。棉花纤维细胞是棉花胚珠外珠被表皮细胞经分化突起和极性伸长而成的单细胞。其生长发育过程分为四个既明显区分又有所重叠的时期:纤维细胞起始期、纤维细胞伸长期、次生壁增厚期和脱水成熟期。每个时期都有各自的特点，但相邻发育时期又有所重叠。纤维发育的每个时期对纤维的产量和/或品质都有影响，纤维的分化起始决定了单粒胚珠中纤维的数量，纤维细胞伸长速率和持续时间主要决定了纤维的长度，次生壁沉积的方式和持续时间主要决定了成熟纤维的强度和次生壁厚度。纤维伸长期是(初生壁合成期)从开花当天开始，可以持续到开花后25天(2OTPA)，主要进行细胞极性伸长和初生细胞壁的合成，这时期的纤维伸长速率和持续时间决定纤维的最终长度，陆地棉纤维长径比可达1000-3000。但迄今为止，我们对调控其发育过程的分子机制仍知之甚少。
[0003]棉花ligon lintless-1 (li_l)突变体是棉花栽培种TM-1的一个自然突变体，该突变体具有极短的纤维，而纤维细胞的分化和起始与野生型没有明显差异，因此I1-1突变体是研究纤维细胞伸长的良好材料。利用2-DE和本地化EST数据库支持的MS/MS技术，zhao等人在I1-1和TM-1的12DPA纤维细胞中发现81个差异表达的蛋白质，而在6DPA纤维中没有发现明显的差异表达蛋白(Zhao PM, Wang LL, Han LB, WangJ, Yao Y，Wang HY, DuXM, Luo YM, Xia GX(2010)Proteomic identification of differentially expressedproteins in the Ligon lintless mutant of upland cotton (Gossypium hirsutumL.).J.Proteome Res9:1076-1087)。但是2-DE技术难以检测低丰度蛋白质，因此可能漏检对纤维伸长有重要调控作用的蛋白。Liu等人通过转录组分析证实，有577个转录本在6DPA的I1-1和TM-1纤维中差异表达，而在O`DPA胚珠和3DPA纤维中仅有少许基因的差异表达(Liu K，Sun J, Yao LY, Yuan YL(2012)Transcriptome analysis reveals critical genesand key pathways for early cotton fiber elongation in Ligon lintless—lmutant.GenomicslOO:42-50)o这些结果说明突变体的纤维变短的确与纤维伸长期相关基因的表达变化有密切关系。
[0004]油菜素类固醇(Brassinosteroids, BRs)是广泛存在于植物体中的一类具有类似于动物留醇结构的激素。油菜素类固醇在植物生长发育的许多生理过程中都具有重要的作用，而且浓度极低(nmol ? L-1)的油菜素类固醇就能表现出极高的生理活性，因此油菜素类固醇被认为是继生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸和乙烯之后的第六大植物激素。近年来研究表明外施BRs改善棉花纤维产量和品质，Kasukabe (Y.Kasukabe, Y.Fujisawa, K.Nishiguchi, S.Maekawa, Y.Allen,R, Dale, Production of Cotton Fiberwith Improved Fiber Characteristics, (2001)United States Patent Applicationnumber20010018773)报道大田施用油菜素内酯(Brassinolide, BL), 一种生物活性最高的BRs，可以使纤维长度提高6.1%，纤维强度提高9.5% ;在棉花胚珠离体培养体系中，BL处理的Coker312纤维长度比对照增加30%_38%，BL处理的I1-1突变体纤维长度比对照增加16.5%，处理胚珠的纤维重量平均增加26.1%。这些结果表明，使用BL不仅可以增加棉花纤维的长度，提高纤维的强度，而且可以增加纤维的产量。国内棉花生产上大面积推广使用BL (如棉花专用云大120)也证明了 BL对棉纤维产量和品质的作用。