一种从血浆中吸附人凝血酶原复合物的方法

一种从血浆中吸附人凝血酶原复合物的方法
【专利摘要】本发明涉及一种采用固定床柱层析技术从血浆中吸附人凝血酶原复合物的生产方法，包括以下步骤：（1）去除冷沉淀血浆，使用预先经EDTA溶液和枸橼酸钠溶液清洗过的纤维素深层滤板过滤；（2）深层过滤后的血浆在固定床上样时经过0.2μm的滤芯膜在线过滤；（3）装填有阴离子交换凝胶CaptoDEAE的固定床层析柱使用缓冲液A平衡2~5个柱体积，血浆上样流速为60~120cm/h，用缓冲液B洗涤层析柱，用缓冲液C洗脱层析柱，得到PCC制品，按照凝血因子IX计算，PCC的收率可以达到75%~90%，比活性可以达到5.5IU/mg以上。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制品和血液制品生产【技术领域】，主要涉及血液制品生产中人凝血 酶原复合物的固定床柱层析分离纯化方法。 一种从血浆中吸附人凝血酶原复合物的方法

【背景技术】
[0002] 人凝血酶原复合物（Prothrombin Complex, PCC)是经由健康人血楽提取的，主要 含有人凝血因子II、VII、IX、X的血浆蛋白制品。中国药典要求该制品中人凝血因子IX效 价不低于10iu/ml，其比活不小于0. 5IU/ml。该产品主要用于治疗和预防由于II、VII、IX、 X因子缺乏引起的出血，如乙型血友病、肝病等。
[0003] PCC -般选用DEAES印hadex A50凝胶生产，由于该凝胶溶胀系数在不同盐浓度下 变化较大，国内外血液制品企业在实际生产中均采用批式吸附生产工艺，即将凝胶直接与 反应罐中的血浆混匀，吸附完成后直接过滤出凝胶再进行洗涤和洗脱。批式吸附方法为开 放式操作，操作繁琐，且有凝胶泄漏和交叉污染的风险。虽然也有相关的文献报道使用扩张 床技术生产PCC，但是真正在生产中应用的案例未见报道，可见扩张床技术的大规模应用还 不成熟。通用电气公司（GE)曾经专门开发了 Streamline系列带有石英核心的凝胶品种专 门用于扩张床技术，但是经过几年的推广发现实用性很差，现已基本被淘汰。
[0004] 使用固定床层析技术直接从血浆中吸附PCC的生产工艺未见相关报道，其主要原 因有以下两点： 第一、过滤澄清技术对血浆分离纯化工艺的限制。由于血浆成分复杂，除了含有血浆蛋 白之外，还含有少量的血细胞或者碎片，脂肪或乳糜颗粒等不溶物，不溶物粒径大小不一， 脂肪或乳糜还导致血浆具有较大的粘度。这些特性使大规模的血浆过滤澄清工艺很难实 现。同时因为血浆中含有大量的凝血因子，带负电荷的过滤介质可能会给凝血因子提供激 活表面，引起凝血反应，造成不可挽回的损失，对血液制品的生产造成巨大的影响。
[0005] 第二、传统工艺中普遍使用的DEAESephadex A50凝胶，由于溶胀系数变化较大而 不适合固定床层析工艺。


【发明内容】

[0006] 本发明的目的在于使用固定床柱层析技术从血浆中吸附PCC，并经过洗涤和洗脱 制备PCC。特别是在保证血浆凝血因子不被激活的前提下，实现了血浆的较大规模深层过 滤和精细过滤，并筛选出适合吸附和分离纯化PCC的凝胶，直接用于固定床层析柱，用层析 技术从血浆中直接吸附并纯化得到PCC，彻底解决传统批式吸附工艺容易引起污染，交叉污 染，凝胶泄漏以及操作繁杂等问题。
[0007] 本发明所采用的技术方案主要包括：（1)去除冷沉淀血浆；（2)血浆过滤，使血浆 达到柱层析所要求的过滤精度和澄清度，并确保在过滤过程和过滤后血浆中的凝血因子不 被激活或灭活；（3)固定床柱层析技术纯化PCC，用阴离子交换凝胶直接从血浆捕获PCC，使 其他血浆蛋白从层析柱直接流穿，对层析柱进行洗涤和洗脱，从而获得纯化的PCC。具体的 技术方案如下： 上述具体步骤为 (1) 去除冷沉淀： 将新鲜冰冻人血浆在融化混匀后，经连续流离心机去除血浆中的冷沉淀，得到离心后 的血浆上清液； (2) 血浆过滤 使用EDTA溶液对过滤材质进行清洗，再用枸橼酸钠溶液对过滤材质进行清洗，并洗去 残留的EDTA，冲洗完成后排干设备内的溶液，用于血浆过滤，所采用的过滤材质为药用级别 纤维素滤板； (3) 固定床柱层析分离纯化PCC 将凝胶装填在固定床层析柱内，柱床体积与上样的血浆量的比例为1: l(Tl: 50,装填好 的层析柱使用缓冲液Α平衡2飞个柱体积，经过深层过滤后的血浆使用0. 2 μ m的滤芯进行 在线的膜过滤后泵入层析柱，上样流速为6(Tl2〇Cm/h，用缓冲液B洗涤层析柱，用缓冲液C 洗脱层析柱，得到PCC制品，按照凝血因子IX的活性计算，PCC的收率可以达到759Γ90%，比 活性可以达到5. 5IU/mg以上。
[0008] 上述EDTA溶液的浓度为0· 1%-10%，用量为10(T300L/m2。
[0009] 上述枸橼酸钠溶液的浓度为0. 29Γ10%，用量为10(T300L/m2。
[0010] 上述步骤（2)血浆过滤中，所述纤维素滤板的层数为单层或双层。
[0011] 上述步骤（3)固定床柱层析分离纯化PCC中，所述缓冲液A由25mmol/L枸橼酸钠 和20mmol/L盐酸精氨酸组成，所述缓冲液的PH为7. 0。
[0012] 上述步骤（3)固定床柱层析分离纯化PCC中，所述缓冲液B由25mmol/L枸橼酸钠 /20mmol/L盐酸精氨酸和0. 1?0. 4mol/L的NaCl组成。
[0013] 上述步骤（3)固定床柱层析分离纯化PCC中，所述缓冲液C由25mmol/L枸橼酸钠 /20mmol/L盐酸精氨酸和0· 5?1. Omol/L的NaCl组成。
[0014] 上述步骤（3)固定床柱层析分离纯化PCC中，所述凝胶为阴离子交换凝胶Capto DEAE〇
[0015] 本发明的有益效果是：血浆经过深层过滤和0. 2μπι的膜过滤，可以达到固定床层 析工艺所需的澄清度，能有效提高上样过程中的线速度；并能保证过滤后血浆中凝血因子 和酶不被激活或灭活，仍保留其活性。过滤后的血浆采用固定床层析技术，使用Capto DEAE 凝胶直接捕获血浆中的PCC，在提高了 PCC的收率和比活性的同时，避免了现有的批式吸附 工艺的缺点，实现了血浆的短时间、高流速、密闭管道式处理；避免了污染、交叉污染、凝胶 泄漏的风险；简化了生产工艺，减轻工作人员劳动强度。
[0016]

