诱导骨生成和hedgehog 信号传导且抑制脂肪形成的氧固醇类似物氧固醇化合物133的制作方法
【专利摘要】本发明涉及，例如，具有以下结构(式I)的合成的化合物，氧固醇化合物133，或包含氧固醇化合物133和药学上可接受的载体的生物活性组合物或药物组合物。还公开了使用该化合物或生物活性组合物或药物组合物治疗多种疾病(包括例如骨病、肥胖症、心血管障碍和神经障碍)的方法。
【专利说明】诱导骨生成和hedgehog信号传导且抑制脂肋形成的氧固 醇类似物氧固醇化合物133
[0001] 本申请要求2012年5月7日提交的美国临时申请61/643, 746的优先权，其W其 整体在此引入作为参考。
[0002] 本发明在政府支持（Grant No. AR059794)下做出，且得到 P^Jational Institutes of化alth的嘉奖。政府具有本发明的一些权益。
【背景技术】
[0003] 生物制品通常在医学领域用于促进骨生长，包括骨折愈合和脊柱病症的手术处理 (1 - 4)。脊柱融合手术通常通过整形外科医生和神经外科医生等进行W解决影响腰椎和颈 椎的退行性椎间盘疾病和关节炎。从历史观点上说，自体骨移植物，通常从患者的骼晴采 取，已用于增加椎体节段（vertebral level)之间的融合。然而，相关供体位点发病率、增 加的手术时间和与收集自体骨移植物巧-7)相关的增加的血液损失提供了寻找安全和有 效替代品的动机。
[0004] 重组人骨形态发生蛋白-2 (rhBMP-2)通常用于促进人的脊柱融合。其用途在2002 年被美国食品和药物管理局（FDA)批准用于单水平前路椎体间融合巧）jhBMP-2的使用从 此显著增加，其用途的适应症已扩展到包括后路腰椎脊柱融合W及颈椎融合。尽管rhBMP-2 具有功效，但最近的报告质疑其在用于脊柱融合外科手术时的安全性。报告的并发症包括 皮下积液、软组织肿胀、椎体骨质溶解、异位骨形成、逆行射精和致癌巧-12)。而且，在其用 于颈椎时观察到气道水肿，促使抑A颁布了一项公共卫生的通知，警告其在颈椎手术中的 使用。迄今没有找到合适的替代品在诱导融合方面具有类似的功效而没有rhBMP-2的不利 作用（12)。
[0005] 氧固醇（oxysterol)形成存在于循环系统W及人和动物组织中的一大家族的胆 固醇的氧化衍生物。已发现氧固醇存在于动脉粥样硬化损伤中且在多种生理过程，如细胞 分化、炎症、调亡和类固醇产生中起作用。本
【发明者】中的一些之前报告了具体的天然存在的 氧固醇具有稳健的成骨性质（13)。最有效的成骨天然存在的氧固醇，20 (巧-轻基胆固醇 ("20S") (14)，当施加于能分化为成骨细胞和脂肪细胞的多能间质细胞时是成骨性的和抗 脂肪形成的。之前已进行20S的结构修饰W合成20S更有效的类似物，包括氧固醇化合物 34和氧固醇化合物49,已显示它们能通过活化hedgehog (化）信号传递（15)诱导骨髓基质 细胞（MSC)的成骨分化和抑制骨髓基质细胞（MSC)的成脂分化。此外，氧固醇化合物34和 氧固醇化合物49在后外侧脊柱融合的大鼠模型中体内刺激脊柱融合（15)。现有技术的氧 固醇分子具有广泛地和不可预测地改变的性质。仍然需要相比rhBMP-2和现有技术的氧固 醇新的改善的氧固醇，W提供增加的效能和增强的功效，且方便合成和具有较低制备成本。 新的氧固醇可为医师治疗例如长骨骨折、脊柱疾病和骨质疏松提供更可行的临床选择。
【专利附图】
【附图说明】
[0006] 图1显示成骨的氧固醇的分子结构。示出了 20(S)-轻基胆固醇（20S)、氧固醇化 合物34、氧固醇化合物49和氧固醇化合物133的分子结构。氧固醇化合物34与20S的不 同之处在于在C6上具有额外的0H基团且巧和C6之间的双键被消除。氧固醇化合物49 具有与氧固醇化合物34类似的结构且在C25和C27之间包括双键。氧固醇化合物133与 氧固醇化合物34和49的不同在于缺少C27和侧链长度增加一个碳。
