一种西那普肽的多肽合成方法

一种西那普肽的多肽合成方法
【专利摘要】本发明公开了一种西那普肽的多肽合成方法，包括如下步骤：以2-氯-三苯基氯树脂起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护21肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，TFA切肽后，获得粗品，粗品经C18柱分离纯化，冻干后，制得西那普肽精品。本发明的方法，工艺稳定，原辅材料来源方便，生产周期短，收率高，质量稳定，生产成本低，接肽收率高，避免使用氟化氢等剧毒试剂，三废污染少。每步接肽收率均在98.5%以上；切肽后收率为：98.3%，总收率为：47.9%，HPLC测定产品纯度为：99.6%。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明涉及西那普肽的制备方法，尤其涉及固相多肽合成西那普肽的制备方法。 一种西那普肽的多肽合成方法

【背景技术】
[0002] 西那普肽，英文名：Surfaxin，Sinapultide，分子式：C126H238N 26022 ;CAS 登记号： 138531-07-4 ;分子量：2469. 5 ;碳、氢、氮比例：C :61. 28%，H :9. 71%，N :14. 75%。氨基酸序 列： H-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu -Leu-Leu-Lys-〇H ； 结构式：

【权利要求】
1. 一种西那普肽的多肽合成方法，其特征在于，包括如下步骤：以2-氯-三苯基氯 树脂起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸Fmoc-Lys (Boc)-0H、 Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys (Boc)-OH进行缩合反应，获得保护二^ 肽树脂，其间依次脱去 Fmoc-保护基团，同步进行脱侧链保护基团；切肽，获得西那普肽粗品；纯化后制得西那普 肽。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述按照固相合成的方法，获得保护 二十一肽树脂，包括如下步骤： 一、 制备 Fmoc-Lys (Boc)-树脂 1) 取2-氯-三苯基氯树脂用DMF浸泡，使树脂充分溶胀，加 DIPEA，Fmoc-Lys (Boc) -0H， 反应，再加甲醇，反应； 2) 抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 二、 制备 Fmoc-Leu-Lys (Boc)-树脂 1) 加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-0H、HATU、H0At，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应； 3) 抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干； 三、 制备 Fmoc-Leu-Leu-Lys (Boc)-树脂 1) 加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应； 3) 抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干； 四、 制备 Fmoc-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc)-树脂 1) 加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应； 3) 抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干； 五、 制备 Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc)-树脂 1) 加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应； 3) 抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干； 六、 制备 Fmoc-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc)-树脂 1) 加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取 Fmoc-Lys (Boc) -OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，反应； 3) 抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 七、 制备 Fmoc-Leu-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc)-树脂 1) 加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应； 3) 抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干； 八、 制备 Fmoc-Leu-Leu-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc)-树脂 1) 加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应； 3) 抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干； 九、制备 Fmoc-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc)-树脂 1) 加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应； 3) 抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗涤三次，抽干； 十、制备 Fmoc-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (tBu)-树月旨 1) 加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应； 3) 抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 十一>制备 Fmoc-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc)- 树脂 1) 加脱帽试剂，反应，抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Lys (Boc) -OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应； 3) 抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 十二> 制备 Fmoc-Lue-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (B 〇c)_树脂 1) 加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应； 3) 抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 十三> 制备 Fmoc-Leu-Lue-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-L ys (Boc)-树脂 1) 加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应； 3) 抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 十四 > 制备 Fmoc-Leu-Lue-Lue-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-L eu -Lys(Boc)-树脂 1) 加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应； 3) 抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 十五 >制备 Fmoc-Leu-Lue-Leu-Lue-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc) -Leu-Leu-L eu_ Leu-Lys(Boc)-树脂 1) 加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应； 3) 抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 十六> 制备 Fmoc-Lys (Boc) -Leu-Lue-Leu-Lue-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc)-Leu- Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-树脂 1)加脱帽试剂，反应，抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取 Fmoc-Lys (Boc) -OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，反应； 3) 抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 十七、制备 Fmoc-Lue-Lys (Boc) Leu-Lue-Leu-Lue-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Bo c) -Leu -Leu-Leu-Leu-Lys (Boc)-树月旨 1) 加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应； 3) 抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 十八、制备 Fmoc-Lue-Lue-Lys (Boc) Leu-Lue-Leu-Lue-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Ly s (Boc) -Leu -Leu-Leu- Leu-Lys (Boc)-树脂 1) 加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应； 3) 抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 十九> 制备 Fmoc-Lue-Lue-Lue-Lys (Boc) Leu-Lue-Leu-Lue-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Le u_ Lys (Boc)-Leu-Leu-Leu- Leu-Lys (Boc)-树月旨 1) 加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应； 3) 抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 二十> 制备 Fmoc-Lue-Lue-Lue-Lue-Lys (Boc) Leu-Lue-Leu-Lue-Lys (Boc) -Leu-Leu-Le u- Leu-Lys (Boc) -Leu -Leu-Leu-Leu-Lys (Boc)-树月旨 1) 加脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取Fmoc-Leu-OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，加入反应容器，反应； 3) 抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 二十一、制备 Fmoc-Lys (Boc) -Lue-Lue-Lue-Lue-Lys (Boc) -Leu-Lue-Leu-Lue-Lys (Boc )-Leu- Leu-Leu-Leu-Lys(Boc)-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc)-树月旨 1) 加脱帽试剂，反应，抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 2) 取 Fmoc-Lys (Boc) -OH、HATU、HOAt，用接肽试剂溶解，反应； 3) 抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 4) 加脱帽试剂，反应，抽干，用DMF、甲醇和DMF洗漆，抽干； 所述接肽试剂为：DIPEA : DMF=1 : 10,体积比； 所述脱帽试剂为：PIP : DMF=24. 5 : 75. 5,体积比； 所述接肽反应温度为：〇_5°C ;接肽时间为：55分钟； 所述脱帽反应温度为：21_23°C ;脱帽时间18分钟。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述2-氯-三苯基氯树脂取代度为： 0·45-0. 55mmol/g〇
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱去Fmoc-保护基团所用的脱帽试剂 为卩1?:01^=24.5:75.5，体积比。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述进行缩合反应所用的接肽试剂为 DIPEA : DMF=1 : 10,体积比。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述切肽所用的切肽试剂为：TFA/ TIS=932ml/68ml〇
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述切肽包括如下步骤： 将所述保护二十一肤树脂：Fmoc_Lys (Boc) -Lue-Lue-Lue-Lue-Lys (Boc) -Leu-Lue-Leu -Lue-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc) -Leu-Leu-Leu-Leu-Lys (Boc)-树脂加入预冷 至-10至-7°C的切肽试剂中，反应，收集切肽后的粗品； 所说的切肽试剂为：TFA/TIS=932ml/68ml ; 所说的切肽反应温度为：13_16°C ; 所说的切肽反应时间为：65分钟。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纯化具体实现为：将所述二十一肽粗 品经C18柱分离纯化、除盐，冻干后，制得西那普肽。
9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纯化具体实现为：将西那普肽粗品 溶于乙酸中，过滤，滤液经C18柱纯化，流速为800-900ml/min ;检测波长为：230nm ;用液相 色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后除盐，除溶剂、冻干，获得成品；所述流动相 为：0· 122Mol/L磷酸三乙胺/乙腈=6. 9/3. 1。
【文档编号】C07K1/06GK104098656SQ201410332391
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月14日 优先权日:2014年7月14日
【发明者】刘湘艳, 王文琪, 崔颀, 周逸明 申请人:上海苏豪逸明制药有限公司, 周逸明, 崔颀