最近的报道显示不仅施用BL可以促进纤维的生长，相反，施用BRs合成抑制剂(BZR220)可以阻止纤维细胞的发育(Y.Sun, M.Fokar, T.Asami, S.Yoshida, R.D.Allen.(2004) Characterization of theBrassinosteroid insensitivelgenes of cotton, PlantMol.Biol.54:221-232 ；Y.Sun, S.Veerabomma, H.A.Abdel-Mageed, M.Fokar, T.Asami, S.Yoshida, and R.D.Allen.(2005)Brassinosteroid Regulates Fiber Development on Cultured Cotton Ovules, PlantCell Physiology46:1384-1391 ；M.Luo, Y.H.Xiao, X.B.Li, X.F.Lu, ff.Deng, D.M.Li, L.Hou, M.Y.Hu, Y.Li, Y.Pe1.(2007) GhDET2, a steroid5 a -reductase, plays an importantrole in cotton fiber cell initiation and elongation, Plant J.51:419-430),再次证明BRs在棉花纤维起始和伸长中具有重要作用。
[0005]由于BRs在植物体内具有复杂的合成途径和较多的具有生物活性的中间产物，相关的合成酶基因和相应的产物在棉花纤维发育过程中是否有作用和作用如何还不清楚。为了探索I1-1突变体纤维细胞伸长受阻的机理，我们根据拟南芥中BRs生物合成酶的蛋白质序列搜索到高同源性的棉花EST序列，进而以此序列设计用于基因表达分析的引物，利用实时定量RT-PCR技术检测了棉花中相关基因在野生型TM-1和突变体I1-1的ODPA胚珠(含纤维)、6DPA胚珠(含纤维)、IODPA纤维和IODPA胚珠中的表达差异。超短纤维突变体li_l和其野生型TM-1是一对近等基因系，在两者纤维细胞的相同发育时期出现的差异表达基因很可能与纤维细胞的伸长有密切关系。而且IODPA时期是棉花纤维细胞的快速伸长期，这个时期差异表达的基因极有可能参与了纤维细胞的伸长发育。
【发明内容】
[0006]本发明的一个目的 在于提供一种在长纤维(相对于突变体的超短纤维)生长的快速伸长期高表达的基因(Long Fiber High ￡xpressionl)GhLFHEl,其具有以下核苷酸序列之一:
[0007](I)如 SEQ ID N0.1 所示的 cDNA 序列；或
[0008](2)如 SEQ ID N0.2 所示的 gDNA 序列。
[0009]本发明还提供了由上述基因编码的蛋白质，其具有以下氨基酸序列之一:
[0010](I)如SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列；或
[0011](2)SEQ ID N0.3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID N0.3的氨基酸序列相同生物活性的由SEQ ID N0.3衍生的氨基酸序列。
[0012]进一步地，本发明还提供了含有上述基因的表达载体；所述表达载体为植物表达载体，且至少含有增强型、组成型和或诱导型启动子。
[0013]更进一步地，本发明所述表达载体具有选自如图5、图6或图7所示的结构。
[0014]本发明还提供了含有本发明所述表达载体的宿主细胞或转化体。[0015]本发明的又一个目的是提供一种超量或抑制GhLFHEl表达的转基因植物的制备方法，包括以下步骤:
[0016]I)将GhLFHEl基因与启动子可操作地连接；
[0017]2)构建含有GhLFHEl基因与启动子的植物表达载体；
[0018]3)用所述植物表达载体转化宿主，获得转化体；
[0019]4)用所述转化体转化植物，获得转基因植物。
[0020]本发明的再一个目的是提供所述GhLFHEl基因在棉花品种改良中的应用，利用基因工程手段，应用所述GhLFHEl基因来促进棉花纤维伸长，提高棉花纤维长度，增加纤维品
质和产量。
[0021]本发明的再一个目的是提供所述GhLFHEl基因在制备转基因棉花中的应用。
