一种可破坏细菌细胞壁的蛋白及其制备方法

一种可破坏细菌细胞壁的蛋白及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了属于基因工程领域的一种可破坏细菌细胞壁的蛋白。本发明可破坏细菌细胞壁的蛋白AUTO2由SEQ ID No：1所示的氨基酸序列组成；其编码基因由SEQ ID No：2所示的核苷酸序列组成。本发明还公开了该蛋白的制备方法。与已知的lmo1521基因相比，本发明AUTO2蛋白具有更高活性，AUTO2蛋白对自身单增李斯特菌有明显抑制作用，抑菌效果好，为食品、卫生行业提供了新的抑菌蛋白；其次，本发明制备方法采用超声波破碎细胞，目标蛋白存在于可溶相中，便于分离纯化，避免了包涵体的产生；此外，本发明制备方法中蛋白含有6XHis标签，便于采用Ni-NTA柱分离，且所得AUTO2蛋白纯度高。
【专利说明】一种可破坏细菌细胞壁的蛋白及其制备方法

【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及一种可破坏细菌细胞壁的蛋白，以及该蛋白 的制备方法。

【背景技术】
[0002] 细菌的细胞壁是由多糖链和氨基酸肽链组成的肽聚糖网状结构，细菌自身表达的 一类蛋白能够水解细菌细胞壁的肽聚糖结构，以满足伴随细菌细胞生长、分裂和鞭毛生长 时细胞壁结构的动态变化，这类蛋白统称为肽聚糖水解酶。根据水解肽聚糖时水解酶切位 点的不同，又可定义为N-乙酰葡糖胺酶（N-acetylglucosaminidases)、N-乙酰胞壁酸酶 (N-acetylmuramidases)、酉先胺酶（N-acetylmuramyl-L-alanine amidases)、肤链内切酶 (Endopeptidases)等。这类肽聚糖水解酶因其能够降解细菌自身的细胞壁又称为自溶素。 自溶素参与细菌的多种生物学功能，如降解细胞壁、促使细胞分裂及调节细胞壁更新。在感 染宿主时自溶素可以协助细菌粘附并入侵宿主细胞，影响细菌在细胞内及细胞间的扩散力 并诱导免疫细胞产生细胞因子。自溶素的生物学功能还体现在生物膜、鞭毛及孢子形成、遗 传转化能力、蛋白分泌及自我溶解等，与细菌的致病力密切相关。
[0003] 自溶素在细菌体内表达受到时间和空间上的严格调控，即可保证细胞壁适度降解 满足细菌生存及侵染宿主的要求，又不会因其过度降解引起细菌自溶。但是如果细菌中的 自溶素蛋白被过度表达，其表达产物保留了破坏细菌细胞壁的功能，又打破了细菌体内基 因表达时空的调控限制，就可引起细菌自溶或破坏同类的细菌。因此，利用基因工程的方法 克隆细菌的肽聚糖水解酶基因，转到大肠杆菌中诱导原核过表达，发酵培养，蛋白纯化，可 获得持续高活性的肽聚糖水解酶。体外添加的肽聚糖水解酶可有效地破坏细菌细胞的正常 繁殖与生长，达到抑制细菌生长的作用。
[0004] 单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenesis)是一种在环境中普遍存在 的革兰氏阳性菌，能引起人和动物严重的食源性感染。目前已从中鉴定出p60、p45、Ami、 八此〇、18?^11^、1^〇0327和？1 &4等8种自溶素蛋白（李唤弟等.中华微生物学与免疫学 杂志，2013, 33(12) :964-969 ;崔焕忠等.食品科学，2012, 33(11) :290-293)。通过比对单 核细胞增生李斯特菌E⑶-e菌株（l/2a血清型）全基因组序列信息，发现其Lm〇1521基因拥 有酰胺酶结构域，为假定的N-乙酰胞壁酸一L一丙氨酸酰胺酶功能，但是其基因的蛋白产 物和功能尚未被生物化学实验证实。张红娟（张红娟.中国计量学院硕士学位论文，2012) 参考单增李斯特菌野生型标准菌株EGD-e(血清型l/2a)的全基因序列（NC_003210)中 lm〇1521成熟蛋白序列，从增生李斯特菌菌株LM-CMCC54002(血清型l/2a)基因组中克隆了 相应基因的ORF框，对比发现它与标准菌株E⑶-e(NC_003210)中lmol521只存在一个碱基 的差异，翻译的氨基酸序列完全相同，其表达蛋白具有低活性的水解细胞壁的功能。


