人视黄醇结合蛋白的纯化工艺及其多克隆抗体的制备工艺的制作方法

人视黄醇结合蛋白的纯化工艺及其多克隆抗体的制备工艺的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种人视黄醇结合蛋白的纯化工艺及其多克隆抗体的制备工艺。本发明运用DEAE-Sepharose?Fast?Flow(DEAE-S)离子交换柱、分子筛(Superdex?75、Sephacryls-200)及疏水柱Phenyl?SepharoseTM?High?Performance(PHSP)等多种色谱柱分离技术，成功地从肾脏损伤患者的尿液中进行人源视黄醇结合蛋白的纯化，最大程度地保留了RBP蛋白的免疫原性。将获得的人源RBP抗原用于免疫动物，从而获得抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体。所得抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体可应用于免疫比浊试剂盒。
【专利说明】人视黄醇结合蛋白的纯化工艺及其多克隆抗体的制备工艺

【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学免疫【技术领域】，具体涉及人视黄醇结合蛋白的纯化工艺及其多克 隆抗体的制备工艺。

【背景技术】
[0002] 视黄醇结合蛋白（Retinol Binding Protein, RBP)为血液中视黄醇（维生素 A) 的转运蛋白。1961年Berggard在免疫电泳中发现在α 2-球蛋白区域能形成一条长沉淀线 的蛋白质，曾称为长α 2-球蛋白。在以后几十年中，人们对这种蛋白质的分子结构、生物学 特性等进行了全面研究，发现这种蛋白质广泛地分布于正常人体液中，属α 1-球蛋白，具 有从肝细胞中转运视黄醇至周围组织的功能。目前，认为血液中RBP主要以视黄醇、前白蛋 白结合的复合物形式存在，当复合物中视黄醇与靶细胞结合后，RBP便与前白蛋白分离，自 肾小球滤出，由近端肾小管上皮细胞吸收、降解。因此正常人尿液中几乎不含有RBP (含量 低于300ng/ml)，若肾小管病变，则重吸收功能下降，会导致尿液中的RBP大量上升。因此， 在肾小管操作病人尿液中RBP含量大于300ng/ml，一般可达到正常人的5倍以上，严重者其 尿液中的RBP含量甚至可以达到100000ng/ml以上。近年来的研究表明，RBP含量改变能 够敏感地反映近端肾小管功能、肝功能损害程度，是反映肾脏、肝脏及营养性疾病发展、转 归的敏感指标。
[0003] 现有的对人源RBP纯化技术，主要有：运用硫酸铵盐析后，再通过DEAE-S印hadex A25 柱、SephadexG200、Ultrogel ACA44 柱和 Sephadex G100 柱层析分离纯化人血楽 RBP， 或者是将血浆中RBP和前白蛋白的复合物通过含有前白蛋白抗体的S印harose 4B凝胶柱 进行纯化获得，此类方法得到的抗原产率较高，但是前白蛋白抗体的处理较为复杂，并且需 要大量实验来寻找最佳洗脱液的成分，不易于产业化。另一种是将来源于尿液的RBP蛋白 液经过乙酰基-葡聚糖凝胶柱层析和DEAE-葡聚糖凝胶柱层析，获得人源RBP抗原，而此提 取效果不够理想。再有就是在变性条件下，应用Sephacryl-100凝胶过滤和Source_30Q阴 离子交换两步分离获得RBP,但该方法主要应用于重组RBP的纯化。


【发明内容】

[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种人视黄醇结合蛋白的纯化工艺及其多克隆 抗体的制备工艺。
[0005] 本发明的第一方面，提供一种从尿液中提取纯化人视黄醇结合蛋白的工艺，包括 以下步骤：
[0006] 1)从肾脏损伤患者的尿液中获取尿蛋白液；
[0007] 2)所得的尿蛋白液过DEAE-Sepharose Fast Flow凝胶柱层析，用缓冲液B1平衡 后再用缓冲液B2洗脱，收集洗脱峰，对洗脱峰进行检测，合并含RBP的部分，得到RBP组分 1 ;其中：
[0008] 缓冲液 B1 :15 ?25mM Tris-HCl ρΗ7· 5 ?8. 0+40 ?50mM NaCl+0. 01 ?0· 03% NaN3+l ?2mM EDTA ;
[0009] 缓冲液 B2 :15 ?25mM Tris-HCl ρΗ7· 5 ?8. 0+250 ?350mM NaCl+0. 01 ?0· 03% NaN3+l ?2mM EDTA ;
[0010] 3)将RBP组分1用硫酸铵盐析，使其中硫酸铵的饱和度为55?65%，离心，收集 蛋白沉淀，所得蛋白沉淀用缓冲液C复溶，离心，取上清液经Sephacryls-200分子筛凝胶层 析，用缓冲液C洗脱，收集洗脱峰，对洗脱峰进行检测，合并纯度大于等于80 %的部分，得到 RBP组分2 ;其中：