[0022]SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列为编码棉花GhLFHEI基因的cDNA序列，SEQIDN0.2所示的核苷酸序列gGhLFHEl为gDNA (基因组DNA)序列。其中所述cDNA序列包含5’ -非翻译区序列、开放阅读框(ORF)序列和3’ -非翻译区序列，其中开放阅读框序列为编码序列，gDNA序列含有外显子和内含子序列。
[0023]由上述GhLFHEl基因编码的蛋白质，其具有SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列，本领域技术人员可以理解的是，将SEQ ID N0.3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID N0.3的氨基酸残基序列相同生物活性的由SEQ IDN0.3衍生的蛋白质序列也`同样属于上述范围。
[0024]根据本发明的另一方面，提供的植物表达载体，其至少含编码GhLFHEl基因的核苷酸和启动子序列，所述植物表达载体通过将编码GhLFHEl基因、启动子序列与植物表达载体可操作地连接而构建。为了筛选和表达的需要，还可选地在表达载体中包含筛选基因序列、报告基因序列以及其它的为基因工程操作的需要而插入的各种内切酶位点，筛选基因和报告基因可以从本领域常用的基因序列中选择，优选地，本发明的植物表达具有如图5所示的结构。例如，可以在所述表达载体中加入在植物中能表达的编码可发生颜色变化的酶或发光化合物的基因，如GUS基因、GFP基因、荧光素酶等；具有抗性的抗生素标记物，如抗庆大霉素标记物、抗卡拉霉素标记物等；抗化学试剂标记基因，如抗除草剂基因等。
[0025]用于构建本发明植物表达载体的启动子可以是任意一种启动子，包括增强型、组成型、组织特异型以及诱导型启动子。构建表达载体时，所述启动子可以单独使用，还可以和其它植物启动子结合使用。用于构建本发明植物表达载体的启动子优选组成型启动子或组织特异性启动子，更优选来源于花椰菜花叶病毒的植物组成型启动子CaMV35S。通常，将GhLFHEl基因构建在CaMV35S的下游。
[0026]用于构建本发明植物表达载体的出发载体可以是任意一种双兀农杆菌载体或者可用于基因枪转化的植物表达载体。
[0027]在本发明的一种具体实施方案中，将GhLFHEl基因正向插入植物表达载体pCambia-35S-N0S中，用CaMV35S启动子启动表达，构建了含有GhLFHEl基因的植物表达载体pCambia-35S-GhLFHEl-N0S，其具有如图6所示的结构，该表达载体同时包含了报告基因序列，筛选基因序列和用于基因操作的各内切酶位点，本领域技术人员可以理解的是，上述报告基因、筛选基因和各基因操作序列均是可以替换的，本发明并不对此进行限制。
[0028]在本发明的一种具体实施方案中，将GhLFHEl基因反向插入植物表达载体pCambia-35S-N0S中，用CaMV35S启动子启动表达，构建了含有GhLFHEl基因的植物表达载体pCambia-35S-antisense GhLFHEl-NOS，其具有如图7所示的结构，该表达载体同时包含了报告基因序列，筛选基因序列和用于基因操作的各内切酶位点，本领域技术人员可以理解的是，上述报告基因、筛选基因和各基因操作序列均是可以替换的，本发明并不对此进行限制。
[0029]根据本发明的另一方面，提供一种转化体，通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物或微生物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导或农杆菌介导等常规生物学方法，将含有本发明GhLFHEl基因的表达载体转染棉花而获得转化体。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1 =GhLFHEl基因在TM-1和超短纤维突变体li_l纤维和胚珠中的表达。TM-1:陆地棉野生型；li_l:超短纤维突变体；F0-0DPA:开花当天的胚珠纤维；F0-6DPA:开花后6天的胚珠纤维；F-10DPA:开花后10天的纤维细胞；0-10DPA:开花后10天的胚珠。
[0031]图2 =GhLFHEl蛋白质与其他物种相关蛋白质的同源性比较。