[0007] 图2显示碱性磯酸酶活性通过氧固醇的剂量依赖性活化。融合的（图2A) C3HT101/2细胞或（图2B)M2-10B4细胞用对照载体或0. 125-lOuM氧固醇化合物133处 理。为直接与氧固醇化合物133比较，C3H细胞也用氧固醇化合物34和氧固醇化合物49(图 2A)处理。4天后，碱性磯酸酶（AL巧活性在全细胞提取物中测量。代表性H个单独的实验 的数据报告为一式H份测定值的平均值+SD且归一化为蛋白质浓度。（对于用0.25 UM或 更高剂量的所有氧固醇处理的细胞VS.对照载体处理的细胞，p<0. 0001)。
[000引图3显示氧固醇化合物133诱导成骨性分化。（图3A)融合的C3HT101/2细胞用 对照载体或2. 5 y M氧固醇化合物133在成骨介质中处理。成骨基因 Runx2、ALP、BSP、0SX 和0CN的表达在处理48小时（4她）、4、7和14天后通过定量实时PCR测量。代表性实验的 结果报告为一式H份测定值的平均值+SD。（在所有时间点对于ALP、BSP和0SX和在4、7 和14天对于Runx2和0CN，对于对照VS.氧固醇化合物133，p<0. 005)。（图3B)C3H10Tl/2 细胞用对照载体或2. 5 y M氧固醇化合物133处理3周。为检测细胞外矿化，进行von Kossa 染色，且矿化基质在光学显微镜（10幻下显示深黑染色。（图3C)在与炬）中描述的那些平 行的培养物中，矿化使用45Ca惨入测试定量（对于对照VS.所有浓度的氧固醇化合物133， p<0. 005)。（图3D)原代人MSC在成骨介质中用对照载体或5 y M氧固醇化合物133处理 4周。成骨基因0SX、BSP和0CN的表达通过定量实时PCR测量。代表性实验的结果报告为 一式H份测定值的平均值±SD (在对照VS.氧固醇化合物133处理的细胞中对于所有基因 p<0. 05)。（图祀）原代人MSC在成骨介质中用对照载体或0. 5、1和5 y M氧固醇化合物133 处理5周。为检测细胞外矿化，进行von Kossa染色且矿化基质在光学显微镜（10幻下显 示深黑染色。
[0009] 图4显示hedgehog途径在氧固醇化合物133-诱导的成骨性分化中的作用。（图 4A)C3H10Tl/2融合的细胞在成骨介质中用对照载体或氧固醇化合物133在存在或不存在 4 y M环把明（cyclopamine，切C)的情况下处理。4天后的ALP活性，和7天后成骨基因 ALP、 BSP和0SX的表达通过定量实时PCR测量（对于ALP活性和所有所示基因的表达，对于对照 VS.氧固醇化合物133, W及对于氧固醇化合物133VS.氧固醇化合物133+切C，p<0. 001)。 (图4B) C3H10T1/2细胞用对照质粒（P化3b)或包含細-Gli英光素酶报告物的质粒转染，且 用对照载体或氧固醇化合物133处理，且英光素酶活性在48小时后测定。代表性实验的结 果报告为一式H份测定值的平均值+SD。（对于对照VS. 100nM、250nM的氧固醇化合物133 W及1 y M氧固醇化合物133, p<0. 001)。（图4C)在不包含竞争剂或包含50 y M游离竞争 剂固醇（20S，氧固醇化合物133或氧固醇化合物16)的样品中比较被20S珠或对照珠捕获 的YFP-Smo的量。被珠捕获的YFP-Smo通过蛋白质印迹（上部）测量且与没有竞争剂的结 合反应中捕获的量对比绘图（下部）。
[0010] 图5显示通过BMP2和氧固醇化合物133形成的融合块的平片放射性照片。显示了 手术8周后指示组的两个代表性动物的化xitron图像。箭头（Arrowheads)表示缺少骨形 成；箭体（arrows)表示骨形成。组1(对照）；没有骨形成的横突间空间。组IUBMP2);桥 接骨量和在L4 - L5的双侧融合。组III (氧固醇化合物133, 20mg);桥接骨量和在L4 - L5 的双侧融合。组IV (氧固醇化合物133, 2mg);在显示通过氧固醇化合物133诱导融合的动 物中的桥接骨量和在L4 - L5的双侧融合。
