用于产生免疫球蛋白样分子的方法和手段的制作方法

用于产生免疫球蛋白样分子的方法和手段的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用于在单个宿主细胞中产生一种或更多种免疫球蛋白样分子的手段和方法。也提供了能够产生目的单特异性和/或双特异性免疫球蛋白样分子的新的CH3突变。
【专利说明】用于产生免疫球蛋白样分子的方法和手段

【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学、医学和生物治疗剂领域。尤其涉及用于治疗多种疾病的 治疗性抗体领域。

【背景技术】
[0002] 许多目前使用的生物治疗剂是分离的重组人或人源化单克隆抗体，其增强机体免 疫系统中和或消除参与疾病过程的细胞和/或分子或者消灭侵入的病原体或感染原的能 力。单克隆抗体与抗原的单个特定区域或表位结合，并且对于治疗中的使用，通常根据期望 的功能性质进行选择，例如杀死肿瘤细胞，阻断受体-配体相互作用或病毒中和。目前，大 约有30种经FDA批准的单克隆抗体，这些单克隆抗体通常被大量生产，并且可详细分析其 生物物理和生物化学特性以确保批与批之间的一致性，这有助于控制合格率（regulatory acc印tability)。尽管具有这些有利的特性，但是单克隆抗体也有许多缺点，其中一些 涉及到其单特异性的性质和疾病的复杂性。疾病过程在性质上常常是多因素的，并且涉 及疾病调节因素的繁多的或协同的作用或不同受体的上调，包括其信号网络之间的串扰 (crosstalk)。因此，对参与病理的多种不同因素和途径的阻断可导致改善治疗效果。由于 其单特异性的性质，单克隆抗体可能仅干扰复杂疾病过程中的单个步骤，这往往不具有最 佳效果。除了不能完全解决疾病过程的多个方面外，已经很清楚的是，靶向单个细胞蛋白质 或可溶性蛋白质或病原体的单个表位通常不足以有效地治疗疾病，这是因为对于单克隆抗 体来说与之结合并发挥所预期效果的靶表位可能不再可利用。例如，肿瘤细胞经常通过下 调、突变或屏蔽存在于生长因子受体上的靶表位来逃避单克隆抗体的治疗。通过激活替选 受体和/或其配体，肿瘤细胞然后可开发出不同途径来持续生长和转移。类似地，病毒和 其他病原体频繁突变并失去或屏蔽靶表位，从而逃避单克隆抗体的治疗。与单个表位结合 的单克隆抗体通常不招募由多克隆抗体诱发的全方位的效应机制，其中包括：调理素作用 (增强抗原的吞噬作用）、位阻（包被抗体的抗原被阻止附着到宿主细胞或粘膜表面）、毒素 中和、凝集或沉淀（抗体结合多个可溶性抗原引起的聚集和随后的清除），激活补体和抗体 依赖性细胞的细胞毒性（抗体能够通过自然杀伤细胞和嗜中性粒细胞杀伤靶细胞）。
[0003] 用于治疗应用的多克隆抗体可以从混合人血清中获得。这种血清来源的治疗性多 克隆抗体可例如用于治疗或预防由病毒（例如狂犬病病毒、巨细胞病毒和呼吸道合胞体病 毒）引起的感染、中和毒素（例如破伤风毒素和肉毒杆菌毒素）或预防Rhesus D同种异体 移植物免疫。以下事实阻止了血清来源的多克隆抗体制剂更广泛的应用：来源血浆仅可用 于有限范围的靶标，例如感染性疾病和毒素。此外，在数量和适宜性二者方面，产品高度依 赖于供体血液的可用性，导致批次之间相当大的差异。此外，筛选技术跟不上不断进化的病 毒，因此，免疫球蛋白产品具有传播传染性疾病的潜在风险。最后，血液采集、筛选和免疫球 蛋白纯化的漫长过程意味着血浆来源的免疫球蛋白生产昂贵。
[0004] 单克隆抗体的混合物可以提高单克隆抗体的效力，同时避免了与血清来源的多克 隆抗体有关的局限性。在本领域中，已经在临床前模型和临床试验中测试了两种人的或人 源化单克隆抗体的组合（例如针对J1ER2受体的两种单克隆抗体的混合物，针对EGFR受体 的两种抗体的混合物、针对狂犬病病毒的两种单克隆抗体）。在本领域中，已经显示出两种 单克隆抗体的组合可具有附加效应或协同效应，并且招募与任一单独的抗体都不相关的效 应机制。例如，针对EGFR或HER2的两种单克隆抗体的混合物表现为基于下述活性的组合更 强效地杀伤肿瘤细胞，所述活性包括：加强受体内化、提高对受体的下游信号通路的阻断， 以及增强免疫效应子介导的细胞毒作用。对于基于2种单克隆抗体的组合疗法，组成抗体 可分别产生并且在蛋白质水平上组合。这种方法的一个缺点是在临床试验中单独开发2种 抗体并且（部分地）用组合重复该过程的费用巨大。这导致基于抗体组合的治疗的成本不 可接受。或者，可以将产生组成单克隆抗体的2种重组细胞系在发酵罐中混合，并且可将所 得抗体混合物纯化作为单一制剂（W02004/061104)。这种方法的一个缺点是其组成的控制 性差，因此所得重组多克隆抗体制剂的再现性差，尤其是考虑到这样的组成可能在细胞被 培养时随着时间而改变，更是如此。
