一种胶原蛋白膜片材料的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种胶原蛋白膜片材料的制备方法，该方法先将动物皮在弱碱性溶液中清洗干净，然后在含Na2S和Ca（OH）2的水溶液中，对动物皮进行脱毛清洗处理，再使用弱酸性铵盐调节溶液的pH值在6-8，获得胶原纤维层后，将胶原纤维层加丙酮进行多次脱脂后，风干，获得原料；然后将原料进行破碎，纯化，精制和冻干得到所述的胶原蛋白膜片材料，该胶原蛋白膜片材料质地柔韧、粘附性好、盐分含量低、具有完整3D结构、生物活性和生物安全性都好，非常适合于临床应用。
【专利说明】一种胶原蛋白膜片材料的制备方法 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明涉及胶原蛋白纯化方式【技术领域】，尤其涉及一种以动物皮为原料制备胶原 蛋白膜片材料的方法。 【背景技术】
[0002] 胶原蛋白是动物体内含量最多，分布最为广泛的蛋白质。是机体的主要结构蛋白， 是构成组织和结缔组织的主要组成成分。它所特有的三重螺旋的氨基酸链结构赋予了它许 多有用的特性：如高拉伸强度、生物降解性能、低抗原活性、低刺激性和细胞毒性以及促进 细胞生长的特性。所有的这些特点使其成为理想的生物医用材料。
[0003] 胶原蛋白的临床用途非常广泛，已证实的作用有：促进伤口愈合和肉芽组织的生 长、止血功能、填充作用以及生物支架等。其中胶原蛋白的止血作用非常突出。同时，它和窄 伤口的愈合过程中起到关键作用的生长因子之间也存在着特殊的亲和力。在血液凝固后， 胶原蛋白还可以通过刺激组织的再生和修复来防止再次出血的发生。
[0004] 在医学中，特别是外科治疗中，胶原蛋白被主要应用于如下领域：创伤治疗与控 制，特别是特殊的疮口如糖尿病造成的肢体溃疡，自2010年来，FDA陆续批准两种新型胶原 蛋白类海绵或胶体系列产品作为全功能性创伤控制药品，特别推荐用于糖尿病造成的溃疡 治疗和除3度烧伤以外的全部创伤控制（Cellerate和Excellagen)，并且有多种用于创伤 控制和治疗的胶原蛋白海绵或胶体产品正在临床试验中；在骨外科，胶原蛋白海绵，胶原蛋 白膜片，被广泛应用于骨填充和软骨损伤修复；脑外科，脑硬膜创伤修复的填充，也大量使 用胶原蛋白膜材料。
[0005] 正常人在受到损伤和创伤发生出血时，机体就会在受损伤的局部发生一系列的生 理反应来控制出血。胶原蛋白不仅在局部刺激了血小板的黏附和聚集，还激活了凝血系统， 从而达到局部止血的目的。在大多数情况下，特别是在一些病理情况下（如创面较大、创面 较深、血小板数量或者活性不足以确保凝血功能等），生理性的止血很难达到控制出血的目 的。而此时适当的补充外源性的胶原蛋白，可以对局部止血有明显的促进作用，从而达到满 意的止血效果。
[0006] 组织损伤修复一般分为三个阶段：（1)局部炎症反应阶段；（2)细胞增殖分化和肉 芽组织生成阶段；(3)组织修复塑形阶段。在哺乳动物中，大部分的组织损伤，不管是内部 的还是外部的，都经由凝血块的产生，纤维化和功能的修复而愈合。但是，大部分组织没有 完全恢复到他原来的结构和功能。例如，当皮肤损伤仅涉及到外皮和表皮层时，表皮会通过 伤口边缘的细胞迁移而再生；但当伤口涉及到表皮或皮肤下层时，缺损的皮肤将被瘢痕组 织替代，而表皮将在瘢痕组织上再生。添加外源性的胶原蛋白，可以起到止血，隔绝病菌，通 气等一般性的敷料特征，同时还能对伤口修复起到调节作用，刺激胶原蛋白酶的表达，避免 胶原蛋白的过度增生，减少或者避免瘢痕性疙瘩的产生。而在特定组织，比如软骨组织，其 发生创伤后，自我修复能力非常弱，通过组织工程技术可以帮助修复恢复其原有功能，胶原 蛋白膜片是其首选材料。
