一种固相多肽合成抗炎十肽的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种固相多肽合成抗炎十肽的制备方法，包括如下步骤：以RinkAmideMBHA树脂起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的D-氨基酸，获得保护十肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，TFA切肽后，获得粗品，粗品经C18柱分离纯化，冻干后，制得抗炎十肽精品。本发明的方法，工艺稳定，原辅材料来源方便，生产周期短，收率高，质量稳定，生产成本低，接肽收率高，避免使用氟化氢等剧毒试剂，三废污染少。每步接肽收率均在98.5%以上；切肽后收率为：98.3%，总收率为：47.9%，HPLC测定产品纯度为：99.65%。
【专利说明】一种固相多肽合成抗炎十肽的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗炎十肽的制备方法，尤其涉及固相多肽合成抗炎十肽的制备方法。
【背景技术】
[0002] 抗炎十肽，英文名：Delmitide，分子式：C59H1Q5N 170n ;CAS 登记号：287096-87-1 ;分 子量：1227. 8 ;碳、氢、氮比例：C :57· 68%，Η :8· 61%，N :19· 38%。氨基酸序列：D-Arg-D-Nle-D~N1e-D-Nle-D-Arg-D-Nle-D-Nle-D-Nle~Gly-D~Tyr-NH 2 ； 结构式：
【权利要求】
1. 固相多肽合成抗炎十肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以Rink Amide MBHA树脂为起始原料，按照固相合成的方法依次与具有保护基团的氨基酸 Fmoc-D-Tyr(tBu)-〇H、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-D-Nle-OH、Fmoc-D-Nle-OH、Fmoc-D-Nle-OH Fmoc-D-Arg (Pbf) -〇H、Fmoc-D-Nle-〇H、Fmoc-D-Nle-〇H、Fmoc-D-Nle-〇H、Boc-D-Arg-〇H 进行 缩合反应，获得保护十肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，同步进行脱侧链保护基团； 切肽，获得抗炎十肽粗品；纯化后得抗炎十肽。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述按照固相合成的方法，获得保护十肽 树脂，包括如下步骤： (1) 制备 Fmoc-D-Tyr (tBu)-树脂： 取Rink Amide MBHA树脂用DMF浸泡，使树脂溶胀，抽干，加入脱帽试剂，反应，抽干， 分别用DMF和甲醇洗涤，抽干，然后加入溶解于接肽试剂的Fmoc-D-Tyr (tBu) -OH、HBTU和 HOAt的混合物，反应，抽干，分别用DMF和甲醇洗涤，抽干，再加入醋酐和DMF，反应，获得 Fmoc-D-Tyr (tBu)-树脂； 混合物中： 溶剂DMF对Rink Amide MBHA树脂重量的体积浓度为8?20ml/g ; HBTU的摩尔数为树脂的2?4倍； HOAt的摩尔数为树脂的2~4倍； Fmoc-D-Tyr (tBu)-0H 的摩尔数为 Rink Amide MBHA 树脂的 2?4 倍； 脱帽试剂对Rink Amide MBHA树脂重量的体积浓度为5?20ml/g ; (2) 制备 Fmoc-Gly-D-Tyr (tBu)-树脂： 在步骤（1)的Fmoc-D-Tyr (tBu)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF和甲 醇洗涤，抽干，然后加入溶解于接肽试剂的Fmoc-Gly-OH、HBTU、H0AT的混合物，反应，抽干， 分别用DMF和甲醇洗漆，抽干，获得Fmoc-Gly-D-Tyr (tBu)-树脂； 混合物中： Fmoc-Gly-OH的摩尔数为Rink Amide MBHA树脂的2?4倍； 其余操作以及工艺条件同步骤（1); (3) 制备 Fmoc-D-Nle-Gly-D-Tyr (tBu) -树脂： 在步骤（2)的树脂中，加入脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF和甲醇洗涤，抽干，加入用 接肽试剂溶解的Fmoc-D-Nle-OH、HBTU和H0AT的混合物，反应，抽干，分别用DMF和甲醇洗 漆，抽干，获得 Fmoc-D-Nle-Gly-D-Tyr (tBu)-树脂； 混合物中： Fmoc-D-Nle-OH的摩尔数为Rink Amide MBHA树脂的2?4倍； 其余操作以及工艺条件同步骤（1); (4) 制备 Fmoc-D-Nle-D-Nle-Gly-D-Tyr (tBu) -树脂 在步骤（3)的树脂中，加入脱帽试剂，反应钟，抽干，分别用DMF和甲醇洗涤，抽干，加入 用接肽试剂溶解的Fmoc-D-Nle-OH、HBTU和H0AT的混合物，反应，抽干，分别用DMF和甲醇 洗涤，抽干，获得 Fmoc-D-Nle-D-Nle-Gly-D-Tyr (tBu)-树脂； 混合物中： Fmoc-D-Nle-OH的摩尔数为Rink Amide MBHA树脂的2?4倍。
3.其余操作以及工艺条件同步骤（1); (5) 制备 Fmoc-D-Nle-D-Nle-D-Nle-Gly-D-Tyr (tBu)_ 树脂： 在步骤（4)的树脂中，加入脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF和甲醇洗涤，抽干，加入用 接肽试剂溶解的Fmoc-D-Nle-OH、HBTU和H0AT的混合物，反应，抽干，分别用DMF和甲醇洗 涤，抽干，获得 Fmoc-D-Nle-D-Nle-D-Nle-Gly-D-Tyr (tBu)-树脂； 混合物中： Fmoc-D-Nle-OH的摩尔数为Rink Amide MBHA树脂的2?4倍； 其余操作以及工艺条件同步骤（1); (6) 制备 Fmoc-D-Arg(Pbf)-D-Nle-D-Nle-D-Nle-Gly-D-Tyr(tBu)_ 树脂： 在步骤（5)的树脂中，加入脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF和甲醇洗涤，抽干，加入用 