[0005] 在过去的十年中，出现了双特异性抗体来作为使用2种抗体的组合的一种替代选 择。虽然，2种抗体的组合代表了与相同或不同靶标上的不同表位结合的2种不同的免疫 球蛋白分子的混合物，而在双特异性抗体中，这通过单个免疫球蛋白分子实现。通过与相同 或不同靶标上的2个表位结合，双特异性抗体可具有与同相同表位结合之2种抗体的组合 相比类似的效果。此外，在单一制剂中由于IgG形式的双特异性抗体与单个分子中的2个 不同的单价结合区组合以及2个IgG抗体的混合物与2个不同的二价结合分子组合，也已 经观察到了这些形式的不同效果。从技术和管理角度来看，由于制造、临床前试验和临床试 验涉及单一分子，这使得开发单一双特异性抗体的复杂性较低。因此，复杂性较低并且具有 成本效益的药物开发过程同时提供更有效的抗体治疗，促进了基于单一双特异性抗体的疗 法。
[0006] 已通过多种方法产生了基于IgG形式的双特异性抗体，其由两条重链和两条轻链 构成。例如，可以通过使两个抗体分泌性细胞系融合以产生新的细胞系或通过用重组DNA 技术在单个细胞中表达两种抗体来产生双特异性抗体。这些方法产生了多种抗体，这是因 为来自每个抗体的各自的重链可能形成单特异性二聚体（也称为同二聚体），其包含两个 相同的具有相同特异性的配对重链，以及双特异性二聚物（也称为异二聚体），其包含两个 不同的具有不同特异性的配对重链。此外，来自各个抗体的轻链和重链可随机配对形成不 适当的、非功能性的组合。这个问题被称为重链和轻链的错配对，可以通过选择用具有共同 轻链的抗体表达为双特异性来解决。但即使在使用共同轻链时，在单个细胞中表达两种重 链和一种共同轻链也将产生3种不同的抗体种类，即2种单特异性的"亲本"抗体和所述双 特异性抗体，所以需要从所得抗体混合物中纯化目的双特异性抗体。虽然已经使用技术来 进一步提高双特异性抗体在亲本抗体和双特异性抗体之混合物中的百分率并降低重链和 轻链错配对的百分率，但仍需要消除或最小化上面提到的一些缺点的双特异性形式。
[0007] 总之，本领域提供了多种用于产生随后可用于患者中的治疗应用的单克隆抗体、 双特异性抗体、单克隆抗体的混合物、或单特异性抗体和双特异性抗体的混合物的技术和 方法。然而，如上面所讨论的，每一种这些现有的技术和方法都有其缺点和局限性。因此， 需要用于产生祀向多种疾病调节分子（disease-modifying molecule)的混合物形式或双 特异性方式的生物治疗剂的改进的和/或替代的技术。


【发明内容】

[0008] 本发明提供了用于改进和/.或替选的技术之方法和手段，所述方法和手段用于 产生靶向多种疾病调节分子的混合物形式或双特异性方式的生物治疗剂，以及由这些方法 和手段得到的产品和用途。
[0009] 在本领域中描述了多种方法来促进某种目的双特异性抗体的形成，从而减少所得 混合物中不希望的抗体的含量。
[0010] 对于抗体，众所周知的是CH3-CH3相互作用是Fc二聚化的主要驱动力（Ellerson JR 等，J.I 臟 unol 1976(第 116 卷）第510-517 页；Deisenhofer J. biochemistry 1981 (第 20卷）第2361-2370页）。另外众所周知的是，当两个CH3结构域彼此相互作用时，它们 在包含"接触"残基（也称为接触氨基酸、界面残基或界面氨基酸）的蛋白质-蛋白质界面 接触。第一 CH3结构域的接触氨基酸与第二CH3结构域的一个或更多个接触氨基酸相互 作用。在抗体三维结构中，接触氨基酸彼此通常在5. 5埃（优选在4. 5埃）内。来自一个 CH3结构域的接触残基与来自不同的CH3结构域的接触残基之间的相互作用可能通过例如 范德华力、氢键、水介导的氢键、盐桥或其他静电力、芳香族侧链之间的吸引相互作用、二硫 键，或本领域技术人员已知的其他力。之前已经表明，在人IgGl的CH3结构域界面处大约 三分之一的接触氨基酸侧链可能是结构域折叠和缔合的主要贡献者。可以进一步设想，其 他（相邻）的氨基酸残基可能影响蛋白质-蛋白质界面中的相互作用。
[0011] 在本领域中已应用了干扰抗体重链二聚化的方法。在CH3结构域中进行特定改造 以比同二聚化更有利于异二聚化。CH3-CH3界面的这样改造的实例包括引入互补的突起突 变和空腔突变，也被称为"结进孔（knob-into-hole) "方法，例如W01998/050431、Ridgeway 等（1996)和Merchant等（1998)中所描述的。
[0012] 通常，该方法包括在第一多肽的界面引入突起以及在第二多肽的界面引入对应的 空腔，这样所述突起可置于所述空腔中，从而促进异多聚体的形成而阻碍同多聚体的形成。 "突起"或"结"通过用较大侧链（例如酪氨酸或色氨酸）替换第一多肽界面的小的氨基酸 侧链而构建。与突起相同或相似大小的补偿性的（compensatory) "空腔"或"孔"通过用 较小的氨基酸侧链（例如丙氨酸或苏氨酸）替换大氨基酸侧链而在第二多肽界面产生。突 起和空腔可以通过合成手段（例如改变该编码多肽的核酸）或通过肽合成而制得。
[0013] 单独使用结进孔技术，目的双特异性抗体在2种亲本抗体和双特异性抗体混合物 中的比例最多为87%。通过在CH3-CH3界面的两个CH3结构域之间引入另外的二硫键， Merchant等人成功地将双特异性抗体的比例提高至混合物的95%。尽管如此，为了将这样 的双特异性抗体用作药物，还必须将双特异性抗体从同二聚体中被纯化（分离）出来，并配 制到可药用稀释剂或赋形剂中。由于同二聚体和异二聚体的物理化学性质的相似性，从这 种混合物中纯化异二聚体是一个重大挑战。本发明的一个目的是提供用于在单个细胞克隆 中产生双特异性抗体并且双特异性抗体在混合物中的比例的方法。因此，根据本发明，可使 用结进孔技术作为一种手段（单独或与其他手段一起）来实现在混合物中所述进一步提高 的双特异性比例。