[0007] 一般胶原蛋白膜片的制备方法为通过酶解，酸提取等方式制备胶原蛋白原料，然 后通过与其他材料交联或者通过异戊二醛等交联剂交联制备。通过酶解步骤，使其较易溶 于水，便于其后续的分离纯化，但是以胶原蛋白完整结构的破坏作为代价，使其无法直接形 成具有足够强度的胶原蛋白膜材料，其应用受到限制；使用交联方式主要是为了增加其强 度，延长体内的降解时间，但这又带来了交联剂的残留问题，降低了其生物安全性，并在其 代谢过程中加重肝脏负担。
[0008] 而另外一种方式是采用加热酸或者碱提取方式制备明胶敷料，热处理使蛋白发生 变性，此类膜材料失去了其生物活性，只能作为创伤敷料，其止血效果也不如胶原蛋白海绵 类材料。
[0009] 因此，需要找到一种具有完整3D结构，生物活性和生物安全性都好的胶原蛋白膜 片材料的制备方法，以便适用于临床应用。
【发明内容】
[〇〇1〇] 本发明要解决的技术问题是针对目前胶原蛋白膜材料生物活性和生物安全性不 高等问题，提供一种质地柔韧、粘附性好、盐分含量低、具有完整3D结构、生物活性和生物 安全性都好的胶原蛋白膜片材料的制备方法。
[〇〇11] 为解决上述技术问题，本发明所述的胶原蛋白膜片材料的制备方法是按照以下步 骤进行的：
[0012] (1)原料的准备
[〇〇13] 将动物皮洗净后投入转鼓，对动物皮进行清洗和脱毛处理，然后使用片皮机将动 物皮上的下层附肉和上层表皮去除，获得胶原纤维层，将胶原纤维层加丙酮进行多次脱脂 后，风干，获得原料；
[0014] ⑵胶原纤维的破碎
[0015] 将步骤（1)得到的胶原纤维层原料采用物理方式破碎后，将其加入挥发性酸溶液 中浸泡脱除盐分，将胶原纤维层与盐酸的混合液放于分散机中以5?50m/s的速度分散，获 得粗提液；
[0016] (3)胶原蛋白的纯化
[〇〇17] 将步骤（2)得到的胶原蛋白粗提液通过不锈钢筛网或者纱布过滤，除去不溶性的 大颗粒杂质和未分散的胶原纤维；
[0018] ⑷胶原蛋白的精制
[〇〇19] 将步骤⑶得到的滤液采用透析方式进行透析，去除H+，盐和杂质；
[0020] (5)冻干
[0021] 采用程序化冻干方式将步骤（4)得到的精制胶原蛋白进行冻干，即得到所述的胶 原蛋白膜片。
[0022] 进一步的，本发明所述步骤（1)中对动物皮进行清洗和脱毛的处理过程是按照以 下步骤进行的：加入动物皮质量一倍以上的弱碱液搅拌2h，并用清水清洗，然后将动物皮 置于动物皮质量1?5倍的含Na 2S和Ca (0H) 2的水溶液中，对动物皮进行脱毛处理，再使用 弱酸性铵盐调节溶液的pH值在6-8之间，将动物皮洗净。
[0023] 再进一步的，本发明步骤（1)中所述的弱碱液是0. 1?5%的Na2C03溶液；所述 Na2S和Ca(OH)2的水溶液，其中Na2S和Ca(OH) 2的质量分数是1?10% ;所述弱酸性铵盐 为1-10%的順4(：1溶液。
[0024] 进一步的，本发明步骤（2)所述的挥发性酸溶液为0. 05?0. 5M的HC1溶液。
[0025] 进一步的，本发明步骤（4)胶原蛋白的精制也可以采用超滤方式，膜为中空纤维 膜，膜孔径为5k_50k道尔顿，采用切向流方式进行，超滤至pH值达到4-7为止。
[0026] 本发明在对胶原蛋白进行冻干时采用程序化冻干方式，先将胶原蛋白粗提液放入 容器，经过预冻，主干燥，后干燥程序制备胶原蛋白膜片。
[0027] 本发明所述的方法除了可以制作胶原蛋白膜片外，还可以用于胶原蛋白海绵以及 泡沫的制备。
[0028] 本发明涉及的胶原蛋白膜片适用于二类医疗器械创伤敷料，也适用于三类医疗器 械止血材料，同时可以作为细胞培养的支架材料用于组织工程修复。
[0029] 本发明涉及产品原料可使用牛皮、猪皮等，不限于某一特定动物种类。