[0011] 缓冲液 C :15 ?25mM Tris-HCl ρΗ7· 5 ?8. 0+100 ?150mM NaCl+0. 01 ?0· 03% NaN3+l ?2mM EDTA ;
[0012] 4)向RBP组分2中添加饱和硫酸铵溶液直至其中硫酸铵的饱和度为25?30%， 然后过Phenyl Sepharose? High Performance疏水柱，用流动相梯度洗脱，收集洗脱峰，对 洗脱峰进行检测，合并纯度大于等于90%的部分，得到RBP组分3 ;其中：所述的流动相由 缓冲液A和缓冲液D组成，
[0013] 缓冲液 A :15 ?25mM Tris-HCl ρΗ7· 5 ?8. 0+0· 01 ?0· 03% NaN3+l ?2mM EDTA ;
[0014] 缓冲液 D :15 ?25mM Tris-HCl ρΗ7· 5 ?8· 0+25 ?30 % SAS+0. 01 ?0· 03 % NaN3+l ?3mM EDTA ;
[0015] 5)将RBP组分3用硫酸铵盐析，使其中硫酸铵的饱和度为55?65%，离心，收集 蛋白沉淀，所得蛋白沉淀用缓冲液C复溶，离心，取上清液经Sup erdeX75分子筛凝胶层析， 用缓冲液C洗脱，收集洗脱峰，对洗脱峰进行检测，合并纯度大于等于97 %的部分，得到RBP 组分4 ;
[0016] 6)取RBP组分4上偶联α丨-MG多抗的CNBr-activated Sepharose 4B柱层析，收 集流出液，WB检测，得到RBP抗原。
[0017] 上述技术方案的步骤1)中，用现有常规方法从尿液中获取尿蛋白液，具体可以 按以下方法获取：取尿液离心，上清液加入硫酸铵使其中硫酸铵的饱和度为55?65%， 静置过夜，离心，收集沉淀，沉淀用缓冲液复溶后再用缓冲液A透析，透析完成后再离心， 收集上清液即为尿蛋白液。其中，所述缓冲液的组成为：15?25mM Tris-HCl pH7. 5? 8. 0+120mM-250mM NaCl+0. 01 ?0· 03% NaN3+l ?2mM EDTA(请提供），缓冲液 A 的组成为： 15 ?25mM Tris-HCl ρΗ7· 5 ?8· 0+0· 01 ?0· 03% NaN3+l ?2mM EDTA。优选是从肾脏损 伤患者24h的尿液中获取尿蛋白液。
[0018] 上述技术方案的步骤2)中，所述缓冲液B1和缓冲液B2的组成优选为：
[0019] 缓冲液 B1 :20mM Tris-HCl pH 8. 0+40 ?50mM NaCl+0. 02% NaN3+lmM EDTA ;
[0020] 缓冲液 B2 :2〇mM Tris-HCl pH8· 0+3〇OmM NaCl+0. 〇2% NaN3+lmM EDTA。
[0021] 上述技术方案的步骤4)中，所述缓冲液A和缓冲液D的组成优选为：
[0022] 缓冲液 A :20mM Tris-HCl ρΗ8· 0+0· 02% NaN3+lmM EDTA ;
[0023] 缓冲液 D :20mM Tris-HCl ρΗ8· 0+25 ?30% SAS+0. 02% NaN3+lmM EDTA。
[0024] 上述技术方案的步骤4)中，过Phenyl Sepharose? High Performance疏水柱层 析时，流动相的洗脱条件优选为：
[0025] 在收集10倍柱体积洗脱液的时间内：缓冲液D : 100 - 0%，缓冲液A :0 - 100%。
[0026] 上述技术方案中，所述缓冲液C的组成优选为：
[0027] 缓冲液 C :20mM Tris-HCl pH 8. 0+120mM NaCl+0. 02% NaN3+lmM EDTA。
[0028] 本发明的第二方面，提供一种抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体的制备工艺，包括 以下步骤：
[0029] I )选取合适的动物，以权利要求1制得的RBP抗原为免疫原对其进行皮下免疫 注射，直至动物的特异性抗血清滴度达标；
[0030] II )采集动物的抗血清，所得抗血清进行免疫电泳，如存在免疫球蛋白类及白蛋 白杂带，将抗血清过偶联正常人血清的CNBr-activated Sepharose4B柱去除免疫球蛋白类 及白蛋白杂带，收集流出液，得到除杂后的抗血清；
[0031] III)用饱和度为40?60%的硫酸铵溶液沉淀除杂后的抗血清中的动物抗人腹水 球蛋白，离心，收集沉淀，沉淀透析脱盐后过DEAE-Sepharose Fast Flow凝胶柱层析，用缓 冲液E洗脱，收集洗脱峰，对洗脱峰进行检测，得到抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体；所述 缓冲液E的组成为：
[0032] 缓冲液 E :15 ?25mM Tris-HCl ρΗ7· 5 ?8. 5+90 ?110mM NaCl。
[0033] 上述抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体的制备工艺的步骤I )中，在注射免疫原的 同时还需要注射一些必不可少的现有常规的佐剂，如弗氏佐剂等。