[0032]E0X90957:可可(Theobroma cacao)细胞色素 P4S0 超家族蛋白；EEE90728:杨树(Populus trichocarpa)Rotundifolia3(R0T3)蛋白；XP00252150:蓖麻(Ricinuscommunis)细胞色素 P450 蛋白;ESR38835:柑橘(Citrus Clementina)假拟蛋白。
[0033]图3 =GhLFHEl 的进化树分析。E0X90957:可可(Theobroma cacao)细胞色素 P450 超家族蛋白；EEE90728:杨树(Populus trichocarpa) Rotundifolia3 (R0T3)蛋白；XP002 521504:蓖麻(Ricinus communis)细胞色素 P450 蛋白；ESR38835:柑橘(Citrusclementina)假拟蛋白；EMJ03167:桃(Prunus persica)假拟蛋白；XP002457181:高梁(Sorghum bicolor)假拟蛋白；BAF56241:豌豆(Pisum sativum)细胞色素 P450蛋白；XP003538868:大豆(Glycine max) 3-表-6-脱氧长春花甾酮23-单加氧酶；XP002267958:葡萄(Vitis vinifera) 3-表-6-脱氧长春花留酮23-单加氧酶；NP_568002:拟南芥(Arabidopsis thaliana) 3-表-6-脱氧长春花留酮23-单加氧酶；XP_004232446:番爺(Solanum Iycopersicum) 3-表-6-脱氧长春花甾酮 23-单加氧酶。
[0034]图4 =GhLFHEl基因的表达分析。其中A =GhLFHEl基因在不同组织和器官中的表达模式；B =GhLFHEl基因在纤维细胞和胚珠不同发育时期的表达水平；C =GhLFHEl基因的表达水平受BL反馈调节。6DPA-20DPA:开花后6天的纤维或胚珠至开花后20天的纤维或胚珠。Mock:模拟处理；BRZ220:BRs合成抑制剂BRZ220 ；BL:油菜素内酯。
[0035]图5:含GhLFHEl基因的植物表达载体的结构图，其中35S代表CaMV35S启动子；GhLFHEl代表GhLFHEl基因cDNA ；term代表终止子；LB代表T-DNA左边界；RB代表T-DNA右边界。
[0036]图6:本发明优选的植物表达载体pCambia-35S-GhLFHEl_N0S结构图。其中GRP-GusPlus-His6代表⑶SPlus报告基因，该基因在N端融合了 GRP信号肽，在C端融合了 His6序列标签；NPTII代表新霉素磷酸转移酶基因，具有卡拉霉素抗性；N0Sterm:Nos终止子；35S:来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；LB:T-DNA左边界；RB:T_DNA右边界。植物表达载体为改造的pCambia载体(详见实施例二)。
[0037]图7:本发明优选的反义抑制GhLFHEl基因植物表达载体pCambia-35S-antisenseGhLFHEl-N0S 结构图。其中 GRP-GusPlus_His6 代表⑶SPlus 报告基因，该基因在N端融合了 GRP信号肽，在C端融合了 His6序列标签；NPTII代表新霉素磷酸转移酶基因，具有卡拉霉素抗性；Nosterm:Nos终止子；35S:来源于花椰菜花叶病毒的植物组成性启动子；LB:T-DNA左边界；RB:T_DNA右边界。植物表达载体为改造的pCambia载体(详见实施例二 )。
[0038]图8:转基因棉花的鉴定。其中A:转基因棉花的组织化学鉴定，CK:非转基因棉花(野生型)，作对照；0E1和0E2:超量表达GhLFHEl转基因棉花1#和2# ；SE1和SE2:反义抑制GhLFHEl转基因棉花1#和2#。B:超量表达GhLFHEl转基因棉花的扩增验证，M =DNAmarker2000 ；CK:非转基因棉花(野生型)，作阴性对照；_:以水为PCR扩增模板，作空白对照；+:以pC-GhLFHEl质粒为PCR扩增模板，作阳性对照；0E1~0E5:超量表达GhLFHEl转基因棉花1#~5#。C:反义抑制GhLFHEl转基因棉花的扩增验证，M:DNA marker2000 ；-:以水为PCR扩增模板，作空白对照；+:以pC-AGhLFHEl质粒为PCR扩增模板，作阳性对照；SEl~SE5:反义抑制GhLFHEl转基因棉花1#~5#。
