一种pH及温度超敏感性树枝状大分子药物载体三代半及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种pH及温度超敏感性树枝状大分子药物载体三代半及其制备方法。本发明的目的是使树枝状大分子其在低代数下具有pH及温度超敏感的特性。经过修饰后末端三个羟基的3.5代聚酰胺树枝状大分子与末端变成羧基结构的N-丙基哌嗪进行健合，即获得G3.5PAMAM-Tris-NPPOBA。本发明相对于现有技术，具有如下优点：所述方法得到的产物具有pH及温度双重敏感性，且对于pH超敏感，LCST值可调节范围十分广泛。同时具有接近人体温度的临界溶解温度。
【专利说明】一种pH及温度超敏感性树枝状大分子药物载体三代半及其制备方法
【技术领域】:
[0001]本发明涉及一种以特殊物理性质为特征的医药配制品，进一步涉及一种pH及温度超敏感性树枝状大分子药物载体三代半及其制备方法。
【背景技术】:
[0002]树枝状大分子是高度枝化的合成大分子，它具有高度的分子均一性、明确的分子大小和形状以及许多表面功能基团。树枝状大分子的这些特性使它能够改变内核类型(如聚酰胺类，聚醚类)，分支数目和表面功能基团的类型。通过表面修饰，不同的功能基团能连接到树枝状大分子表面从而使树枝状大分子具有平衡水溶性及刺激敏感性(如温度敏感、PH敏感、光敏感、还原敏感等)。这些刺激敏感的特性使树枝状大分子在生物医学，药物制剂学包括成像、药物传递、组织工程等方面得到广泛关注。
[0003]传统的温敏性聚合物大都是线性高分子聚合物，如聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAAM)，聚甲基丙烯酸N，N- 二甲基氨基乙酯(PDMAEMA)，聚N，N- 二乙基丙烯酰胺(PDEA)等等，而具有体形三维结构的温敏材料，到目前为止报道的很少。而树枝状大分子这一新型材料，为了增加其功能，国内外研究人员进行了很多尝试，由于其表面具有众多可供修饰的基团存在，最常用的方法就是对其进行表面修饰引入各种需要的基团，如在树枝大分子表面接枝大分子PNIPAAM等线性温敏高分子聚合物，但是PNIPAAM等线性温敏高分子聚合物的多分散性导致PNIPAAM等线性温敏高分子聚合物修饰的树枝状大分子丧失了分子的均一性。因此不同于线性温敏聚合物使其能同时具有分子形状和均一性的温敏功能基团的研究受到广泛关注。近年来，Kenji Kono等人合成了一系列`新型的具有球状结构的温敏性聚合物，这些聚合物是通过在聚酰胺类树枝状大分子PAMAM或聚丙烯亚胺类树枝状大分子表面引入异丙基酰胺类结构，而异丙基酰胺结构则是温度敏感性聚合物PNIPAAM的结构单元，得到4.5代 NIPAAM-PAMAM，5 代 NIPAAM-PAMAM 和 5.5 代 NIPAAM-PAMAM，这些衍生物水溶液的 LCST 值分别为41，56和43°C，这些材料的优点是线性温敏性聚合物无法比拟的，它具有三维球状的结构，可控精确分子大小，分子均一性等一切属于树枝状大分子的特性，但是所得到的聚合物是在高代数条件下获得的，而且其临界溶解温度(LCST值Lower Critical SolutionTemperature)可调的范围不大，并且都高于人体生理温度，这些都影响了其应用的范围。因此，开发一种细胞毒性低、LCST值可调范围大且LCST值接近人体温度的树枝状大分子药物载体是非常有必要的。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种以N-丙基哌嗪温敏基团对以多羟基胺-三羟甲基氨基甲烷修饰的树枝状大分子PAMAM进行表面修饰的制备方法，使其在低代数下具有pH及温度超敏感的特性。
[0005]本发明的基本原理如下:[0006]树枝状大分子的温敏性依赖于表面功能基团的疏水性和紧密程度，溶液的pH及载体浓度。增加功能基团的疏水性增加了分子间相互作用从而导致PH引导的温度敏感性。同理，增加表面功能基团的数目也可以增加分子间相互作用从而得到更加低的临界溶解温度(LCSTfl^Lower Critical Solution Temperature)。