[0014] CH3-CH3界面的这种改造的另一个实例由异二聚体Fc技术提供，通过设计链交换 改造结构域（strand-exchange engineered domain，SEED) CH3异二聚体，其支持双特异性 并且不对称的融合蛋白的设计。这些SEED CH3异二聚体是由人IgA和IgG的CH3序列的 交替片段组成的人IgG和IgA CH3结构域的衍生物，其导致了互补的人SEED CH3异二聚 体的配对，即所谓的 SEED-体（Davis JH?等，Protein Engineering，Design&Selection 2010 (第 23 卷）第 1%_2〇2 页；W〇2〇〇7/ll〇2〇5)。
[0015] 用于产生给定的目的双特异性抗体的另一种方法是基于CH3-CH3界面内天然 带电的接触残基的静电性改造，例如在EP01870459或US2010/0015133、W02007/147901、 W02010/129304, Gunasekaran 等（2010)和 W02009/089004 中所描述的。这些出版物描述 了在重链CH3结构域中的突变，其中天然存在的带电氨基酸的接触残基被相反电荷的氨基 酸残基替换（即电荷逆转策略）。这就造成跨Fc二聚体界面改变的电荷极性，这样静电匹 配的Fc链的共表达支持有利的吸引性相互作用，从而促进所需要的Fc异二聚体的形成，而 不利的排斥性电荷相互作用抑制不期望的Fc同二聚体的形成。
[0016] 根据描述，CH3-CH3界面内四个独特的带电残基对参与了结构域-结构域的相互 作用。这些是0356/1(439'4357/1(370'、1(392/1)399'和0399/1(409'（根据1^&3丨（1991)编 号，其中第一链中的残基与第二链的残基通过"/"分开，并且其中的撇号（'）表示第二链中 的残基编号）。由于CH3-CH3界面显示了二次对称性，每个独特的电荷对在完整的IgG中表 示两次（即，在界面中也存在1(439/1)356'，1(370/^357'，0399/1(392'和1(409/1)399'电荷相 互作用）。利用这种二次对称性，已证实单个电荷逆转（例如第一链中的K409D，或者第二 链中的D399'K)导致同二聚体因相同电荷的排斥而形成减少。不同的电荷逆转的组合进一 步增强了这种排斥效果。已证实包含不同的互补的电荷逆转的不同CH3结构域的表达，可 以驱动异二聚化，导致双特异性种类在混合物中的比例增加。
[0017] 使用上述方法，可在单个细胞中产生比例在约76%至约96%的双特异性抗体。本 发明的一个目的是提供一种用于在单个细胞中产生双特异性抗体并且期望的双特异性抗 体的百分率进一步提高的方法。根据本发明，可使用静电改造技术作为手段之一，单独地或 与其他手段（例如结进孔方法）一起，以实现所述进一步提高所期望的（双特异性）抗体 的百分率。
[0018] 在一个方面，本发明提供了一种用于从单个宿主细胞中产生至少两种不同的免疫 球蛋白样（Ig-like)分子的方法，其中所述的两种免疫球蛋白样分子各自包含能够形成界 面的两个CH3结构域，所述方法包括在所述细胞中提供：
[0019] a)编码第一含 CH3 结构域之多肽链（CH3domain_comprising polypeptide chain)的第一核酸分子，
[0020] b)编码第二含CH3结构域之多肽链的第二核酸分子，
[0021] c)编码第三含CH3结构域之多肽链的第三核酸分子，以及
[0022] d)编码第四含CH3结构域之多肽链的第四核酸分子，
[0023] 其中所述核酸分子中的至少两种具有用于使所述第一含CH3结构域之多肽链与 所述第二含CH3结构域之多肽以及使所述第三含CH3结构域之多肽与所述第四含CH3结构 域之多肽优先配对的手段，所述方法还包括培养所述宿主细胞以及使所述至少四种核酸分 子能够表达并且从培养物中收获所述至少两种不同的免疫球蛋白样分子的步骤。
[0024] 通常希望产生超过一种（双特异性）抗体以例如更有效地干扰参与疾病过程的多 种生物途径或者干扰病原体的入侵、复制和/或传播。
[0025] 超过一种双特异性抗体的混合物对于某些疾病的治疗也特别有用。例如，在用抗 体或小分子药物的治疗过程中，肿瘤细胞使用许多不同的策略发展出抗性。抗性可能涉及 多种细胞表面受体以及可溶性分子，并且其被认为有利于开发同时解决多种此类疾病相关 分子和逃避相关分子的基于抗体的癌症治疗。在包含超过2种此类疾病相关靶分子或表位 和逃避相关靶分子或表位的情况下，双特异性抗体的混合物提供一种创新的和有吸引力的 治疗形式。优选地，由单个细胞产生这种双特异性抗体的混合物以有利于药物开发过程， 即，从管理角度看复杂性较低，从药物制造和临床开发的角度看具有成本效益并且可行。在 基于单个细胞的方法中，希望使用能够进行控制并且有效产生双特异性抗体的方法，从而 减少或甚至完全消除对从不期望单特异性的IgG分子中分离期望双特异性IgG分子的混合 物的需求。在现有技术中，已经由单个细胞产生了单特异性抗体和双特异性抗体的混合物 (W02004/009618)，但这些混合物代表多种不同的双特异性和单特异性抗体种类的复杂混 合（concoction)。本发明的另一个目是提供用于在单个细胞中产生限定的双特异性抗体 混合物的手段和方法。优选地，不论单体副产物的量如何，提供的方法使得（双特异性）抗 体的混合物占二聚体IgG分子的比例为至少95%、至少97%或甚至超过99%，参见本文下 文。通常，在产生多个完整的IgG分子的细胞中，可能存在能够通过本领域已知的尺寸排阻 色谱法简单地除去的半分子（单体副产物）。