[0030] 采用了上述技术方案后，本发明具有以下的有益效果：
[0031] (1)通过纯物理方式提取，避免了酶解等工艺对胶原蛋白的破坏，使其具有完整的 3D结构，确保了其生物活性；
[0032] (2)产品具有非常好的生物安全性产品通过盐酸破坏杂质，使其通过透析或者超 滤去除，产品纯度达到95%以上，无杂蛋白。制备工艺不需要经过交联，即可达到较高的强 度和生物耐降解性，避免了交联剂的带入。
[0033] (3)产品质地柔韧、粘附性好、盐分含量低，符合临床的要求。 【具体实施方式】
[〇〇34] 为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体实施例对本发明作进一 步详细的说明
[0035] 实施例1
[0036] (1)原料的准备
[0037] 将牛皮洗净后投入转鼓，加入动物皮质量一倍以上的1 %的Na2C03搅拌2h，并用清 水清洗，然后将牛皮置于牛皮质量1?5倍的含1 % Na2S和5%的Ca (0H)2的水溶液中，对 牛皮进行脱毛处理，再使用5%的NH4C1调节溶液的pH值在6-8之间，将牛皮洗净，然后使 用片皮机将牛皮上的下层附肉和上层表皮去除，获得胶原纤维层，将胶原纤维层加丙酮进 行多次脱脂后，风干，获得原料；
[0038] (2)胶原纤维的破碎
[0039] 将步骤（1)得到的胶原纤维层原料采用物理方式破碎后，将其加入0. 2mol/L的挥 发性酸溶液盐酸中浸泡脱除盐分，将胶原纤维层与盐酸的混合液放于分散机中分散，其线 速度为5_50m/s，直至无可见碎屑为止，获得粗提液；
[0040] (3)胶原蛋白的纯化
[0041] 将步骤（2)得到的胶原蛋白粗提液过滤，除去不溶性的大颗粒杂质和未分散的胶 原纤维；
[0042] (4)胶原蛋白的精制
[0043] 将步骤⑶得到的滤液采用透析方式进行透析，去除H+，盐和杂质；
[0044] (5)冻干
[0045] 采用程序化冻干方式将步骤（4)得到的精制胶原蛋白进行冻干，即得到所述的胶 原蛋白膜片。
[0046] 实施例2
[0047] 实施例2用于说明本发明提供的胶原蛋白膜片的制备方法。
[0048] 采用与实施例1相同的方法制备胶原蛋白产品，不同的是，步骤（1)是按照以下步 骤进行的：将猪皮洗净后投入转鼓，加入猪皮质量一倍以上的〇. 1 %的Na2C03搅拌2h，并用 清水清洗，然后将猪皮置于猪皮质量1?5倍的含10% Na2S和10% Ca(0H)2的水溶液中， 对猪皮进行脱毛处理，再使用1 %的NH4C1调节溶液的pH值在6-8之间，将猪皮洗净，然后 使用片皮机将猪皮上的下层附肉和上层表皮去除，获得胶原纤维层，将胶原纤维层加丙酮 进行多次脱脂后，风干，获得原料。
[0049] 实施例3
[0050] 实施例3用于说明本发明提供的胶原蛋白膜片的制备方法。
[0051] 采用与实施例1相同的方法制备胶原蛋白产品，不同的是，步骤（1)是按照以下步 骤进行的：将牛皮洗净后投入转鼓，加入牛皮质量一倍以上的5%的Na 2C03搅拌2h，并用清 水清洗，然后将牛皮置于牛皮质量1?5倍的含1% Na2S和1% Ca(0H)2的水溶液中，对牛 皮进行脱毛处理，再使用10%的NH4C1调节溶液的pH值在6-8之间，将牛皮洗净，然后使用 片皮机将牛皮上的下层附肉和上层表皮去除，获得胶原纤维层，将胶原纤维层加丙酮进行 多次脱脂后，风干，获得原料。
[0052] 实施例4
[0053] 实施例4用于说明本发明提供的胶原蛋白膜片的制备方法。
[0054] 采用与实施例1相同的方法制备胶原蛋白产品，不同的是，步骤（2)中采用的挥发 性酸溶液盐酸的浓度是〇. 〇5mol/L。
[0055] 实施例5
[0056] 实施例5用于说明本发明提供的胶原蛋白膜片的制备方法。