[0034] 上述抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体的制备工艺的步骤III)中，缓冲液E的组成 优选为：20mM Tris-HCl pH8.0+100mM NaCl。
[0035] 与现有技术相比，本发明运用DEAE-Sepharose Fast Flow (DEAE-S)离子交 换柱、分子筛（Superdex 75、Sephacryls-200)及疏水柱 Phenyl Sepharose? High Performance (PHSP)等多种色谱柱分离技术，成功地从肾脏损伤患者的尿液中进行人源视 黄醇结合蛋白的纯化，最大程度地保留了 RBP蛋白的免疫原性。将获得的人源RBP抗原用 于免疫动物，从而获得抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体。所得抗人视黄醇结合蛋白多克隆 抗体可应用于免疫比浊试剂盒。

【专利附图】

【附图说明】
[0036] 图1为实施例一所得的RBP抗原、实施例二所得的RBP抗原与leebio的RBP的 SDS-PAGE对比检测结果；
[0037] 图2为RBP对照品的高效液相色谱图（对照品购自Leebio公司）；
[0038] 图3为实施例一所得的RBP抗原的高效液相色谱图；
[0039] 图4为实施例一所得的RBP抗原的质谱图；
[0040] 图5为实施例二所得的RBP抗原的高效液相色谱图；
[0041] 图6为以实施例三获得的抗体为一抗，实施例一获得的RBP及实施例二获得的RBP 与Leebio的RBP的WB检测谱图；
[0042] 图7为以实施例四获得的抗体为一抗，实施例一获得的RBP及实施例二获得的RBP 与Leebio的RBP的WB检测谱图。

【具体实施方式】
[0043] 下面以具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。
[0044] 实施例一免疫原（RBP抗原）的纯化
[0045] 1、使用的仪器及柱子：
[0046] 1. 1仪器：简易蛋白纯化系统（包含恒流泵、紫外检测器、记录仪）（Amersham Pharmacia Biotech Inc)、GradiFrac TM Programming(Amersham Pharmacia Biotech Inc)，Waters600高相液相色谱仪（美国Waters公司）等。
[0047] 1. 2 柱子：离子交换柱 DEAE-Sepharose Fast Flow(DEAE-S)、分子筛（Superdex 75、 Sephacryls-200)、疏水柱 Phenyl Sepharose? High Performance(PSHP)、 CNBr-activated Sepharose 4B 均为 GE Healthcare 公司产；Protein Pak Glass 300SW 为 waters 产。
[0048] 2、肾损伤患者尿液的预处理
[0049] 2. 1取患者的尿液离心30min(4000r/min)，取上清液；
[0050] 2. 2上清液中加入固体SAS(硫酸铵）使饱和度达60%，静置过夜；
[0051] 2. 3将上述静置过夜的蛋白液离心30min(8000r/min)，取沉淀用缓冲液（组成为： 20mM Tris-HCl pH8. 0+200mM NaCl+0. 02%NaN3+lmM EDTA)复溶，并将复溶后的蛋白液用 缓冲液A(缓冲液A组成为：20mM Tris-HCl pH8. 0+0. 02%NaN3+lmM EDTA)充分透析，透析 完成后8000r/min离心30min，收集上清液，即为尿蛋白液，以其作为上样品。
[0052] 3、分离纯化：
[0053] 3.1流动相的准备：
[0054] 先配制 200mmol/L Tris (pH = 8. 0)、20 % (质量）NaN3、4mol/L NaCl、饱和硫酸 铵作为储备母液。其中：200mmol/L Tris(pH = 8. 0)的具体配制方法为：称121. 14g Tris Base(国药集团化学试剂有限公司），溶于超纯水中，用浓盐酸（西陇化工股份有限公司） 调pH，加超纯水定容至5L，并且使溶液最终pH为8.0,0. 22um滤膜过滤，即得。20% (质 量）NaN3的具体配制方法为：称100g叠氮钠（国药集团化学试剂有限公司），加超纯水溶 解，定容至500mL，混合均勻，用0. 22um滤膜过滤，即得。4mol/L NaCl的具体配制方法为： 称1168. 8g固体NaCl (国药集团化学试剂有限公司/西陇化工股份有限公司），加超纯水 溶解，定容至5L，混合均匀，0. 22um滤膜过滤，即得。
[0055] 饱和硫酸铵的配制：往热水中加入过量的固体硫酸铵，并用磁力搅拌器不断搅拌， 温度降下后即有大量的固体硫酸铵析出，说明已饱和。