[0026] 在一个实施方案中，本发明提供用于在单个细胞中产生至少两种不同的免疫球蛋 白样分子的限定混合物而不是单一目的（双特异性）抗体的方法，其中其他的不期望二聚 抗体种类的形成减少或者甚至不存在。所得混合物是良好限定的，并且其组成由CH3结构 域突变体的设计来控制。此外，表达水平和/或用于表达的不同转染比率的调节影响混合 物的组成。在根据本发明的方法中，第一核酸分子编码优先与由第二核酸分子编码的CH3 结构域配对的CH3结构域，而第三核酸分子编码优先与由第四核酸分子编码的CH3结构域 配对的CH3结构域。本发明还提供了可由本发明的方法获得的至少两种不同的免疫球蛋白 样分子的混合物。
[0027] 如本文所用的术语"所述第一含CH3结构域之多肽与所述第二含CH3结构域之多 肽优先配对"是指基本上所有包含第一含CH3结构域之多肽和/或第二含CH3结构域之多 肽的所得二聚体都是由与一个第二含CH3结构域之多肽配对的一个第一含CH3结构域之多 肽组成的二聚体。同样，术语"所述第三含CH3结构域之多肽和所述第四含CH3结构域之多 肽优先配对"是指基本上所有包含第三含CH3结构域之多肽和/或第四含CH3结构域之多 肽的所得二聚体都是由与一个第四含CH3结构域之多肽配对的一个第三含CH3结构域之多 肽组成的二聚体。结果是，当向单个细胞中引入编码四种不同的（A、B、C、D)含CH3结构域 之多肽的核酸分子时，产生的主要是两种特定的免疫球蛋白样分子的混合物，而不是10种 不同免疫球蛋白样的二聚体仏4、483(：、40、88、8(：、80、0：、0)和00)的混合物。
[0028] 如下文更详细地解释的，在一个优选的实施方案中，所述第一含CH3结构域之多 肽链包含氨基酸替换T366K，并且所述第二含CH3结构域之多肽链包含氨基酸替换L351D。 这些氨基酸改变是用于使所述第一含CH3结构域之多肽链与所述第二含CH3结构域之多肽 链优先配对的优选手段。所述第一含CH3结构域之多肽链优选还包含氨基酸替换L351K。此 夕卜，所述第二含CH3结构域之多肽链优选还包含选自Y349E、Y349D和L368E的氨基酸替换， 最优选L368E。在另一个优选的实施方案中，所述第三含CH3结构域之多肽链包含氨基酸替 换E356K和D399K，并且所述第四含CH3结构域之多肽链包含氨基酸替换K392D和K409D。
[0029] 在根据本发明的方法中，每一种含CH3结构域之多肽链优选还包含识别靶表位的 可变区。作为含CH3结构域之多肽链的一部分的该可变区优选地具有共同的轻链。在这种 情况下，只有可变区的VH不同，而所有可变区中的VL基本相同。因此，在一个优选方面，提 供了一种根据本发明的方法，其还包括为所述宿主细胞提供编码共同轻链的核酸分子。在 一个特别优选的实施方案中，所述4个含CH3结构域之多肽链的4个可变区各自识别不同 的靶表位。举例来说，如果所述第一核酸分子编码的重链还包含抗原A特异性的可变结构 域，所述第二核酸分子编码的重链还包含抗原B特异性的可变结构域，所述第三核酸分子 编码的重链还包含抗原C特异性的可变结构域，所述第四核酸分子编码的重链还包含抗原 D特异性的可变结构域，那么然后，将产生含有AB特异性的双特异性免疫球蛋白样分子和 CD特异性的双特异性免疫球蛋白样分子的混合物。由于使所述第一含CH3结构域之多肽与 第二含CH3结构域之多肽优先配对以及使所述第三含CH3结构域之多肽与第四含CH3结构 域之多肽优先配对的手段，单特异性抗体（具有AA、BB、CC或DD特异性）或具有AC、AD、BC 或BD特异性的双特异性抗体的形成被降低或甚至不存在。当然，可使用另外的核酸分子， 例如编码第五含CH3结构域之多肽和第六含CH3结构域之多肽的核酸分子以产生包含超过 两种不同免疫球蛋白样分子的限定混合物。
[0030] 值得注意的是，在根据本发明的方法中使用的核酸的比率未必是1 : 1 : 1 : 1， 并且所表达得到的免疫球蛋白样分子的比率未必是1 : 1。可使用本领域中已知的手段来 产生具有最佳比率的抗体混合物。例如，通过使用不同的遗传元件（例如启动子、增强子和 抑制子）或通过控制编码抗体的DNA构建体的基因组整合位点的拷贝数，可以调节核酸分 子的表达水平并由此调节所产生得到的免疫球蛋白样分子的比率。