接肽试剂溶解的Fmoc-D-Arg (Pbf) -〇H、HBTU和H0AT的混合物，反应，抽干，分别用DMF和甲 醇洗漆，抽干，获得 Fmoc- D_Arg (Pbf) -D-Nle-D-Nle-D-Nle-Gly-D-Tyr (tBu)-树脂； 混合物中： Fmoc-D-Arg (Pbf)-OH 的摩尔数为 Rink Amide MBHA 树脂的 2?4 倍； 其余操作以及工艺条件同步骤（1); (7) 制备 Fmoc-D-Nle-D-Arg(Pbf)-D-Nle-D-Nle-D-Nle-Gly-D-Tyr (tBu) -树脂： 在步骤（6)的树脂中，加入脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF和甲醇洗涤，抽干，加入用 接肽试剂溶解的Fmoc-D-Nle-OH、HBTU和H0AT的混合物，反应，抽干，分别用DMF和甲醇洗 涤，抽干，获得 Fmoc-D-Nle-D-Arg (Pbf) -D-Nle-D-Nle-D-Nle-Gly -D-Tyr (tBu)-树脂； 混合物中： Fmoc-D-Nle-OH的摩尔数为Rink Amide MBHA树脂的2?4倍； 其余操作以及工艺条件同步骤（1); (8) 制备 Fmoc-D-Nle-D-Nle-D-Arg(Pbf)-D-Nle-D-Nle-D-Nle-Gly-D-Tyr(tBu)_ 树 脂： 在步骤（7)的树脂中，加入脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF和甲醇洗涤，抽干，加入用 接肽试剂溶解的Fmoc-D-Nle-OH、HBTU和H0AT的混合物，反应，抽干，分别用DMF和甲醇洗 涤，抽干，获得 Fmoc-D-Nle-D-Nle-D-Arg (Pbf) -D-Nle-D-Nle- D-Nle-Gly-D-Tyr (tBu)-树 脂； 混合物中： Fmoc-D-Nle-OH的摩尔数为Rink Amide MBHA树脂的2?4倍； 其余操作以及工艺条件同步骤（1); (9 )制备 Fmoc-D-Nle-D-Nle-D-Nle-D-Arg (Pbf) -D-Nle-D-Nle-D-Nle-Gly-D-Tyr (tBu) _树脂： 在步骤（8)的树脂中，加入脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF和甲醇洗涤，抽干，力口 入用接肽试剂溶解的Fmoc-D-Nle-OH、HBTU和H0AT的混合物，反应，抽干，分别用DMF 和甲醇洗涤，抽干，获得 Fmoc-D-Nle-D-Nle-D-Nle-D-Arg (Pbf)-D-Nle-D-Nle- D-Nle -Gly-D-Tyr (tBu)-树脂； 混合物中： Fmoc-D-Nle-OH的摩尔数为Rink Amide MBHA树脂的2?4倍； 其余操作以及工艺条件同步骤（1); (10 )制备 Boc-D-Arg-D-Nle-D-Nle-D-Nle-D-Arg (Pbf) -D-Nle-D-Nle-D-Nle-Gly-D-Ty r (tBu)_ 树脂： 在步骤（9)的树脂中，加入脱帽试剂，反应，抽干，分别用DMF和甲醇洗涤，抽干，加入 用接肽试剂溶解的Boc-D-Arg-OH、HBTU和H0AT的混合物，反应，抽干，分别用DMF和甲醇 洗涤，抽干，获得 Boc-D-Arg-D-Nle-D-Nle-D-Nle- D-Arg(Pbf)-D-Nle-D-Nle- D-Nle-Gly-D-Tyr(tBu)树脂；加入脱帽试剂，反应，抽干；混合物中：Boc-D-Arg-OH的摩尔数为Rink Amide MBHA树脂的2?4倍；余操作以及工艺条件同步骤（1)。
4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述Rink Amide MBHA树脂取代度 为：0· 65-0. 75mmol/g。
5. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述脱去Fmoc-保护基团所用的脱帽 试剂为卩1?:〇1^=26.5:73.5，体积比。
6. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述进行缩合反应所用的接肽试剂为 DIPEA : DMF=1 : 10,体积比。
7. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述切肽所用的切肽试剂为：TFA/ TIS/ 巯基乙醇=900ml/50ml/50ml。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述切肽包括如下步骤：将所述 保护十肽树脂：Boc-D-Arg-D-Nle-D-Nle- D-Nle-D-Arg(Pbf)-D-Nle-D-Nle- D-Nle -Gly-D-Tyr(tBU)树脂加入预冷至(Tl(TC的切肽试剂中，反应，收集切肽后的粗品；所述切 肽试剂为：TFA/TIS/巯基乙醇=900ml/50ml/50ml ;所述切肽反应温度为：17-19°C ;所述切 肽反应时间为：115分钟。
9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纯化具体实现为：将所述抗炎十肽粗 品经C18柱分离纯化、除盐，冻干后，制得抗炎十肽精品。
10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纯化具体实现为：将所述抗炎 十肽粗品溶于乙酸中，过滤，滤液经C18柱纯化，流速为500-1500ml/min ;检测波长为： 250-300nm;用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后除盐，除溶剂、冻干，获 得成品；流动相为：磷酸三乙胺/乙腈=7. 1 / 2.9 ;所述磷酸三乙胺的浓度为0. 116mol/ L〇
【文档编号】C07K1/06GK104086626SQ201410332269
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月14日 优先权日:2014年7月14日
【发明者】王文琪, 刘湘艳, 崔颀, 周逸明 申请人:上海苏豪逸明制药有限公司, 周逸明, 崔颀