[0056] 缓冲液 A :20mmol/L Tris pH = 8. 0+0· 02% NaN3+lmM EDTA ;
[0057] 量取 250mL 200mmol/L Tris pH = 8· 0、2· 5mL 20% NaN3、5mL 500mMEDTA 混合，力口 超纯水定容至2. 5L，混匀，即得。
[0058] 缓冲液 B1 :20mmol/L Tris pH = 8. 0+40mmol/L NaCl+0. 03% NaN3+lmM EDTA ;
[0059] 量取250mL 200mmol/L Tris pH = 8. 0,25mL 4mol/L NaCl，3. 75mL 20%NaN3,5mL 500mMEDTA混合，加超纯水定容至2. 5L，混匀，即得。
[0060] 缓冲液 B2:20mmol/L Tris pH = 8. 0+300mmol/L NaCl+0. 03% NaN3+lmM EDTA ;
[0061] 量取 250mL 200mmol/L Tris pH = 8. 0,187. 5mL 4mol/L NaCl，3. 75mL20% NaN3， 5mL 500mMEDTA混合，加超纯水定容至2. 5L，混匀，即得。
[0062] 缓冲液 C:20mmol/L Tris pH = 8. 0+120mmol/L NaCl+0. 03% NaN3+lmM EDTA ;
[0063] 量取250mL 200mmol/L Tris pH = 8. 0,75mL 4mol/L NaCl，3. 75mL 20%NaN3,5mL 500mMEDTA混合，加超纯水定容至2. 5L，混匀，即得。
[0064] 缓冲液 D :20mM Tris-HCl pH 8· 0+25% SAS+0. 02% NaN3+lmM EDTA
[0065] 量取 200mL 200mmol/L Tris pH = 8. 0,500mL 饱和硫酸铵，2mL 20% NaN3,4mL 500mMEDTA混合，加超纯水定容至2. 0L，混匀，即得。
[0066] 3. 2 尿蛋白液（即尿液蛋白）过 DEAE-Sepharose Fast Flow(DEAE-S)层析柱
[0067] 3· 2. IDEAE-Sepharose Fast Flow(DEAE-S)层析柱的准备：选取合适色谱柱，装入 DEAE-Sepharose Fast Flow(DEAE-S)填料，用缓冲液 B1 充分平衡。
[0068] 3. 2. 2上样：将尿液蛋白上DEAE-S柱，上样时，样品液层高度应不大于柱床高度的 2/3。上样前，接通紫外检测器（405nm)、记录仪，样品全部入柱后：
[0069] a)上样品过 DEAE-Sepharose Fast Flow (DEAE-S)层析柱；
[0070] b)用1倍柱体积缓冲液B1平衡；
[0071] C)用1.5倍柱体积缓冲液B2洗脱，收集洗脱峰，将收集到的样进行SDS-PAGE检 测，合并含RBP的部分，得到RBP组分1。
[0072] 3. 3RBP组分1过S印hacryls-200分子筛凝胶层析（分子筛S-200)
[0073] RBP组分1用SAS盐析，在RBP组分1中添加固体SAS使溶液中硫酸铵的饱和度 达60%，之后8000r/min离心30min，获得蛋白沉淀，用缓冲液C复溶。复溶后的蛋白液用 8000r/min，离心30min,去除难溶杂质，取上清过分子筛S-200。上样液体积应少于填料体 积的4%。收集洗脱液，每管收集的蛋白体积为约两个柱横截体积。将收集到的蛋白液进行 SDS-PAGE检测，合并纯度大于等于80 %的部分，得到RBP组分2。
[0074] 3. 4RBP 组分 2 过 Phenyl Sepharose? High Performance (PSHP)柱
[0075] 往RBP组分2中加饱和硫酸铵溶液使溶液中硫酸铵饱和度达25 %，然后过Phenyl Sepharose? High Performance(PSHP)疏水柱（事先用缓冲液D平衡柱子）。用由缓冲液 A和缓冲液D组成的流动相进行梯度洗脱，洗脱条件为：
[0076] 在10倍柱体积的时间里：缓冲液D由100%-0%，缓冲液A由0% - 100%，收集 洗脱峰，每管收集体积为一个柱横截体积。将收集到的样进行SDS-PAGE检测，合并纯度大 于等于90%的部分，得到RBP组分3。
[0077] 3. 5RBP组分3过Superdex 75分子筛胶（分子筛S-75)进一步精细纯化
[0078] RBP组分3用SAS盐析，在RBP组分3中添加 SAS使溶液中硫酸铵的饱和度达60%， 用8000r/min，离心30min，获得蛋白沉淀，用缓冲液C复溶。复溶后的蛋白液用8000r/min, 离心30min,去除难溶杂质，取上清过分子筛S-75。上样液体积应少于填料体积的2%。收 集洗脱液，每管收集的蛋白体积为约两个柱横截体积。将收集到的蛋白液进行SDS-PAGE检 测，合并纯度大于等于97%的部分，得到RBP组分4。