[0031] 用于优先配对的所述手段优选地可包括经改造的互补结进孔突变、二硫键、电荷 突变（包括电荷逆转突变），或它们的组合。本领域技术人员将理解，可以在某些类型的突 变中选择所述用于优先配对的手段，即，所有至少4种编码含CH3结构域之多肽链的核酸分 子全部可以包含例如电荷突变作为用于优先配对的手段。另外，在某些情况下，未经改造的 野生型CH3也可用于使两种野生型的含CH3结构域之多肽链优先配对。在一个特别优选的 实施方案中，所述用于优先配对的手段包括选自表B中的至少一种CH3突变，如在本申请的 其他部分中所解释的。因此，一个优选的实施方案提供了根据本发明的一种方法，其中所有 4种核酸分子均具有用于使所述第一含CH3结构域之多肽与所述第二含CH3结构域之多肽 以及使所述第三含CH3结构域之多肽与所述第四含CH3结构域之多肽优先配对的手段，其 中用于使所述第一含CH3结构域之多肽与所述第二含CH3结构域之多肽优先配对的所述手 段不同于用于使所述第三含CH3结构域之多肽与所述第四含CH3结构域之多肽优先配对的 那些手段。
[0032] 本发明的一个方面提供了一种根据本发明的方法，其中用于使所述第一含CH3结 构域之多肽与所述第二含CH3结构域之多肽优先配对的所述手段不同于用于使所述第三 含CH3结构域之多肽与所述第四含CH3结构域之多肽优先配对的所述手段。"不同于"意指， 设计用于使所述第一含CH3结构域之多肽与所述第二含CH3结构域之多肽优先配对的所述 手段，以使得有利于第一链和第二链的优先配对。该设计使得基本上不发生第一含CH3结 构域之多肽链与第三和/或第四含CH3结构域之多肽链之间的相互作用。换句话说，所述 第一含CH3结构域之多肽与所述第三多肽或第四多肽之间的二聚化被降低到基本为零，等 等。第三含CH3结构域之多肽和第四含CH3结构域之多肽可以是野生型的，或者可以包含 用于优先配对的手段，其中所述手段不同于用于使第一 CH3结构域与第二CH3结构域优先 配对的手段。目前的研宄集中在使用例如结进孔技术或使存在于CH3结构域中的带电接触 氨基酸突变（逆转）来产生单种双特异性抗体。然而，在本发明之前，还没有实现产生至少 两种（双特异性）免疫球蛋白样分子的限定混合物而没有显著共产生其他二聚物副产物。
[0033] 本发明提供了用于高效并且可控地产生良好限定的免疫球蛋白样分子的混合物 并且在混合物中具有高的双特异性比例的方法。在需要两种双特异性的系统中，甚至获得 了至少95%、至少97%或更高的（两种）双特异性的比例。这意味着，仅获得了至多5%、 至多3%或更少的单特异性二价副产物。值得注意的是，单体副产物（即半分子）的量不那 么重要，因为这些半分子可利用其大小差异容易地从二聚体中分离。
[0034] 在另一个优选的实施方案中，第一和第二含CH3结构域之多肽链的可变区识别不 同的靶表位，而第三和第四含CH3结构域之多肽链的可变区识别相同的靶表位。这将导致 主要产生一种双特异性免疫球蛋白样分子和一种单特异性免疫球蛋白样分子。例如，如果 第一和第二含CH3结构域之多肽链的可变区识别不同的靶表位，并且如果第三和第四含 CH3结构域之多肽链的可变区二者识别不同于第一和第二CH3结构域所识别靶表位的相同 靶表位，则将形成具有AB或CC特异性的免疫球蛋白样分子的混合物。因此，还提供了一种 根据本发明的方法，其中，第三和第四含CH3结构域之多肽链的可变区识别的靶表位相同， 但是不同于第一或第二含CH3结构域之多肽链的可变区识别的靶表位。
[0035] 或者，当第一和第二含CH3结构域之多肽链的可变区识别不同的靶表位，并且当 第三和第四含CH3结构域之多肽链的可变区二者与第一或第二含CH3结构域之多肽链识别 相同的表位时，将形成具有AB和AA，或AB和BB特异性的免疫球蛋白样分子的混合物。因 此，随之提供了一种根据本发明的方法，其中第三和第四含CH3结构域之多肽链的可变区 识别的靶表位与第一或第二含CH3结构域之多肽链的可变区识别的靶表位相同。本发明的 另一个目的是提供一种在单个细胞培养物中产生双特异性抗体和单特异性抗体的限定混 合物的手段和方法。这样良好限定的混合物的一个非限制性实例是具有AB特异性的双特 异性抗体和具有AA特异性的单特异性抗体的混合物。另一个实例是具有AB特异性的双特 异性抗体和具有BB特异性的单特异性抗体的混合物。另一个实例是具有AB特异性的双特 异性抗体和具有CC特异性的单特异性抗体的混合物。另外，提供优选的手段和方法，其产 生目的抗体为至少90%、更优选至少95 %且最优选至少97 %或甚至99%以上的期望抗体 的混合物。
[0036] 在另一个实施方案中，提供了一种根据本发明方法，其中，第一和第二含CH3结构 域之多肽链的可变区识别相同的靶表位，而第三和第四含CH3结构域之多肽链可变区识别 第二靶表位，所述第二靶表位不同于所述第一和第二可变区识别的靶表位。这将导致主要 产生具有AA特异性或BB特异性的单特异性免疫球蛋白样分子。双特异性免疫球蛋白样分 子的形成被减少或甚至避免。在多个实施方案中，优选在单个细胞中产生单特异性抗体的 混合物，而不是双特异性抗体的混合物。例如，当需要两个相同的靶分子交联时，或者当两 个靶标彼此位置过远而无法将其通过单个双特异性抗体结合时。在单个细胞中产生单特异 性抗体的混合物也可能是有利的，因为所述混合物可以被看作是单一治疗产物。在本领域 中，多种单特异性抗体的治疗效果及安全性已被证实并且已经获得了市场授权。在单个细 胞中产生单特异性抗体的混合物将因此有利于测试数种这样的混合物的效果和安全性，并 将减少注册审批和制造的精力和成本。然而，目前没有可用于在单个细胞中产生单特异性 抗体的特定混合物且其中双特异性副产物的形成降到低于5%的方法。本发明的另一个目 的是提供在单个细胞中产生这种良好限定的同二聚体抗体混合物且其中双特异性抗体的 形成被降到低于5%的手段和方法。
