从水蛭冻干品中分离具有抗氧化活性的蛋白的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从水蛭冻干品中分离具有抗氧化活性的蛋白的方法。第一步将活体水蛭冷冻干燥，第二步超微粉碎，取冻干粉，第三步，向水蛭冻干粉中加入是冻干粉体积15倍的生理盐水，第四步，搅拌均匀后放入冰水中经过6小时冰浴，第五步，将溶液放入离心机中以每分钟8000转离心15分钟，第六步，沉淀后收集上清液，第七步，收集的上清液用10000分子量透析袋透析后冷冻干燥。可以直接从水蛭中提取出抗氧活性高、无毒害的蛋白。通过实施该方法可以达到采集工序简化、人工操作劳动强度低的优点。
【专利说明】从水蛭冻干品中分离具有抗氧化活性的蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种从水蛭冻干品中分离具有抗氧化活性的蛋白的方法，尤其是从宽体金线蛭中提取蛋白的方法。
【背景技术】
[0002]宽体金线蛭入药历史悠久，早在我国医学名著《神农本草经》和《本草纲目》中就有记载，自古至今被中医界称为一种袪病救人的良药，可以治疗跌打损伤、高血压、冠心病和肿瘤等，还可用于断肢(指)再植的术后辅助治疗。1996年召开的全国活血化瘀学术会上，水蛭被确定为35种活血化瘀的中药材之一，目前，水蛭已成为中西药及饲料工业不可缺少的原料，我国批准生产的以水蛭为主要原料的中药有几十种，水蛭体内含有的抗凝血物质即水蛭素，是拒绝“三高人群”的良药。现代科技发现，水蛭不但能制药，而且能生产保健品、化妆品，甚至国内有些地区已将宽体金线蛭经加工后走上餐桌。我们研究发现宽体金线蛭除了含有水蛭素外，还含有丰富的抗氧化活性的蛋白，能够抑制超氧阴离子自由基(02-)、羟自由基(OH)的产生，防止红细胞因过氧化氢氧化溶血和肝脂质过氧化。活性氧自由基对机体具有巨大的损伤作用，如会引起蛋白质损伤、酶失活、膜质过氧化，导致衰老、肿瘤、动脉粥样硬化等许多疾病的发生。人工合成的二丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基甲氧基(BHA)、丙二醇(PG)等具有较好的清除活性氧自由基的作用，常用作食品添加剂，但近年研究表明，BHT、BHA, PG具有致癌作用。因此筛选对人体安全、高效的活性氧清除剂有着重要的意义。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题是提供一种提取水蛭中具有抗氧化活性的蛋白的方法。
[0004]为解决上述技术问`题，本发明采用如下技术方案:该从水蛭冻干品中分离具有抗氧化活性的蛋白的方法，
[0005]第一步将活体水蛭冷冻干燥，
[0006]第二步超微粉碎，取冻干粉，
[0007]第三步，向水蛭冻干粉中加入是冻干粉体积15倍的生理盐水，
[0008]第四步，搅拌均匀后放入冰水中经过6小时冰浴，
[0009]第五步，将溶液放入离心机中以每分钟8000转离心15分钟，
[0010]第六步，沉淀后收集上清液，
[0011]第七步，收集的上清液用10000分子量透析袋透析后冷冻干燥。
[0012]本发明采用上述技术方案:可以直接从水蛭中提取出抗氧活性高、无毒害的蛋白。通过实施该方法可以达到采集工序简化、人工操作劳动强度低的优点。
【具体实施方式】
[0013]本实施例以提取宽体金线蛭中的蛋白为例，首先将活体宽体金线蛭冷冻干燥，接着利用超微粉碎机超微粉碎，取冻干粉。向取得的冻干粉中加入是冻干粉体积15倍的生理盐水，搅拌均匀后放入冰水中经过6小时冰浴。然后,将溶液放入离心机中以每分钟8000转离心15分钟，待沉淀后收集上清液，收集的上清液用10000分子量透析袋透析后冷冻干燥即获得所需的抗氧化活性蛋白。
[0014]通过下述方法测定抗氧化活性，