[0039]图9:转基因棉花中GhLFHEl基因的表达分析。其中A:超量表达GhLFHEl转基因棉花的表达分析，CK:非转基因棉花(野生型)；0E1~0E9:超量表达GhLFHEl转基因棉花1#~9#。B:反义抑制GhLFHEl转基因棉花的表达分析，CK:非转基因棉花(野生型);SEl~SE4:反义抑制GhLFHEl转基因棉花1#~4#。
[0040]图10:超量表达GhLFHEl基因对棉花植株生长发育的影响。其中A:非转基因棉花(野生型)和超量表达GhLFHEl转基因棉花植株的生长状况；B:花器官发育比较；C:棉花幼苗，示侧根的发育；D:果实大小和果柄长度比较；E:种子大小比较。CK:非转基因棉花(野生型)；0E:超量表达GhLFHEl转基因棉花；标尺=lcm。
[0041]图11:超量表`达GhLFHEl基因对棉花生长影响的统计数据。其中A:果柄长度；B:侧根总长；C:种子百粒重；CK:非转基因棉花(野生型)；0E:超量表达GhLFHEl转基因棉花。
表示与CK差异显著(P < 0.05)，“**”表示与CK差异极显著(P < 0.01)，用t测验计
算显著性差异。
[0042]图12:反义抑制GhLFHEl对棉花生长发育的影响。其中A:非转基因棉花(野生型)和反义抑制GhLFHEl转基因棉花植株的生长状况；B:花器官发育比较，示雄蕊发育和药室不开裂；C:果实大小和种子比较；D:果节长度比较；E:花粉比较，示反义抑制GhLFHEl转基因棉花的花粉败育。CK:非转基因棉花(野生型)；SE:反义抑制GhLFHEl转基因棉花；标尺=Icm0
[0043]图13:超量表达GhLFHEl基因对棉花纤维细胞生长的影响。其中A:棉花胚珠离体培养体系中，非转基因棉花(野生型)和超量表达GhLFHEl转基因棉花纤维的生长情况；B:棉花胚珠离体培养体系中，不同发育时期纤维细胞的长度；C:棉花成熟纤维的长度比较。WT:非转基因棉花(野生型)；0E:超量表达GhLFHEl转基因棉花；?PA、10DPA和1OTPA:分别代表开花后5天、10天和15天。“**”表示与WT差异极显著(P < 0.01 )，用t测验计算显著性差异。
[0044]图14:反义抑制GhLFHEl基因对棉花纤维细胞生长的影响。其中A:棉花胚珠离体培养体系中，非转基因棉花(野生型)和反义抑制GhLFHEl转基因棉花纤维的生长情况；B:棉花胚珠离体培养体系中，不同发育时期纤维细胞的长度；C:棉花成熟纤维的长度比较。WT:非转基因棉花(野生型)；SE:反义抑制GhLFHEl转基因棉花；?PA、10DPA和1OTPA:分别代表开花后5天、10天和15天。表示与WT差异显著(P < 0.05)，表示与WT差异极显著(P < 0.01)，用t测验计算显著性差异。
【具体实施方式】
[0045]以下结合附图对本发明进行进一步的详细说明，但以下说明并不对本发明进行限定，任何对本发明的变形和改变，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。
[0046]本发明实例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell, 2001)。
[0047]在本发明的下述实例中，所用的棉花实验材料为冀棉14 (Gossypium hirsutumcv.Jimianl4), TM-1 (Gossypium hirsutum cv.TM-1)及其超短纤维突变体(ligonlintless-1, l1-1)。
[0048]【实施例1】GhLFHEl基因差异表达分析和基因序列的克隆
[0049]1、棉花RNA的提取
[0050]选取约3g新鲜棉花材料，在液氮中迅速磨成精细粉末，装入50mL离心管，加入15ml65°C预热的 RNA 提取液(2%CTAB (ff/V),2%PVP (W/V)，lOOmmol/LTris-HCl (pH8.0)，