[0037] 因此，一种根据本发明的方法适于产生任何期望的双特异性和/或单特异性免疫 球蛋白样分子的混合物。此外，可以使用另外的核酸分子，例如编码第五和第六（以及第七 和第八等）含CH3结构域之多肽的核酸分子，以产生包含超过两种不同免疫球蛋白样分子 的限定混合物。
[0038] 优选地，在一种根据本发明的方法中，使用至少两个这样的CH3结构域，其包含由 本发明提供的突变的至少一种组合。通过这些突变，在两个CH3结构域之间形成了新的特 异性相互作用。根据本发明的这些突变将在下面更详细地讨论。
[0039] 本文使用的术语"免疫球蛋白样分子"指的是具有至少一个免疫球蛋白（Ig) 结构域的蛋白质分子。所述免疫球蛋白样分子包含具有至少免疫球蛋白CH3结构域 的功能的序列，优选包含IgGl的CH3结构域的序列。具有至少一个CH3结构域的蛋白 分子可以进一步配备有特定的结合部分。因此，可将包含用于优先配对之手段的本发 明CH3结构域用于使两种含CH3结构域之蛋白分子优先配对，以设计需要的异二聚体 的结合分子或结合分子的混合物。可将与含CH3结构域之蛋白质分子结合的部分设计 为是任何结合件（binding agent)，包括但不限于，单链Fvs、单链或串联双体（Tandem diabodie s) ( TandAb? )、vhh、 Anticalins?、 Nanobodies?、BiTE?、 Fab、锚蛋白重复蛋白或DARPINs?、Avimersd)、dart、tcr样抗体、 Adnectins?、Affilins?、Trans-bodies?、Affibodies?、 Trimei'X?、 MicroProteins、Fynomers?、Centyrins?.或 KAI」B丨TOROI>。在一个优选实施方 案中，结合部分是抗体可变区（即vh/vl组合）。作为含CH3结构域之多肽链的一部分的 可变区优选具有共同轻链。在这种情况下，仅可变区的VH不同，而所有可变区的VL基本相 同。
[0040] 替选地或另外地，其他分子可以被设计到本发明的CH3结构域，所述其他分子包 括细胞因子、激素、可溶性配体、受体和/或肽。
[0041] 在一个更优选的实施方案中，所述免疫球蛋白样分子包含全长Fc骨架。在一个最 优选的实施方案中，免疫球蛋白样分子是抗体。这些抗体的可变区优选具有共同轻链，但是 其VH区可以不同。本文所用的术语"抗体"是指属于免疫球蛋白蛋白质类的蛋白质分子， 其含有与抗原上的表位结合的一个或更多个结构域，其中这样的结构域来自于抗体的可变 区或与抗体的可变区具有序列同源性。抗体是本领域已知的，并且包括多种同种型，例如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE和IgM。根据本发明的抗体可以是这些同种型的任 一种，或其功能衍生物和/或其片段。在一个优选实施方案中，产生的免疫球蛋白样分子是 IgG同种型的抗体，因为IgG抗体相比于其他同种型的抗体例如具有较长的半衰期。
[0042] 利用根据本发明的方法产生的抗体可以具有任何起源的序列，包括小鼠和人的序 列。抗体可以由仅来自一种来源的序列组成，例如全人抗体，或者它们可以具有超过一种来 源的序列，例如产生嵌合抗体或人源化抗体。用于治疗用途的抗体优选尽可能地是待治疗 对象的天然抗体（例如人抗体用于人对象）。抗体的结合可以表示在特异性和亲和力方面。 特异性决定了哪一种抗原或其表位与结合结构域结合。亲和力是与特定抗原或表位的结合 强度的度量。特异性结合被定义为具有至少1x1(T5M、更优选1X1(T7M、更优选高于1X1(T9M 的亲和力（Kd)的结合。通常，对于治疗性应用的单克隆抗体具有高达lXlO^M或甚至更高 的亲和力。本文所用的术语"抗原"是指当其被引入体内时触发免疫系统的抗体产生的物 质或分子。抗原等可来源于病原生物体、肿瘤细胞或其他异常细胞，可衍生自半抗原，或甚 至是其自身结构。在分子水平上，抗原的特征是其能够与抗体的抗原结合位点结合。抗原 的混合物也可以被看作是"抗原"，即本领域技术人员应当理解的是，有时肿瘤细胞的裂解 物或病毒颗粒可以被表示为"抗原"，然而这样的肿瘤细胞裂解物或病毒颗粒制剂中存在许 多抗原决定簇。抗原包含至少一个，但往往更多个表位。本文所用的术语"表位"是指被免 疫系统、特别是抗体、B细胞，或T细胞识别的抗原部分。虽然表位通常被认为来源于非自 身蛋白质，但是来源于宿主的可被识别序列也可被认为归类为表位。