[0015]第一步，羟基自由基清除活性测定，向试管中加入一系列不同浓度的蛋白溶液 1.0ml, FeSO4 (0.98mmol/l),溶液 2.0mL,水杨酸-乙醇 1.5ml (1.8mmol/l),最后加H2O2 (0.03%) 0.1ml启动反应，振荡混合，水浴37°C，保温30min，在波长510nm测定各组吸光度值。用纯净水调零，对照管用Iml纯净水代替样品。
[0016]羟基自由基清除率计算公式为:
[0017]D= [(A0-As) / A0] *100%
[0018]式中，Atl为空白管的吸光度，As为加入自由基清除剂后的吸光度，以抗坏血酸做阳性对照。
[0019]第二步，超氧阴离子自由基清除活性测定，利用邻苯三酚自氧化体系测定样品对超氧阴离子自由基的清除能力。取2.5mL50mmol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲溶液，加入2mL不同浓度的样品溶液，于25°C保温20min。然后加入20ul25°C预温的30mmol/L邻苯三酚，混匀后迅速加入干燥的比色皿中，在波长325nm处，从吸光度值达到0.2起，每隔30s测定I次吸光度值，测定4min内的吸光度变化值。以等量的lOmmol/L HCl代替邻苯三酚调零。空白组以等量的纯净 水代替样液。
[0020]超氧阴离子自由基清除率XAVse-AVg) /AV空白*100%
[0021 ] 以抗坏血酸做阳性对照。
[0022]第三步，总抗氧化能力测定。使用总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS法)。ABTS工作母液配制后，室温避光存放12-16h后，用PBS稀释成ABTS工作液。96孔板的每个检测孔中加入200 μ L ABTS工作液。空白对照孔中加入10 μ L蒸馏水；标准曲线检测孔内加入10 μ L0.15,0.3,0.6,0.9、1.2、1.5mmol/L 的 Trolox 标准溶液；样品检测孔内加入 10 μ L 的样品溶液。轻轻混匀。室温孵育4min后，于734nm下测定吸光值。根据标准曲线计算出样品的总抗氧化能力。维生素C的抗氧化能力为1.0。
[0023]第四步蛋白浓度测定。使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒。分别取0.5mg/ml蛋白标准品O、1、2、4、8、12、16、20uI加到96孔板的标准品孔中，各孔加入200uI G250染色液，室温静止3min，用酶标仪测定A595，做出标准曲线。样品孔中加入20ul—定浓度的蛋白样品，步骤同上，根据标准曲线计算样品浓度。
[0024]如图1所示，蛋白标准曲线。
[0025]如图2所示，水蛭冻干品清除羟基自由基清除活性。
[0026]如图3所示，水蛭冻干品清除羟基自由基活性较抗坏血酸强。
[0027]如图4所示，水蛭冻干品清除超氧阴离子自由基活性。
[0028]如图5所示，水蛭冻干品清除超氧阴离子自由基活性较抗坏血酸弱。
[0029]水蛭冻干品总抗氧化活性，如图6所示，总抗氧化能力标准曲线，经计算水蛭冻干品总抗氧化活性为0.14mmol/ug。
【权利要求】
1.一种从水蛭冻干品中分离具有抗氧化活性的蛋白的方法，其特征在于:第一步将活体水蛭冷冻干燥，第二步超微粉碎，取冻干粉，第三步，向水蛭冻干粉中加入是冻干粉体积15倍的生理盐水，第四步，搅拌均匀后放入冰水中经过6小时冰浴，第五步，将溶液放入离心机中以每分钟8000转离心15分钟，第六步，沉淀后收集上清液，第七步，收集 的上清液用10000分子量透析袋透析后冷冻干燥。
【文档编号】C07K1/14GK103755779SQ201410001919
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月2日 优先权日:2014年1月2日
【发明者】徐海圣, 尹娜, 陆萍, 彭彩娥 申请人:浙江大学湖州市南太湖现代农业科技推广中心