[0079] 3. 6RBP组分4过a 1MG亲和柱
[0080] 将 RBP 组分 4 过偶联 a fMG 多抗的 CNBr-activated Sepharose 4Β 柱去除 a fMG 杂质，收集流出液，即得到RBP抗原。
[0081] 3. 7人视黄醇结合蛋白的验证
[0082] 对所得的RBP抗原进行SDS-PAGE检测并进行蛋白杂交印记，验证结果显示获得的 抗原与抗RBP多克隆抗体有反应，并且与afMG多抗无反应。用Protein Pak Glass 300SW 柱HPLC进行检测，以leebio的RBP为标品。获得纯度大于98%的RBP免疫原，其中，本实 施例所得RBP抗原与leebio的RBP的SDS-PAGE对比检测结果如图1所示，leebio的RBP 的高效液相色谱图如图2所示，本实施例所得RBP的高效液相色谱图如图3所示。用AXIMA Performance质谱仪检测分析获得的RBP :质谱扫描范围：500?4000Da，将样品按标准全 蛋白液态酶解流程酶解，检测模式为反射正离子模式，视黄醇蛋白酶解片断的一级质谱图 如图4所示，由图可知，样品出峰良好，肽段数目较多。Mascot检索结果显示样品为人源的 分子量为23337Da的蛋白。
[0083] 实施例二免疫原（RBP抗原）的纯化
[0084] 1、肾损伤病人尿液的预处理与实例一相同
[0085] 2、分离纯化：
[0086] 2.1流动相的准备：
[0087] 缓冲液 A :25mmol/L Tris pH = 7. 5+0. 01% NaN3+lmM EDTA ;
[0088] 量取 312. 5mL 200mmol/L Tris pH = 7. 5、L 25mL 20% aN3, 5mL 500mMEDTA 混合， 加超纯水定容至2. 5L，混匀，即得。
[0089] 缓冲液 B1 :20mmol/L Tris pH = 8. 0+50mmol/L NaCl+0. 03% NaN3+lmM EDTA ;
[0090] 量取 250mL 200mmol/L Tris pH = 8. 0,31. 25mL 4mol/L NaCl，3. 75mL20% NaN3， 5mL 500mMEDTA混合，加超纯水定容至2. 5L，混匀，即得。
[0091] 缓冲液 B2:15mmol/L Tris pH = 8. 0+250mmol/L NaCl+0. 01% NaN3+lmM EDTA ;
[0092] 量取 250mL 187. 5mmol/L Tris pH = 8. 0,156. 25mL 4mol/L NaCl，1. 25mL 20% NaN3, 5mL 500mMEDTA混合，加超纯水定容至2. 5L，混匀，即得。
[0093] 缓冲液 C:20mmol/L Tris pH = 8. 0+120mmol/L NaCl+0. 03% NaN3+lmM EDTA ;
[0094] 量取250mL 200mmol/L Tris pH = 8. 0,75mL 4mol/L NaCl，3. 75mL 20%NaN3,5mL 500mMEDTA混合，加超纯水定容至2. 5L，混匀，即得。
[0095] 缓冲液 D :25mM Tris-HCl pH 8. 5+30% SAS+0. 02% NaN3+lmM EDTA
[0096] 量取 200mL 312. 5mmol/L Tris pH = 8. 5,600mL 饱和硫酸铵，2. 0mL20% NaN3,4mL 500mMEDTA混合，加超纯水定容至2. 0L，混匀，即得。
[0097] 3. 2 尿蛋白液（即尿液蛋白）过 DEAE-Sepharose Fast Flow(DEAE-S)层析柱
[0098] 3· 2. IDEAE-Sepharose Fast Flow(DEAE-S)层析柱的准备：选取合适色谱柱，装入 DEAE-Sepharose Fast Flow(DEAE-S)填料，用缓冲液 B1 充分平衡。
[0099] 3. 2. 2上样：将尿液蛋白上DEAE-S柱，上样时，样品液层高度应不大于柱床高度的 2/3。上样前，接通紫外检测器（405nm)、记录仪，样品全部入柱后：
[0100] a)上样品过 DEAE-Sepharose Fast Flow (DEAE-S)层析柱；
[0101] b)用1倍柱体积缓冲液B1平衡；
[0102] c)用1. 5倍柱体积缓冲液B2洗脱，收集洗脱峰，将收集到的样进行SDS-PAGE检 测，合并含RBP的部分，得到RBP组分1。
[0103] 3. 3RBP组分1过S印hacryls-200分子筛凝胶层析（分子筛S-200)
[0104] RBP组分1用SAS盐析，在RBP组分1中添加固体SAS使溶液中硫酸铵的饱和度 达65%，之后8000r/min离心30min，获得蛋白沉淀，用缓冲液C复溶。复溶后的蛋白液用 8000r/min，离心30min,去除难溶杂质，取上清过分子筛S-200。上样液体积应少于填料体 积的4%。收集洗脱液，每管收集的蛋白体积为约两个柱横截体积。将收集到的蛋白液进行 SDS-PAGE检测，合并纯度大于等于80 %的部分，得到RBP组分2。