[0043] 术语"CH3结构域"在本领域中是公知的。IgG的结构有四条链，两条轻链和两条 重链；每条轻链具有两个结构域，可变轻链和恒定轻链（VL和CL)，且每条重链具有四个结 构域，可变重链（VH)和三个恒定重链结构域（CH1、CH2、CH3)。重链的CH2和CH3结构域区 域被称为Fc (可结晶片段）部分、Fc片段、Fc骨架或简单地Fc。IgG分子是具有两条重链 和两条轻链的异四聚体，其中所述重链是通过铰链区的二硫键（-S-S-)结合在一起的。重 链通过在CH3-CH3结构域界面的相互作用以及通过在铰链区的相互作用二聚化。铰链二硫 键的数目在免疫球蛋白亚类中各不相同（Papadea和Check 1989年）。免疫球蛋白分子的 Fc片段是重链两个C末端恒定区（即CH2和CH3结构域）的二聚体。其生理功能是与补体 系统以及与多种细胞表面上的特异性受体相互作用等。已知两条单独重链的CH3结构域之 间的相互作用在驱动重链二聚化中发挥重要作用。因此，CH3结构域指导抗体重链的缔合， 并且已知的是CH3结构域之间的界面包含有来自每条链的超过20个接触残基，所述接触残 基在CH3-CH3相互作用中发挥作用（Deisenhofer J.，Biochemistry 1981 (第20卷）第 2361-2370 页；Miller S.，J.Mol. Biol. 1990 (第 216 卷）第 965-973 页；Padlan，Advances in Protein Chemistry 1996 (第49卷）第57-133页）。本发明的CH3变体因此可以用于 与其他抗体结构域缔合，以产生双特异性的或单特异性的全长抗体。由VH/VL的组合所限 定抗体的特异性通常不影响由CH3结构域驱动的重链的二聚化行为。
[0044] 本文中使用的术语"接触残基"、"接触氨基酸"、"界面残基"和"界面氨基酸"通 常是指存在于CH3结构域中的任何可参与域间接触的氨基酸残基，如可以通过本领域已 知技术计算，包括计算存在和不存在第二链的情况下CH3结构域残基的溶剂可及表面积 (ASA)(Lee和RichardsJ.Mol.Biol. 1971 (55) 379)，其中这两种计算之间显示出ASA差异 ( >丨人2 )的残基被鉴定为接触残基。根据EU编号系统，已鉴定的接触残基包括在位置347、 349、350、351、352、353、354、355、356、357、360、364、366、368、370、390、392、394、395、397、 399、400、405、407、409、439 处的残基（表 A)。
[0045] 表A:CH3结构域界面残基列表
[0046]

【权利要求】
1. 一种用于从单个宿主细胞产生至少两种不同的免疫球蛋白样分子的方法，其中所述 两种免疫球蛋白样分子各自包含能够形成界面的两个CH3结构域，所述方法包括在所述细 胞中提供： a. 编码第一含CH3结构域之多肽链的第一核酸分子， b. 编码第二含CH3结构域之多肽链的第二核酸分子， c. 编码第三含CH3结构域之多肽链的第三核酸分子，和 d. 编码第四含CH3结构域之多肽链的第四核酸分子， 其中，所述核酸分子中的至少两种具有用于使所述第一含CH3结构域之多肽与所述第 二含CH3结构域之多肽以及使所述第三含CH3结构域之多肽与所述第四含CH3结构之多肽 链优先配对的手段，所述方法还包括培养所述宿主细胞并且使所述至少四种核酸分子能够 表达以及从培养物中收获所述至少两种不同的免疫球蛋白样分子的步骤。
2. 权利要求1所述的方法，其还包括为所述宿主细胞提供编码共同轻链的核酸分子。
3. 权利要求1或2所述的方法，其中所述第一含CH3结构域之多肽链包含氨基酸替换 T366K，并且所述第二含CH3结构域之多肽链包含氨基酸替换L351D。
4. 权利要求3所述的方法，其中所述第一含CH3结构域之多肽链还包含氨基酸替换 L351K〇
5. 权利要求3或4所述的方法，其中所述第二含CH3结构域之多肽链还包含选自 Y349E、Y349D和L368E的氨基酸替换。
6. 权利要求5所述的方法，其中所述第二含CH3结构域之多肽链还包含氨基酸替换 L368E〇
7. 权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述第三含CH3结构域之多肽链包含氨 基酸替换E356K和D399K，并且所述第四含CH3结构域之多肽链包含氨基酸替换K392D和 K409D〇
8. 权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述含CH3结构域之多肽链各自还包含 识别靶表位的可变区。
9. 权利要求8所述的方法，其中4个所述含CH3结构域之多肽链的4个可变区各自识 别不同的靶表位。
10. 权利要求8所述的方法，其中所述第一含CH3结构域之多肽链的可变区和所述第二 含CH3结构域之多肽链的可变区识别不同的靶表位，而所述第三含CH3结构域之多肽链的 可变区和所述第四含CH3结构域之多肽链的可变区识别相同的靶表位。
11. 权利要求10所述的方法，其中所述第三含CH3结构域之多肽链的可变区和所述第 四含CH3结构域之多肽链的可变区识别的靶表位与所述第一含CH3结构域之多肽链的可变 区或所述第二含CH3结构域之多肽链的可变区识别的靶表位相同。
12. 权利要求10所述的方法，其中所述第三含CH3结构域之多肽链的可变区和所述第 四含CH3结构域之多肽链的可变区识别的靶表位与所述第一含CH3结构域之多肽链的可变 区或所述第二含CH3结构域之多肽链的可变区识别的靶表位不同。