[0007]本发明通过树枝状大分子PAMAM的末端酯基与三羟甲基氨基甲烷反应，将PAMAM表面基团变成羟基，且表面基团数增大至原来的三倍，然后用N-丙基哌嗪类似物N-丙基哌嗪-4-氧代丁酸(NPPOBA)对PAMAM-Tris进行表面修饰，得到的新型树枝状聚合物具有温度、PH双重敏感性能，作为疏水性药物载体可以提高药物的溶解度，可以作为智能药物载体应用于生物医学领域。
[0008]将具有温度敏感性质的PAMAM衍生物配成不同pH值(pH6、7、8、9)的磷酸盐缓冲液，在500nm处梯度升温用紫外分光光度计进行检测，检测过程中每5min升高1°C，测得聚合物的温度-透光率曲线，透光率为50%时所对应的温度即为其LCST值，检测时所选用适宜的浓度为lmg/mL。
[0009]温度敏感性质的PAMAM衍生物在水溶液中表现出温度敏感的特性，随着温度的逐步升高，聚合物的水溶性降低，且其水溶性随PH的调节而发生变化。
[0010]发明是这样实现的:
[0011](一)G3.5代具有酯基末端的PAMAM树枝型聚合物的制备。
[0012]以乙二胺为核，与丙烯酸甲酯重复进行完全的Michael加成反应和酰胺化反应得到直至G3.5代具有酯基末端的PAMAM树枝型聚合物。具体过程如下:
[0013]以乙二胺和丙烯酸甲酯为原料，摩尔比按照1:4_5，冰浴，温度保持在01:;缓慢滴加丙烯酸甲酯的甲醇溶液到乙二胺的甲醇溶液中，滴毕，反复抽真空，氮气保护，恢复室温，然后在35°C下反应6h ;反应结束后，旋蒸除去溶剂甲醇，得淡黄色的粘稠液体G0.5PAMAM ；
[0014]以G0.5PAMAM:乙二胺=1:4-8 (摩尔比)；将乙二胺的甲醇溶液加入到带有磁力搅拌、温度计的三口烧瓶中，冰浴，缓慢滴加G0.5PAMAM的甲醇溶液；滴毕，反复抽真空，氮气保护，在35°C下反应24h，得产物Gl.0PAMAM ；
[0015]以G1.0PAMAM:丙烯酸甲酯=1:16 (摩尔比);将丙烯酸甲酯的甲醇溶液加入到带有磁力搅拌、温度计的三口瓶中，冰浴，缓慢滴加Gl.0PAMAM的甲醇溶液；滴毕，反复抽真空，氮气保护，在35°C下反应24h ;旋蒸除去未反应的丙烯酸甲酯和溶剂甲醇，得到浅黄色的黏稠液体 Gl.5PAMAM ；
[0016]以G1.5PAMAM:乙二胺=1:80 (摩尔比)；将乙二胺的甲醇溶液加入到带有磁力搅拌、温度计的三口烧瓶中，冰浴，缓慢滴加Gl.5PAMAM的甲醇溶液；滴毕，反复抽真空，氮气保护，在35°C下反应72h;反应完毕，采用真空旋转蒸发仪在35°C下蒸除甲醇，得产物G2.0PAMAM ；
[0017]以G2.0PAMAM:丙烯酸甲酯=1:24 (摩尔比);将丙烯酸甲酯的甲醇溶液加入到带有磁力搅拌、温度计的三口瓶中，冰浴，缓慢滴加G2.0PAMAM的甲醇溶液；滴毕，反复抽真空，氮气保护，在35°C下反应72h ;旋蒸除去未反应的丙烯酸甲酯和溶剂甲醇，得到浅黄色的黏稠液体 G2.5PAMAM ；
[0018]以G2.5PAMAM:乙二胺=1:160 (摩尔比)；将乙二胺的甲醇溶液加入到带有磁力搅拌、温度计的三口烧瓶中，冰浴，缓慢滴加G2.5PAMAM的甲醇溶液；滴毕，反复抽真空，氮气保护，在35°C下反应6天。反应完毕，采用真空旋转蒸发仪在35°C下蒸除甲醇，得产物G3.0PAMAM ；
[0019]以G3.0ΡΑΜΑΜ:丙烯酸甲酯=1:48 (摩尔比);将丙烯酸甲酯的甲醇溶液加入到带有磁力搅拌、温度计的三口瓶中，冰浴，缓慢滴加G3.0PAMAM的甲醇溶液；滴毕，反复抽真空，氮气保护，在35°C下反应48h。旋蒸除去未反应的丙烯酸甲酯和溶剂甲醇，得到浅黄色的黏稠液体 G3.5PAMAM。
[0020](二)以三羟甲基氨基甲烷(Tris)对G3.5代PAMAM进行修饰，使其末端三羟基化。
[0021]G3.5PAMAM、三羟甲基氨基甲烷、无水碳酸钾按照摩尔比1:48:48投料；