0.5g/L Spermidine, 2.0mol/L NaCl, 2% 巯基乙醇(V/V),使用前加入))，颠倒混匀。65。。水浴3~lOmin，期间混匀2~3 次。氯仿:异戊醇(24:1)抽提2次(10，000r/min，室温，5min)。取上清，加入1/4体积IOmoI/L LiCl溶液，4°C放置6h，以氯仿:异戊醇(25:24:1)各抽提I次(10，000r/min,室温，5min)。加2倍体积的无水乙醇，在_70°C冰箱沉淀30min以上。12，0001'/1^11，41:离心20111111，弃上清。沉淀用200 ii L的DEPC处理水溶解。酚(pH4.5):氯仿:异戍醇(25:24:1)、氯仿:异戍醇(24:1)各抽提I次(10，000r/min,室温,5min)。加1/10体积3mol/LNaAc溶液和2.5倍体积的无水乙醇，在_70°C冰箱沉淀30min以上。12，000r/min，4°C离心20min，弃上清。沉淀用70%的酒精漂洗一次，风干。加200 y L的DEPC处理水溶解。用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量。
[0051]2、cDNA 合成
[0052]提取棉花各种样品总RNA,用试剂盒(Fermentas)合成cDNA—链。具体方法为:取约10 y g总RNA到DEPC-处理的扩增管中，加入I u L2.5 u mol/L Oligo-dT，加DEPC处理的水至终体积12 u L，70°C水浴5min使RNA变性后，立即冰浴3min。然后向扩增管中依次加入 4 u L5 Xreaction buffer, 2 u L10mmol/L dNTPs, IuL RNase inhibitor (20U), 37°C处理5min。加入 I y L AMV Rtase (5U)后，保温程序为 42°C，60min ;70°C，5min ;5°C，5min。程序结束后，一链产物于-20°C冻存。
[0053]3、筛选高同源棉花EST序列
[0054]以拟南芥BRs合成酶的蛋白质序列搜索NCBI数据库中的棉花EST序列，根据对应的EST序列设计表达引物，检测TM-1及其超短纤维突变体纤维发育相同时期的表达差异。结果表明:筛选到的EST序列中，与拟南芥BRs合成酶基因CYP90C1/R0TUNDIF0LIA3 (R0T3)高度同源的EST序列在GenBank中的编号为DT573461。
[0055]4、利用实时定量RT-PCR进行差异表达分析[0056]以合成的cDNA—链作为模板，采用实时定量PCR试剂盒(Bio-Rad)进行PCR。表达引物依据EST序列(DT573461)设计，5’端引物为GhLFHEl-1 (SEQ ID N0.4)，3’端引物为GhLFHEl-2 (SEQ ID N0.5)。在20 y L的反应体系中包括10 y L MIX缓冲液(包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和MgCl2), 5’-端和3’-端表达引物各I y L (5 y mol/L)。循环参数为 94°C 预变性 3min ;94°C，30sec，55°C，30sec，72 °C，30sec，预设循环数为 40。用棉花GhHIST0NE3基因(GenBank登录号:AF024716)作内标，GhHIST0NE3基因的5’-引物是GhHIS-1 (SEQ ID N0.8)，3’-引物为 GhHIS-2 (SEQ IDN0.9)。利用实时定量 RT-PCR 检测了 TM-1和I1-1突变体开花当天的胚珠纤维(F0-0DPA)、开花后6天的胚珠纤维(F0-6DPA)、开花后10天的纤维细胞(F-10DPA)和开花后10天的胚珠(0-10DPA)中GhLFHEl基因的表达差异。结果表明该基因的表达水平在6DPA胚珠纤维和10DPA纤维中出现显著差异，而在ODPA胚珠纤维和10DPA胚珠中表达水平相似(图1)。由此推测GhLFHEl基因在6DPA胚珠纤维中的表达差异主要也来源于6DPA纤维细胞中的差异表达。这结果说明GhLFHEl基因在长纤维中的表达水平远远高于相同发育时期超短纤维中的表达水平，因此将该基因命名为长纤维高表达基因(Long Fiber High Expressionl，GhLFHEl )。该基因在纤维细胞伸长中具有重要作用。
[0057]5、GhLFHEl基因cDNA序列和基因组序列的扩增