【发明内容】

[0005] 本发明目的在于提供一种可破坏细菌细胞壁的蛋白。
[0006] 本发明另一目的在于提供编码上述可破坏细菌细胞壁的蛋白的基因。
[0007] 本发明第三目的在于提供含有上述基因的表达载体。
[0008] 本发明第四目的在于提供上述蛋白的制备方法。
[0009] 本发明第五目的在于提供上述蛋白在破坏细菌细胞壁方面的用途。
[0010] 为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
[0011] 本发明一种可破坏细菌细胞壁的蛋白，命名为AUT02,所述的蛋白由SEQ ID No :1 所示的氨基酸序列组成。
[0012] 编码上述可破坏细菌细胞壁的蛋白的基因，命名为aut〇2,所述的基因由SEQ ID No :2所示的核苷酸序列组成。
[0013] 含有上述可破坏细菌细胞壁的蛋白的基因的表达载体。
[0014] 上述表达载体中所述的载体是指pET-22b、pET-28a或pET-28c等之一种。
[0015] 上述可破坏细菌细胞壁的蛋白的制备方法，包括如下步骤：
[0016] (1)、以单核细胞增生李斯特菌菌株LM-CMCC54007 (血清型4b)的基因组DNA为模 板，以lmol521-F和lmol521-R为引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；所述的引物为：
[0017] lmol521-F ：CGCGGATCCGAATTCCGTTGTCGTCAAAGCAGAAG ； (SEQ ID No:3)
[0018] lmol521-R ：CCCAAGCTTATTAGAGAAGTAATTAGATAGGCCGTCTG(SEQ ID No:4)；
[0019] (2)、表达载体的构建：将步骤⑴中所得的PCR扩增产物用BamH I和Hind III 进行双酶切，得aut〇2基因片段；然后将双酶切后所得的aut〇2基因片段与载体pET-22b用 T4DNA连接酶连接，得连接产物；将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5a，提取重组质粒，测 序，得含有auto2基因的重组质粒,将所得重组质粒命名为pET-22b_auto2 ;
[0020] (3)、auto2基因的原核表达：
[0021] 用热激法将pET-22b-aut〇2重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21 (DE3)，将 转化后的细胞涂布在含lOOug/mL Amp的LB固体培养基中，在37°C培养24-48h ;取阳性 单菌落，接种于LB液体培养基中，在37°C、150?220rpm条件下培养4?6h，加甘油分 装，-20°C冰箱保存；
[0022] (4)、取步骤（3)所得的转化菌株，接种于含lOOug/mL Amp LB液体培养基，在 37°C、150?220rpm条件下过夜培养；次日按1 :80?120比例更换新鲜液体LB培养基， 扩大培养细菌〇D_到0. 5?0. 7时，添加异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)到终浓 度0. 5mmol/mL，在26?30°C、130?160rpm条件下培养3?6h ;收集菌液转到离心管，在 4°C、4000?5000rpm下离心8?10min，收集沉淀细胞；
[0023] (5)、细胞破碎与增溶：
[0024] 按1:3?5(g/ml)的比例向步骤（4)所得的沉淀细胞添加 Ix裂解缓冲液，得混 合液；将混合液置于冰水混合的水浴中超声破碎仪（超声功率为200W，超5s停5s)中破碎 至细胞完全（溶液清亮透明）；加入聚乙二醇单辛基苯基醚（Triton X-100)至终浓度为 0. 1 %，置于4°C冰箱中过夜；次日在4°C、8000rpm条件下离心15min，收集上清液；
[0025] (6)、Ni-NTA树脂纯化目标蛋白：
[0026] 将步骤（5)所得上清液用0. 22um滤膜过滤，取滤液；按0. 5?1. 5 :1的体积比比 例将滤液与50% Ni-NTA混合，在4°C、水平摇床上80rpm条件下结合3h，然后装入色谱柱， 收集流出液；用Ix漂洗缓冲液漂洗2?3个柱床体积后，更换为Ix洗脱缓冲液用量为2个 柱床体积，分步收集洗脱缓冲液加入后的流出液，SDS-PAGE电泳分析检测流出液的蛋白组 分；收集47. 5KD单一组分蛋白的流出液，弃去其他部分流出液；
[0027] (7)、蛋白脱盐、透析复性和冷冻保存：
[0028] 用I Ami con? Ultra-15超滤离心管浓缩步骤（6)所得的洗脱液，浓缩条件为4°C、 5000rpm离心20-30min ;收集浓缩液转移至14kDa MWCO的透析袋，在超纯水中4°C透析 24h，中间更换用超纯水3次；透析后的溶液-20°C冰箱冷冻过夜，冷冻干燥，得提纯的AUT02 蛋白冻干粉末；将所得的冻干粉末蛋白在_20°C冰箱保存。
[0029] 上述制备方法步骤（3)中所述的LB固体培养基的组成成分及其比例为：蛋白胨 l〇g/L、酵母浸膏5g/L、氯化钠10g/L、琼脂10g/L，去离子水补充到1L。
[0030] 上述制备方法步骤（3)中所述的LB液体培养基的组成成分及其比例为：蛋白胨 l〇g/L、酵母浸膏5g/L、氯化钠10g/L，去离子水补充到1L。
[0031] 上述制备方法步骤（5)中所述的裂解缓冲液的组成成分为：10mM咪唑，5%的甘 油，300mM NaCl，50mM NaH2P04,0. ImM PMSF，pH8.0。
[0032] 上述制备方法步骤（6)中所述的漂洗缓冲液的组成成分及其比例为：50mM咪唑， 300mM NaCl，50mM NaH2PO4,去离子水补充到 lL，pH8.0。
[0033] 上述制备方法步骤（6)中所述的洗脱缓冲液的组成成分及其比例为：250mM咪唑， 300mM NaCl，50mM NaH2PO4,去离子水补充到 lL，pH8.0。
[0034] 上述蛋白在破坏细菌细胞壁方面的用途。
[0035] 本发明具有的优点和有益效果，（1)、本发明aut〇2基因和AUT02蛋白与标准菌株 E⑶-e(NC_003210)中lmol521在35个碱基和3个的氨基酸上存在差异，本发明AUT02蛋 白具有更高活性。（2)、本发明AUT02蛋白对革兰氏阳性的自身单增李斯特菌有明显抑制作 用，其抑菌效果好，为食品、卫生行业提供了一种新的抑菌蛋白。（3)、本发明制备方法中大 肠杆菌表达的目标蛋白是非分泌型的，低速离心收集细胞培养物，目标蛋白存在于细胞中， 便于高效分离得到。（4)本发明制备方法采用超声波破碎细胞，目标蛋白存在于的可溶相 中，便于分离纯化。避免了包涵体的产生。（5)本发明制备方法中蛋白含有6XHis标签，便 于采用Ni-NTA柱分离即可达到纯化效果。纯化方法相对简单。