13. 权利要求8所述的方法，其中所述第一含CH3结构域之多肽链的可变区和所述第二 含CH3结构域之多肽链的可变区识别相同的靶表位，而所述第三含CH3结构域之多肽链的 可变区和所述第四含CH3结构域之多肽链的可变区识别不同于所述第一可变区和所述第 二可变区识别之靶表位的第二靶表位。
14. 权利要求8至13中任一项所述的方法，其中所述靶表位位于相同的靶分子上。
15. 权利要求14所述的方法，其中所述靶分子是可溶性分子。
16. 权利要求14所述的方法，其中所述靶分子是膜结合分子。
17. 权利要求8至13中任一项所述的方法，其中所述靶表位位于不同的靶分子上。
18. 权利要求17所述的方法，其中所述不同的靶分子在相同细胞上表达。
19. 权利要求17所述的方法，其中所述不同的靶分子在不同细胞上表达。
20. 权利要求17所述的方法，其中所述不同的靶分子是可溶性分子。
21. 权利要求17所述的方法，其中一种靶分子是可溶性分子，而第二种靶分子是膜结 合分子。
22. 根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述至少两种不同的免疫球蛋白 样分子是抗体。
23. 权利要求1所述的方法，其中所述用于优先配对的手段包括经改造的互补性结进 孔突变、二硫键、电荷突变或其组合。
24. 权利要求23所述的方法，其中所述用于优先配对的手段选自表B。
25. 权利要求1所述的方法，其中全部4种所述核酸分子均具有用于使所述第一含CH3 结构域之多肽与所述第二含CH3结构域之多肽以及使所述第三含CH3结构域之多肽与所述 第四含CH3结构域之多肽优先配对的手段，其中用于使所述第一含CH3结构域之多肽与所 述第二含CH3结构域之多肽优先配对的所述手段不同于用于使所述第三含CH3结构域之多 肽与所述第四含CH3结构域之多肽优先配对的那些手段。
26. 权利要求8至13、17至19或21中任一项所述的方法，其中至少一种所述靶表位位 于肿瘤细胞上。
27. 权利要求8至13、17至19或21中任一项所述的方法，其中至少一种所述靶表位位 于效应细胞上。
28. 权利要求27所述的方法，其中所述效应细胞是NK细胞、T细胞、B细胞、单核细胞、 巨噬细胞、树突状细胞或嗜中性粒细胞。
29. 权利要求27或28所述的方法，其中所述靶表位位于⑶3、⑶16、⑶25、⑶28、⑶64、 CD89、NKG2D 或 NKp46 分子上。
30. 可由根据权利要求1至29中任一项所述的方法获得的至少两种不同免疫球蛋白样 分子的混合物。
31. 根据权利要求30的混合物，其中所述至少两种免疫球蛋白样分子与相同抗原上的 不同表位和/或不同抗原上的不同表位结合。
32. 根据权利要求30或31的混合物，其中所述至少两种不同的免疫球蛋白样分子包括 至少一种异二聚体免疫球蛋白样分子。
33. 根据权利要求30至32中任一项的混合物，其中所述至少两种不同的免疫球蛋白样 分子中的两种是异二聚体免疫球蛋白样分子。
34. -种重组宿主细胞，其包含编码至少第一含CH3结构域之多肽链、第二含CH3结构 域之多肽链、第三含CH3结构域之多肽链和第四含CH3结构域之多肽链的核酸序列，其中所 述核酸序列中的至少两种具有用于使所述第一含CH3结构域之多肽与所述第二含CH3结构 域之多肽以及使所述第三含CH3结构域之多肽与所述第四含CH3结构域之多肽优先配对的 手段。
35. 根据权利要求34的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码共同轻链的核酸 序列。
36. -种药物组合物，其包含权利要求30至33中任一项所述的至少两种不同的免疫球 蛋白样分子以及可药用载体。
37. 根据权利要求36的药物组合物，其中所述至少两种不同的免疫球蛋白样分子是由 根据权利要求34或35的重组宿主细胞产生的。
38. -种用于制备用来产生至少两种不同的免疫球蛋白样分子的宿主细胞的方法，所 述方法包括向所述宿主细胞中引入编码至少第一含CH3结构域之多肽链、第二含CH3结构 域之多肽链、第三含CH3结构域之多肽链和第四含CH3结构域之多肽链的核酸序列，其中所 述核酸序列中的至少两种具有用于使所述第一含CH3结构域之多肽与所述第二含CH3结构 域之多肽以及使所述第三含CH3结构域之多肽与所述第四含CH3结构域之多肽优先配对的 手段，其中将所述核酸序列相继引入或同时引入。
39. 根据权利要求38的方法，其还包括向所述宿主细胞中引入编码共同轻链之核酸序 列的步骤。
40. -种权利要求34或35的重组宿主细胞的培养物或者由根据权利要求38或39的 方法获得的重组宿主细胞的培养物，其产生至少两种不同的免疫球蛋白样分子。
【文档编号】C07K16/46GK104520319SQ201380032190
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年4月19日 优先权日:2012年4月20日
【发明者】科内利斯·阿德里安·德克吕夫, 林达·约翰娜·阿莱达·亨德里克斯, 敦·洛格滕伯格 申请人:莫鲁斯有限公司