[0011] 图6显示通过BMP2和氧固醇化合物133形成的融合块的显微CT。显示了指示组 的两个代表性动物的显微CT。箭头表示缺少骨形成；箭体表示骨形成。组1(对照）；没有 骨形成的横突间空间。组II @MP2);桥接横突间空间的骨量和在L4 - L5的双侧融合。组 III (氧固醇化合物133, 20mg);桥接横突间空间的骨量和在L4 - L5的双侧融合。组IV (氧 固醇化合物133, 2mg);在显示通过氧固醇化合物133诱导融合的动物中的桥接横突间空间 的骨量和在L4 - L5的双侧融合。组V (氧固醇化合物133,0. 2mg);在右侧远端的箭体指示 从L5横突的少量的骨形成。
[0012] 图7显示氧固醇化合物133对脊柱融合的效果的组织学分析。（图7A)显示了各 组的两个单独的代表性动物的冠状组织学切片（10幻。组1(对照）在横突间空间（箭头） 没有显著的骨形成。组II @MP2)证实在L4-L5(箭体）的桥接骨头，清楚证明形成融合 块的小梁骨和皮质骨。组III (氧固醇化合物133, 20mg)和组IV(氧固醇化合物133, 2mg) 试样证实在横突间空间（箭体）显著的骨形成，且小梁骨和皮质骨的形成与BMP2诱导的相 当。（图7B)源自组IUBMP2)和组111(氧固醇化合物133,20mg)的两个动物的冠状组织 学切片证实，在BMP2处理的动物的融合块中有显著的脂肪细胞形成，且在源自氧固醇处理 的动物的融合块中有明显较少的脂肪细胞（箭体，放大率20幻。
【发明内容】
[0013] 本
【发明者】在此鉴定了一种成骨的氧固醇，氧固醇化合物133,其非常适合于多种 临床用途，且描述了其在体外促进成骨性分化和在大鼠模型体内促进脊柱融合的能力。在 合成和测试的大量氧固醇类似物中，氧固醇化合物133出乎意料地特别有效且易于合成。 氧固醇化合物133诱导成骨标记Runx2、osterix(OSX)、碱性磯酸酶（ALP)、骨唾液蛋白质 炬S巧和骨巧蛋白（0CN)在C3H10T1/2小鼠胚胎成纤维细胞中的显著表达。氧固醇化合物 133-诱导的細-Gli英光素酶报道物的活化，其与Smoothened的直接结合，和氧固醇化合 物133-诱导的成骨作用被hedgehogOlh)途径抑制剂环把明的抑制作用，证实了化途径在 介导对氧固醇化合物133的成骨响应中的作用。此外，氧固醇化合物133诱导0SX、BSP和 0CN的表达且刺激原代人间质干细胞中稳健的矿化。在体内，在仅4周后在用氧固醇化合 物133处理的动物中在融合位点通过X-射线观察到双侧脊柱融合，且在8周后通过手动评 估、显微-CT和组织学证实，其具有与骨形态发生蛋白质-2炬MP2)相等的功效。然而，不像 BMP2,氧固醇化合物133没有在融合块中诱导脂肪形成且导致更致密的骨形成，如被更大 的BV/TV比例和更小的骨小梁分离所证实。因此氧固醇化合物133可用于治疗会受益于骨 形成的局部刺激的疾病，包括例如，脊柱融合，骨折修复，骨再生/组织工程应用，增加下颁 骨密度W用于种植牙，骨质疏松等。
[0014] 本
【发明者】还证实氧固醇化合物133抑制多潜能MSC细胞的脂肪形成。因此氧固醇 化合物133可用于治疗W下疾病，例如，黄瘤形成、脂肪垫的局部累积和服胖症。
[0015] 氧固醇化合物133的优点包括，例如，当与本
【发明者】研究的其它成骨的氧固醇相 比时更方便合成和改善的融合时间。氧固醇化合物133为小分子成骨的氧固醇，其可作为 下一代的骨合成治疗剂的一员，w及治疗多种其它疾病的有用药物，包括将受益于化途径 活性的刺激的疾病。
[0016] 本发明的一个方面为化合物，称为氧固醇化合物133,具有下式
[0017]
【权利要求】
1. 一种化合物，其为氧固醇化合物133,具有式I
或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