[0105] 3. 4RBP 组分 2 过 Phenyl Sepharose? High Performance (PSHP)柱
[0106] 往RBP组分2中加饱和硫酸铵溶液使溶液中硫酸铵饱和度达30%，然后过Phenyl Sepharose? High Performance(PSHP)疏水柱（事先用缓冲液D平衡柱子）。用由缓冲液 A和缓冲液D组成的流动相进行梯度洗脱，洗脱条件为：
[0107] 在10倍柱体积的时间里：缓冲液D由100%-0%，缓冲液A由0%- 100%，收集 洗脱峰，每管收集体积为一个柱横截体积。将收集到的样进行SDS-PAGE检测，合并纯度大 于等于90%的部分，得到RBP组分3。
[0108] 3. 5RBP组分3过Superdex 75分子筛胶（分子筛S-75)进一步精细纯化
[0109] RBP组分3用SAS盐析，在RBP组分3中添加 SAS使溶液中硫酸铵的饱和度达60 %， 用8000r/min，离心30min，获得蛋白沉淀，用缓冲液C复溶。复溶后的蛋白液用8000r/min, 离心30min,去除难溶杂质，取上清过分子筛S-75。上样液体积应少于填料体积的2%。收 集洗脱液，每管收集的蛋白体积为约两个柱横截体积。将收集到的蛋白液进行SDS-PAGE检 测，合并纯度大于等于97%的部分，得到RBP组分4。
[0110] 3. 6RBP组分4过a 1MG亲和柱
[0111] 将 RBP 组分 4 过偶联 a fMG 多抗的 CNBr-activated Sepharose 4Β 柱去除 a fMG 杂质，收集流出液，即得到RBP抗原。
[0112] 3. 7人视黄醇结合蛋白的验证
[0113] 进行SDS-PAGE检测并进行蛋白杂交印记，验证结果显示获得的抗原分子量在 23KD左右，与抗RBP多克隆抗体有反应，并且与h-MG多抗无反应。用Protein Pak Glass 300SW柱HPLC进行检测，以leebio的RBP为标品。获得纯度大于98 %的RBP免疫原，其中， 本实施例所得RBP抗原与leebio的RBP的SDS-PAGE对比检测结果如图1所示，本实施例 所得RBP的高效液相色谱图如图5所示。
[0114] 实施例三羊抗人RBP多克隆抗体的制备
[0115] 1、山羊的免疫：选取波尔山羊进行皮下免疫（实施一制得的RBP抗原+弗氏佐剂） 注射。
[0116] 2、采集羊抗血清：采集羊抗血清，将抗血清进行免疫电泳，存在免疫球蛋白类及白 蛋白的杂带，将采集的抗血清过偶联正常人血清的CNBr-activated Sepharose 4B柱去除 免疫球蛋白类及白蛋白的杂带，得到除杂后的羊抗血清。
[0117] 3、羊抗人RBP多克隆抗体的纯化：用饱和度为50%硫酸铵溶液沉淀除杂后的羊抗 血清中的羊抗人腹水球蛋白，8000r/min，离心30min，取沉淀透析脱盐，过DEAE-Sepharose Fast Flow(DEAE-S)离子交换柱（事先用缓冲液A平衡）纯化，收集流出液，用20mM Tris-HCl pH8. O+lOOmM NaCl缓冲液洗脱。洗脱过程当出现洗脱峰开始收集，按照约柱长体 积的1/4进行分管收集，洗脱峰到达峰底时停止收集。收集液进行SDS-PAGE，根据SDS-PAGE 结果及抗体目的蛋白分子量，对含目的蛋白条带且纯度较高的管号进行合管。得到羊抗人 RBP多克隆抗体。
[0118] 实例四兔抗人RBP多克隆抗体的制备
[0119] 1、兔的免疫：选取波尔山羊进行皮下免疫（实施二制得的RBP抗原+弗氏佐剂） 注射。
[0120] 2、采集兔抗血清：采集兔抗血清，将抗血清进行免疫电泳，存在免疫球蛋白类及白 蛋白的杂带，将采集的抗血清过偶联正常人血清的CNBr-activated Sepharose 4B柱去除 免疫球蛋白类及白蛋白的杂带，得到除杂后的兔抗血清。
[0121] 3、兔抗人RBP多克隆抗体的纯化：用饱和度为50%硫酸铵溶液沉淀除杂后的兔抗 血清中的羊抗人腹水球蛋白，8000r/min，离心30min取沉淀透析脱盐，过DEAE-Sepharose Fast Flow(DEAE-S)离子交换柱（事先用缓冲液A平衡）纯化，收集流出液，用20mM Tris-HCl pH8. O+lOOmM NaCl缓冲液洗脱。洗脱过程当出现洗脱峰开始收集，按照约柱长体 积的1/4进行分管收集，洗脱峰到达峰底时停止收集。收集液进行SDS-PAGE，根据SDS-PAGE 结果及抗体目的蛋白分子量，对含目的蛋白条带且纯度较高的管号进行合管。得到兔抗人 RBP多克隆抗体。
[0122] 实例五抗血清（多克隆抗体）的免疫电泳、除杂
[0123] 一、免疫电泳
[0124] 1、制胶/打孔
[0125] 1. 1用微波炉或电炉加热溶解配制好的琼脂糖凝胶（1 %电泳级琼脂糖（质量体积 比），溶解液为0. 05M硼酸缓冲液（pH8. 6))。