[0022]取三羟甲基氨基甲烷(Tris)和无水碳酸钾的无水DMSO溶液或DMF溶液于冰水浴(温度3~5°C )下的圆底烧瓶中，G3.5PAMAM0.2876g溶于少量无水DMSO或无水DMF于恒压滴液漏斗中，反复三次抽真空，氮气保护后，在磁力搅拌器的匀速搅拌下，G3.5PAMAM的DMSO溶液或DMF溶液缓慢滴入圆底烧瓶中，滴加完毕后取下恒压滴液漏斗，将反应装置移入恒温油浴锅，温度控制在50°C，连续反应72h ；
[0023]反应结束后，用旋转蒸发仪除去溶剂DMS0，得到淡黄色不透明粘稠液体，将其溶于少量蒸馏水中搅拌溶解为澄清溶液，然后滴入大量丙酮中产生白色沉淀，弃去上清液，反复进行三次除去水溶性杂质，得到的产物加入透析袋(截留分子量为3500)透析24h后进行冷冻干燥，得到 G3.5PAMAM-Tris。
[0024](三)末端变成羧基结构的N-丙基哌嗪的制备。
[0025]利用酸酐对N-丙基哌嗪进行修饰，使其末端变成羧基结构；经纯化得到产物；如下所示。
[0026]
【权利要求】
1.一种PH及温度超敏感性树枝状大分子药物载体三代半，其特征在于，载体为G3.5PAMAM-Tris-NPPOBA,即经过修饰后末端三个羟基的3.5代聚酰胺树枝状大分子与末端变成羧基结构的N-丙基哌嗪进行健合的产物。
2.权利要求1所述一种pH及温度超敏感性树枝状大分子药物载体三代半的制备方法，其特征在于，反应过程为:经过修饰后末端三个羟基的3.5代聚酰胺树枝状大分子与末端变成羧基结构的N-丙基哌嗪进行健合。
3.权利要求2所述一种pH及温度超敏感性树枝状大分子药物载体三代半的制备方法，其特征在于，反应过程为: 将N-丙基哌嗪-4-氧代丁酸(NPPOBA)的DMSO溶液或DMF溶液与1_ (3- 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDOHCl)以及4-二甲氨基吡啶(DMAP)混合室温下搅拌lh，对NPPOBA进行活化，直到溶液从无色变为红棕色为止活化完成； 然后取定量G3.5PAMAM-Tris的DMSO溶液或DMF溶液(反应摩尔比:G3.5PAMAM_Tris/NPPOBA/EDC.HCVdMAP=1: 192:192:192)于恒压滴液漏斗中，反复三次抽真空，氮气保护后，在磁力搅拌器的匀速搅拌下，G3.5PAMAM-Tris的DMSO溶液或DMF溶液缓慢滴入圆底烧瓶中，滴加完毕后取下恒压滴液漏斗，在室温下连续反应72h以上； 用旋转蒸发仪除去大部分溶剂DMSO或DMF，得到的产物用少量蒸馏水溶解，低于一定温度为澄清的棕红色溶液，高于此温度时溶液变浑浊，将浑浊的液体用超速离心机在温度为40°C，转速5000rpm条件下离心，所得沉淀物用透析袋(截留分子量为3500)大量蒸馏水透析24h得到目标产物。
4.根据权利要求2或3所述一种pH及温度超敏感性树枝状大分子药物载体三代半的制备方法，其特征在于，所述原料末端三羟基的3.5代聚酰胺树枝状大分子G3.5PAMAM-Tris的制备方法如下: 以三羟甲基氨基甲烷Tris对G3.5PAMAM进行修饰，使其末端又三个羟基。
5.根据权利要求4所述一种pH及温度超敏感性树枝状大分子药物载体三代半的制备方法，其特征在于，所述原料末端三羟基的3.5代聚酰胺树枝状大分子G3.5PAMAM-Tris的制备方法如下: G3.5PAMAM、三羟甲基氨基甲烷、无水碳酸钾按照摩尔比1:48:48投料； 取三羟甲基氨基甲烷(Tr i s )和无水碳酸钾的无水DMSO溶液或DMF溶液于冰水浴(温度3~5°C )下的圆底烧瓶中，G3.5PAMAM溶于少量无水DMSO或无水DMF于恒压滴液漏斗中，反复三次抽真空，氮气保护后，在磁力搅拌器的匀速搅拌下，G3.5PAMAM的DMSO溶液或DMF溶液缓慢滴入圆底烧瓶中，滴加完毕后取下恒压滴液漏斗，将反应装置移入恒温油浴锅，温度控制在50°C，连续反应72h ； 反应结束后，用旋转蒸发仪除去溶剂DMS0，得到淡黄色不透明粘稠液体，将其溶于少量蒸馏水中搅拌溶解为澄清溶液，然后滴入大量丙酮中产生白色沉淀，弃去上清液，反复进行三次除去水溶性杂质，得到的产物加入透析袋(截留分子量为3500)透析24h后进行冷冻干燥，得到 G3.5PAMAM-Tris。