【具体实施方式】： 为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明 并不局限于此。
[0017] 实施例1 :血浆深层过滤 选择不同的滤板及相应的夹具进行组装。按照下表中的清洗方式进行清洗，过滤后的 血浆2?8°C放置24h，观察血浆凝固情况。

【权利要求】
1. 一种从血浆中吸附人凝血酶原复合物的方法，包括去除冷沉淀、血浆过滤和固定床 柱层析分离纯化PCC。
2. 根据权利要求1所述的一种从血浆中吸附人凝血酶原复合物的方法，其特征在于： 所述具体步骤为 (1) 去除冷沉淀： 将新鲜冰冻人血浆在融化混匀后，经连续流离心机去除血浆中的冷沉淀，得到离心后 的血浆上清液； (2) 血浆过滤 使用EDTA溶液对过滤材质进行清洗，再用枸橼酸钠溶液对过滤材质进行清洗，并洗去 残留的EDTA，冲洗完成后排干设备内的溶液，用于血浆过滤，所采用的过滤材质为药用级别 纤维素滤板； (3) 固定床柱层析分离纯化PCC 将凝胶装填在固定床层析柱内，柱床体积与上样的血浆量的比例为1: l(Tl: 50,装填好 的层析柱使用缓冲液Α平衡2飞个柱体积，经过深层过滤后的血浆使用0. 2 μ m的滤芯进行 在线的膜过滤后泵入层析柱，上样流速为6(Tl2〇Cm/h，用缓冲液B洗涤层析柱，用缓冲液C 洗脱层析柱，得到PCC制品。
3. 根据权利要求2所述的一种从血浆中吸附人凝血酶原复合物的方法，其特征在于： 所述EDTA溶液的浓度为0. 1%-10%，用量为10(T300L/m2。
4. 根据权利要求2所述的一种从血浆中吸附人凝血酶原复合物的方法，其特征在于： 所述枸橼酸钠溶液的浓度为〇. 29Γ10%，用量为10(T300L/m2。
5. 根据权利要求2所述的一种从血浆中吸附人凝血酶原复合物的方法，其特征在于： 所述步骤（2)血浆过滤中，所述纤维素滤板的层数为单层或双层。
6. 根据权利要求2所述的一种从血浆中吸附人凝血酶原复合物的方法，其特征在于： 所述步骤（3)固定床柱层析分离纯化PCC中，所述缓冲液A由25mmol/L枸橼酸钠和20mmol/ L盐酸精氨酸组成，所述缓冲液的PH为7. 0。
7. 根据权利要求2所述的一种从血浆中吸附人凝血酶原复合物的方法，其特征在于： 所述步骤（3)固定床柱层析分离纯化PCC中，所述缓冲液B由25mmol/L枸橼酸钠/20mmol/ L盐酸精氨酸和0. 1~0. 4mol/L的NaCl组成。
8. 根据权利要求2所述的一种从血浆中吸附人凝血酶原复合物的方法，其特征在于： 所述步骤（3)固定床柱层析分离纯化PCC中，所述缓冲液C由25mmol/L枸橼酸钠/20mmol/ L盐酸精氨酸和0· 5?L Omol/L的NaCl组成。
9. 根据权利要求2所述的一种从血浆中吸附人凝血酶原复合物的方法，其特征在于： 所述步骤（3)固定床柱层析分离纯化PCC中，所述凝胶为阴离子交换凝胶Capto DEAE。
【文档编号】C07K1/34GK104109202SQ201410340403
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年7月17日 优先权日:2014年7月17日
【发明者】马山, 张翠萍, 朱孟沼, 周安, 马杰, 董雪, 吴菲菲, 陈振, 陈晨, 席智赢, 菅长永 申请人:山东泰邦生物制品有限公司