[〇〇57] 采用与实施例1相同的方法制备胶原蛋白产品，不同的是，步骤（2)中采用的挥发 性酸溶液盐酸的浓度是〇. 5mol/L。
[0058] 实施例6
[0059] 实施例6用于说明本发明提供的胶原蛋白膜片的制备方法。
[0060] 采用与实施例1相同的方法制备胶原蛋白产品，不同的是，步骤（4)胶原蛋白的精 制采用超滤方式，膜为中空纤维膜，膜孔径为5k-50k道尔顿，采用切向流方式进行，超滤至 pH值为4-7。
[0061] 将本发明实施例1得到的胶原蛋白膜片材料进行性能测定，得到的各参数指标见 表1
[0062] 表1实施例1胶原蛋白膜片材料的参数指标
[0063]
【权利要求】
1. 一种胶原蛋白膜片材料的制备方法，其特征在于该方法是按照以下步骤进行的： (1) 原料的准备 清洗动物皮去除盐渍和污物，将动物皮进行进一步清洗去除油污，然后进行脱毛处理， 最后将动物皮上的下层附肉和上层表皮去除，获得胶原纤维层，再将胶原纤维层进行多次 脱脂后，风干，获得原料； (2) 胶原纤维的破碎 将步骤（1)得到的胶原纤维层原料采用物理方式破碎后，将其加入挥发性酸溶液中浸 泡脱除盐分，将胶原纤维层与盐酸的混合液放于分散机中进行分散，分散至无可见碎屑为 止，获得粗提液； (3) 胶原蛋白的纯化 将步骤（2)得到的胶原蛋白粗提液过滤，除去不溶性的大颗粒杂质和未分散的胶原纤 维； (4) 月父原蛋白的精制 去除步骤（3)得到的滤液中的酸、盐和杂质，得到精制胶原蛋白； (5) 冻干 将步骤（4)得到的精制胶原蛋白进行冻干，即得到所述的胶原蛋白膜片。
2. 根据权利要求1所述的一种胶原蛋白膜片材料的制备方法，其特征在于步骤（1)中 对动物皮进行清洗和脱毛处理的方法是按照以下步骤进行的：首先将动物皮投入转鼓，向 转鼓中加入动物皮质量一倍以上的弱碱液并搅拌2h，然后用清水清洗，然后将动物皮置于 动物皮质量1~5倍的含Na 2S和Ca (0H)2的水溶液中，对动物皮进行脱毛处理，再使用弱酸 性铵盐调节溶液的pH值在6-8之间，将动物皮洗净。
3. 根据权利要求2所述的一种胶原蛋白膜片材料的制备方法，其特征在于步骤（1)中 所述的弱碱液是〇. 1~5%的Na2C03溶液。
4. 根据权利要求2所述的一种胶原蛋白膜片材料的制备方法，其特征在于步骤（1)中 所述Na2S和Ca (OH) 2的水溶液，其中Na2S和Ca (OH) 2的质量分数分别是1~10%。
5. 根据权利要求1或2所述的一种胶原蛋白膜片材料的制备方法，其特征在于步骤 (1)中所述弱酸性铵盐为1~1〇%的NH4C1溶液。
6. 根据权利要求1所述的一种胶原蛋白膜片材料的制备方法，其特征在于步骤（2)中 所述的挥发性酸溶液为〇. 05~0. 5mol/L的盐酸溶液。
7. 根据权利要求1所述的一种胶原蛋白膜片材料的制备方法，其特征在于所述的步骤 (4)胶原蛋白的精制的方法为采用透析方式进行透析，将粗提液装入透析袋中，两边扎紧， 放入双蒸水中进行透析，多次透析后将凝胶取出。
8. 根据权利要求1所述的一种胶原蛋白膜片材料的制备方法，其特征在于所述的步骤 (4)胶原蛋白的精制的方法为采用超滤方式，膜为中空纤维膜，膜孔径为5-50k道尔顿，采 用切向流方式进行，超滤至pH值达到4-7。
9. 根据权利要求1所述的一种胶原蛋白膜片材料的制备方法，其特征在于：步骤（1)中 脱脂的方法为使用丙酮浸泡并搅拌。
【文档编号】C07K1/34GK104098783SQ201410272626
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年6月18日 优先权日:2014年6月18日
【发明者】钱陈, 杨双双, 高坚杰 申请人:常州药物研究所有限公司