6.根据权利要求4所述一种pH及温度超敏感性树枝状大分子药物载体三代半的制备方法，其特征在于，3.5代聚酰胺树枝状大分子G3.5PAMAM的制备方法如下: 以乙二胺和丙烯酸甲酯为原料，摩尔比按照1:4-5，冰浴，温度保持在01:;缓慢滴加丙烯酸甲酯的甲醇溶液到乙二胺的甲醇溶液中，滴毕，反复抽真空，氮气保护，恢复室温，然后在35°C下反应6h ;反应结束后，旋蒸除去溶剂甲醇，得淡黄色的粘稠液体G0.5PAMAM ； 以G0.5PAMAM:乙二胺=1:4-8 (摩尔比);将乙二胺的甲醇溶液加入到带有磁力搅拌、温度计的三口烧瓶中，冰浴，缓慢滴加G0.5PAMAM的甲醇溶液；滴毕，反复抽真空，氮气保护，在35°C下反应24h，得产物Gl.0PAMAM ； 以Gl.0PAMAM:丙烯酸甲酯=1:16 (摩尔比);将丙烯酸甲酯的甲醇溶液加入到带有磁力搅拌、温度计的三口瓶中，冰浴，缓慢滴加Gl.0PAMAM的甲醇溶液；滴毕，反复抽真空，氮气保护，在35°C下反应24h ;旋蒸除去未反应的丙烯酸甲酯和溶剂甲醇，得到浅黄色的黏稠液体 Gl.5PAMAM ； 以G1.5PAMAM:乙二胺=1:80 (摩尔比)；将乙二胺的甲醇溶液加入到带有磁力搅拌、温度计的三口烧瓶中，冰浴，缓慢滴加Gl.5PAMAM的甲醇溶液；滴毕，反复抽真空，氮气保护，在35°C下反应72h;反应完毕，采用真空旋转蒸发仪在35°C下蒸除甲醇，得产物G2.0PAMAM ； 以G2.0PAMAM:丙烯酸甲酯=1:24 (摩尔比)；将丙烯酸甲酯的甲醇溶液加入到带有磁力搅拌、温度计的三口瓶中，冰浴，缓慢滴加G2.0PAMAM的甲醇溶液；滴毕，反复抽真空，氮气保护，在35°C下反应72h;旋蒸除去未反应的丙烯酸甲酯和溶剂甲醇，得到浅黄色的黏稠液体 G2.5PAMAM ； 以G2.5PAMAM:乙二胺=1:160 (摩尔比)；将乙二胺的甲醇溶液加入到带有磁力搅拌、温度计的三口烧瓶中，冰浴，缓慢滴加G2.5PAMAM的甲醇溶液；滴毕，反复抽真空，氮气保护，在35°C下反应6天。反应完毕，采用真空旋转蒸发仪在35°C下蒸除甲醇，得产物G3.0PAMAM ； 以G3.0PAMAM:丙烯酸甲酯=1:48 (摩尔比)；将丙烯酸甲酯的甲醇溶液加入到带有磁力搅拌、温度计的三口瓶中，冰浴，缓慢滴加G3.0PAMAM的甲醇溶液；滴毕，反复抽真空，氮气保护，在35°C下反应48h。旋蒸除去未反应的丙烯酸甲酯和溶剂甲醇，得到浅黄色的黏稠液体 G3.5PAMAM。
7.根据权利要求1至3任何一项所述一种pH及温度超敏感性树枝状大分子药物载体三代半的制备方法，其特征在于，所述末端变成羧基结构的N-丙基哌嗪的制备方法为: 利用酸酐对N-丙基哌嗪进行修饰，使其末端变成羧基结构；经纯化得到产物；如下所示。
8.根据权利要求7所述一种pH及温度超敏感性树枝状大分子药物载体三代半的制备方法，其特征在于，所述末端变成羧基结构的N-丙基哌嗪的制备方法为: 将二氯甲烷加入容器中，在搅拌下向容器中慢慢加入丁二酸酐，边搅拌边使丁二酸酐溶解；N-丙基哌嗪，用二氯甲烷溶解，然后装入恒压漏斗中；在15°C，将二氯甲烷溶解的胺类化合物慢慢滴加到三口瓶中，滴加完毕，在此温度下反应5h ； 反应结束后，旋转蒸发蒸出多余的二氯甲烷，溶液变为红棕色粘稠状液体，取出后加入少量乙醚，静置一段时间后，有粉色固体析出，过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤两次，用无水乙醇重结晶，80真空干燥24h。
【文档编号】C07D295/185GK103834040SQ201310755518
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】王征, 赵燕军, 刘瑞红, 曹延武, 陈超, 高敏 申请人:天津大学