[0126] 1. 2取玻璃板（或载玻片）平放在清洁的操作台上，用移液管取琼脂糖溶胶铺满整 个玻璃板，厚度约3mm，约15-18mL可铺满，待其凝固。
[0127] 1. 3凝固的琼脂糖凝胶使用打孔开槽工具按照模板打孔和开槽
[0128] 2、加抗原样品
[0129] 在孔内加入已知抗原15uL(注：抗原浓度需根据抗体含量作相应的稀释），再用小 吸头吸取1?2μ 1溴酚蓝指示剂至凝胶边上的抗原孔旁边。
[0130] 3、电泳
[0131] 3. 1加上电泳缓冲液（电泳的两个槽勿加满）
[0132] 3. 2把加好抗原的玻璃板移至电泳槽内，用电动加样把缓冲液加至玻璃面，液面勿 与胶面接触。
[0133] 3. 3用薄滤纸盖在凝胶上与缓冲液液面下，薄滤纸的长与玻璃板同等，宽约1. 5? 2cm。盖上盖子。
[0134] 3.4插上电源、电极，设定电压约60V/板，注意电极的方向（电流"一"一" + "）。 电泳时间约1. 5?2. 0h，由于电泳时间长，电流大，凝胶会产生热量，对于一些热较敏感的 抗体，需在盖上或是电泳槽边加上冰。
[0135] 3. 5待溴酚蓝提示剂跑至加样槽底端时，即可断电取出凝胶板，置37°C湿盒内。
[0136] 4加待测抗体
[0137] 将待测样品加至对应的槽内，150 μ 1/槽。过夜或24小时后读取结果。
[0138] 4. 3观看结果
[0139] 在光线充足且黑色背景下观看沉淀线，如有沉淀线说明有杂带；无沉淀线则代表 无大分子量杂带。
[0140] 二、亲和柱除杂
[0141] 将正常人血清中主要含免疫球蛋白的组分、主要含白蛋白的组分、主要含除白蛋 白和免疫球蛋白外的其他组分，这三个组分分别偶联至CNBr-activated Sepharose 4B(GE 产品），将包被以上所述的三个组分的CNBr-activated Sepharose 4B用缓冲液20mmol/L Tris pH = 8. 0+500mmol/LNaCl+0. 03% NaN3充分平衡后，抗血清或纯化得到的多克隆抗体 过CNBr-activated Sepharose 4B柱进行除杂，收集流出液，即得目的蛋白液。将收集的目 的蛋白液进行免疫电泳验证是否有杂带。看到沉淀线则说明有杂带，无沉淀线无大分子量 杂带。如果看到沉淀线需继续过CNBr-activatedSepharose 4B柱纯化，直至无沉淀线。
[0142] 实施例六多克隆抗体的验证
[0143] 一、检测其蛋白浓度及Elisa检测
[0144] 1、用UV (P360德国頂PLEN)检测蛋白浓度；
[0145] 2、Elisa 检测：
[0146] 2. 1、用进口 RBP抗原按50ng/孔置Costa板过夜包被；加入2 %脱脂奶粉置于微 量振荡器上振动封闭一个小时后，1*PBS洗涤三次，每次间隔lmin。
[0147] 2. 2、将样品（实施例三所得的羊抗人RBP多克隆抗体或者实施例四所得的兔抗人 RBP多克隆抗体）按1:10, 1:100稀释后，取90ull*PBS至Costa板第一个孔，其余的孔分别 加入50ull扑BS，在第一个孔中加10ul已稀释100倍的样品液，混匀，接着从1:1000的稀释 倍数开始稀释样品，即从第一个孔中取出50样品液加至第二个孔，混匀，再从第二个孔中 取出取出50样品液加至第三个孔，混匀，以此类推，直至按梯度对倍稀释样品至1:64000 ;
[0148] 2. 3、在室温条件下放置于微量振荡器上振动反应2h后，1*PBST洗涤三次，每次间 隔lmin ;然后再用1*PBST洗涤两次，将板拍干；
[0149] 2. 4、加二抗（兔抗羊 IgG/HRP A89191:30000 或者羊抗兔 IgG/HRPl :30000)在室 温条件下放置于微量振荡器上振动反应lh后，1*PBST洗涤三次，每次间隔lmin ;然后再用 1*PBST洗涤两次，将板拍干；
[0150] 2. 5、每孔加入A+B混合液100ul，置微量振荡器上振动10s后，放入37°C恒温箱 内，20min后置于酶标仪（BioTek)上读取0D值。并进行数值换算，结果如下述表1所示。
[0151] 表1:
[0152]
[0153]

【权利要求】
1. 从尿液中提取纯化人视黄醇结合蛋白的工艺，包括以下步骤： 1) 从肾脏损伤患者的尿液中获取尿蛋白液； 2) 所得的尿蛋白液过DEAE-Sepharose Fast Flow凝胶柱层析，用缓冲液B1平衡后再 用缓冲液B2洗脱，收集洗脱峰，对洗脱峰进行检测，合并含RBP的部分，得到RBP组分1 ;其 中： 缓冲液 B1 :15 ?25mM Tris-HCl ρΗ7· 5 ?8. 0+40 ?50mM NaCl+0. 01 ?0· 03 % NaN3+l ?2mM EDTA ; 缓冲液 B2 :15 ?25mM Tris-HCl ρΗ7· 5 ?8· 0+250 ?350mM NaCl+0. 