[0058]根据筛选到的高同源性EST序列(DT573461)进行染色体步行获得GhLFHEl的cDNA5’ 和 3’ 端序列，设计 5’ 端引物 GhLFHEl-3(SEQ ID N0.6)和 3，端引物 GhLFHEl-4(SEQID N0.7)，以 12DPA 纤维 cDNA 为模板进行 PCRJSii L 的 cDNA 扩增体系含 2.LlOXEx PCRbuffer (Mg2+free),2u L2.5mmol/L dNTPs, 2 u L25mmol/L MgCl2,1 y L 特异引物 GhLFHEl-3(SEQ ID N0.6) (5umol/L),luL GhLFHE 1-4 (SEQ IDN0.7) (5 u mol/L), 0.2 u L Ex TaqDNA 聚合酶，I u L cDNA 一链产物。扩增程序为:94°C，5min -MV, 30sec, 56°C，30sec, 72°C，
1.5min, 30 个循环；72°C延伸 IOmin0
[0059]同时以棉花基因组DNA为模板和相同的引物进行扩增，20 U L的基因组DNA扩增体系含 IOii L2XPrimerStar mix，I y L 特异引物 GhLFHEl-3 (SEQ ID N0.6) (5 u mol/L),I u L GhLFHE1-4 (SEQ ID N0.7) (5 u mol/L), I U L gDNA 和 7 y L 水。扩增程序为:94°C，5min ;94°C，30sec，56°C，30sec，72°C，20sec，30 个循环；72°C延伸 IOmin0
[0060]6、扩增片段回收，连接，转化大肠杆菌DH5a
[0061](I)电泳
[0062]将扩增产物在1.0% (W/V)琼脂糖凝胶中进行电泳分离。
[0063](2)回收
[0064]使用回收试剂盒:回收步骤按照试剂盒说明书进行，回收片段在琼脂糖凝胶上电泳定量。
[0065](3)克隆和测序
[0066]回收的片段经琼脂糖凝胶电泳定量。按试剂盒说明书，通过回收片段与克隆载体的连接、连接产物的大肠杆菌转化、阳性菌落的培养和质粒酶切验证，将回收片段克隆到pGEm-T (上海Sangon)载体上。序列测定由英骏公司完成。
[0067]回收的片段与pGEm-T (上海生工)载体建立如下连接体系:
[0068]
【权利要求】
1.分离的棉花长纤维高表达基因GhLFHEl,其具有以下核苷酸序列之一: (1)如SEQID N0.1所示的cDNA序列；或 (2)如SEQID N0.2所示的gDNA序列。
2.由权利要求1所述的基因编码的蛋白质，其具有以下氨基酸序列之一: (1)如SEQID N0.3所示的氨基酸序列；或 (2)SEQ ID N0.3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID N0.3的氨基酸序列相同生物活性的由SEQ ID N0.3衍生的氨基酸序列。
3.含有权利要求1所述基因的表达载体。
4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为植物表达载体，且至少含有增强型、组成型和或诱导型启动子。
5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体具有选自如图5、图6或图7所示的结构。
6.含有如权利要求2所述表达载体的宿主细胞。
7.含有如权利要求2所述表达载体的转化体。
8.一种超量或抑制GhLFHEl表达的转基因植物的制备方法，包括以下步骤: 1)将GhLFHEl基因与启动子可操作地连接； 2)构建含有GhLFHEl基因与启动子的`植物表达载体；` 3)用所述植物表达载体转化宿主，获得转化体； 4)用所述转化体转化植物，获得超量或抑制GhLFHEl表达的转基因植物。
9.如权利要求1所述基因在棉花品种改良中的应用。
10.如权利要求1所述基因在制备转基因棉花中的应用。
【文档编号】C07K14/415GK103772495SQ201310703547
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2013年12月19日 优先权日:2013年12月19日
【发明者】罗明, 寸永正, 裴炎, 胡明瑜 申请人:西南大学