2. 生物活性组合物，其包含该化合物氧固醇化合物133和药学上可接受的载体。
3. 权利要求2的生物活性组合物，其进一步包含至少一种另外的试剂，其选自甲状旁 腺激素、氟化钠、胰岛素样生长因子I (ILGF-I)、胰岛素样生长因子II (ILGF-II)、转化生长 因子β (TGF-β)、细胞色素 P450抑制剂、成骨前列腺素类、BMP 2、BMP 4、BMP 7和BMP 14。
4. 治疗患有骨病、骨质疏松或骨折的受试者的方法，包括向受试者给药有效量的权利 要求2的生物活性组合物。
5. 权利要求4所述的方法，包括向受试者以治疗有效剂量以有效剂型在所选的间隔给 药该生物活性组合物以增加骨量。
6. 权利要求4所述的方法，包括向受试者以治疗有效剂量以有效剂型在所选的间隔给 药该生物活性组合物以改善骨质疏松症状。
7. 治疗需要增加骨形态形成和/或骨质增生的受试者的方法，包括向受试者给药有效 量的权利要求2所述的组合物。
8. 治疗受试者以诱导骨形成的方法，包括以有效剂型在所选的间隔给药权利要求2所 述的组合物以增加骨量。
9. 诱导哺乳动物的间质干细胞的成骨细胞分化和/或抑制哺乳动物的间质干细胞的 脂肪细胞分化的方法，包括将该细胞与有效量的权利要求2所述的组合物接触，其中该哺 乳动物的间质干细胞为受试者的骨髓基质细胞。
10. 治疗患有黄瘤形成、脂肪垫局部聚集和肥胖症的受试者的方法，包括向受试者给药 有效量的权利要求2的生物活性组合物。
11. 在细胞或组织中刺激hedgehog(Hh)途径介导的响应的方法,包括将该细胞或组织 与有效量的权利要求2的生物活性组合物接触。
12. 权利要求11所述的方法，其中所述hedgehog(Hh)途径介导的响应为成骨细胞分 化、骨形态形成、骨质增生的刺激，和/或脂肪细胞分化、脂肪细胞形态发生和/或脂肪细胞 增殖的抑制。
13. 权利要求11所述的方法，其中所述hedgehog(Hh)途径介导的响应为毛发生长的刺 激。
14. 权利要求11所述的方法，其中所述hedgehog(Hh)途径介导的响应为血管生成的刺 激。
15. 权利要求14所述的方法，其为治疗心血管障碍、动脉硬化、心肌梗塞、外周血管疾 病和/或中风的方法。
16. 权利要求11所述的方法，其中所述hedgehog(Hh)途径介导的响应为软骨形成的刺 激。
17. 权利要求16所述的方法，其为治疗骨关节炎的方法。
18. 治疗受试者以诱导骨形成的方法，包括： 收集哺乳动物的间质干细胞； 用权利要求2的生物活性组合物处理哺乳动物间质细胞以诱导该细胞的成骨细胞分 化；和 将该分化的细胞给予受试者。
19. 权利要求4-17任一项所述的方法，其中将所述生物活性组合物局部给予受试者的 细胞、组织或器官。
20. 刺激哺乳动物细胞以使成骨细胞分化的生物标记表达水平大于未处理的细胞中的 生物标记水平的方法，包括将哺乳动物细胞暴露于有效量的权利要求1所述的化合物。
21. 权利要求20所述的方法，其中所述生物标记为碱性磷酸酶活性、钙掺入、矿化和/ 或骨钙蛋白mRNA的表达。
22. 权利要求20所述的方法，其中该哺乳动物细胞为间质干细胞、骨原细胞或颅盖器 官培养物中的细胞。
23. 权利要求20所述的方法，其中所述细胞或组织在体外。
24. 权利要求20所述的方法，其中所述细胞或组织在体内。
25. 用于人或动物体的植入物，其包含具有表面的基材，其中该植入物的表面或内部包 含足以在周围骨组织诱导骨形成的量的权利要求2的生物活性组合物。
26. 权利要求25所述的植入物，其中所述基材形成针、螺杆、板或人工关节的形状。
【文档编号】C07J9/00GK104395331SQ201380033045
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2013年3月15日 优先权日:2012年5月7日
【发明者】F.帕哈米, M.E.琼格, F.斯塔彭贝克 申请人:加利福尼亚大学董事会