01 ?0· 03 % NaN3+l ?2mM EDTA ; 3) 将RBP组分1用硫酸铵盐析，使其中硫酸铵的饱和度为55?65%，离心，收集蛋白 沉淀，所得蛋白沉淀用缓冲液C复溶，离心，取上清液经Sephacryls-200分子筛凝胶层析， 用缓冲液C洗脱，收集洗脱峰，对洗脱峰进行检测，合并纯度大于等于80 %的部分，得到RBP 组分2 ;其中： 缓冲液 C :15 ?25mM Tris-HCl ρΗ7· 5 ?8. 0+100 ?150mM NaCl+0. 01 ?0· 03 % NaN3+l ?2mM EDTA ; 4) 向RBP组分2中添加饱和硫酸铵溶液直至其中硫酸铵的饱和度为25?30%，然后 过Phenyl Sepharose? High Performance疏水柱，用流动相梯度洗脱，收集洗脱峰，对洗脱 峰进行检测，合并纯度大于等于90%的部分，得到RBP组分3 ;其中：所述的流动相由缓冲 液A和缓冲液D组成， 缓冲液 A :15 ?25mM Tris-HCl ρΗ7· 5 ?8. 0+0· 01 ?0· 03% NaN3+l ?2mM EDTA ; 缓冲液 D :15 ?25mM Tris-HCl ρΗ7· 5 ?8· 0+25 ?30% SAS+0. 01 ?0· 03% NaN3+l ? 3mM EDTA ； 5) 将RBP组分3用硫酸铵盐析，使其中硫酸铵的饱和度为55?65%，离心，收集蛋白 沉淀，所得蛋白沉淀用缓冲液C复溶，离心，取上清液经Superdex 75分子筛凝胶层析，用 缓冲液C洗脱，收集洗脱峰，对洗脱峰进行检测，合并纯度大于等于97 %的部分，得到RBP组 分4 ; 6) 取RBP组分4上偶联a fMG多抗的CNBr-activated Sepharose 4B柱层析，收集流 出液，WB检测，得到RBP抗原。
2. 根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：步骤2)中，所述缓冲液B1和缓冲液B2的 组成为： 缓冲液 B1 :20mM Tris-HCl pH 8. 0+40 ?50mM NaCl+0. 02% NaN3+lmM EDTA ; 缓冲液 B2 :20mM Tris-HCl pH8. 0+300mM NaCl+0. 02% NaN3+lmM EDTA。
3. 根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：步骤4)中，所述缓冲液A和缓冲液D的 组成为： 缓冲液 A :20mM Tris-HCl ρΗ8· 05+0. 02% NaN3+lmM EDTA ; 缓冲液 D :20mM Tris-HCl ρΗ8· 0+25 ?30% SAS+0. 02% NaN3+lmM EDTA。
4. 根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：步骤4)中，过Phenyl Sepharose? High Performance疏水柱层析时，流动相的洗脱条件为： 在收集10倍柱体积洗脱液的时间内：缓冲液D : 100 - 0%，缓冲液A :0 - 100%。
5. 根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：所述缓冲液C的组成为： 缓冲液 C :20mM Tris-HCl pH 8. 0+120mM NaCl+O. 02% NaN3+lmM EDTA。
6. 抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体的制备工艺，包括以下步骤： I )选取合适的动物，以权利要求1制得的RBP抗原为免疫原对其进行皮下免疫注射， 直至动物的特异性抗血清滴度达标； Π )采集动物的抗血清，所得抗血清进行免疫电泳，如存在免疫球蛋白类及白蛋白杂 带，将抗血清过偶联正常人血清的CNBr-activated Sepharose 4B柱去除免疫球蛋白类及 白蛋白杂带，收集流出液，得到除杂后的抗血清； III)用饱和度为40?60%的硫酸铵溶液沉淀除杂后的抗血清中的动物抗人腹水球蛋 白，离心，收集沉淀，沉淀透析脱盐后过DEAE-Sepharose Fast Flow凝胶柱层析，用缓冲液E 洗脱，收集洗脱峰，对洗脱峰进行检测，得到抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体；所述缓冲液 E的组成为： 缓冲液 E :15 ?25mM Tris-HCl ρΗ7· 5 ?8. 5+90 ?110mM NaCl。
7. 根据权利要求6所述的工艺，其特征在于：步骤III)中，缓冲液E:20mM Tris-HCl pH8. O+lOOmM NaCl。
【文档编号】C07K1/16GK104193817SQ201410452198
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月5日 优先权日:2014年9月5日
【发明者】蔡豪斌, 李珏燕, 粟晓玲 申请人:桂林英美特生物技术有限公司