【专利附图】

【附图说明】
[0036] 图I. auto2基因 PCR扩增电泳图谱；其中M为Marker，1为auto2基因片段。
[0037] 图2. AUT02蛋白水解自身细胞壁的对比电泳图谱；其中M为蛋白分子量，1为考马 斯亮兰染色，2为亚甲基蓝染色。
[0038] 图3. AUT02蛋白处理Omin (对照）的单增李斯特菌活细胞显微照片。
[0039] 图4. AUT02蛋白处理15min的单增李斯特菌活细胞变化显微照片。
[0040] 图5. AUT02蛋白处理30min的单增李斯特菌活细胞变化显微照片。
[0041] 图6. AUT02蛋白处理90min的单增李斯特菌活细胞变化显微照片。
[0042] 图7.未添加 AUT02蛋白单增李斯特菌的菌落生长照片。
[0043] 图8.添加 AUT02蛋白的单增李斯特菌的菌落生长受到抑制照片。

【具体实施方式】
[0044] 以下以具体实施例对本发明作进一步的详细说明，但是不对本发明的保护范围构 成任何限制。如无特别说明，以下实施例中所用的试剂皆为常规试剂，所用的方法皆为本领 域技术人员熟知的常规方法。下述实施例中Pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、高纯dNTPs、 Trans 4K DNA marker、IKb DNA marker购自北京全式金生物技术有限公司；T4DNA连接酶、 FastAP?碱性磷酸化酶、限制性内切酶BamH I和Hind III;AXYGEN DNA凝胶回收试剂盒、 AXYGEN PCR清洁试剂盒、AXYGEN质粒小量制备试剂盒购自泽横生物技术有限公司；胰蛋白 胨、酵母提取物购自杭州米克生物技术公司（英国OXOID公司产品）；IPTG、X-Gal、CTAB、 Tris、Ni-NTA纯化树脂等购自上海生物工程有限公司。
[0045] 实施例1本发明可破坏细菌细胞壁的蛋白的制备
[0046] 按照如下方法进行：
[0047] (1)、以单核细胞增生李斯特菌菌株LM-CMCC54007 (血清型4b)的基因组DNA为模 板，以lm〇1521-F和lm〇1521-R为引物（由上海生工生物工程技术服务有限公司合成）进 行PCR扩增，得PCR扩增产物；
[0048] 所述的引物为：
[0049] lmol521-F ：CGCGGATCCGAATTCCGTTGTCGTCAAAGCAGAAG ; (SEQ ID No: 3)，
[0050] lmol521-R ：CCCAAGCTTATTAGAGAAGTAATTAGATAGGCCGTCTG(SEQ ID No:4)；
[0051] PCR 反应体系（50μ L):模板 2μ L，pfu 酶（5U/y L)0. 5μ L，IOXpfu Buffer (含 Mg2+) 5 μ L，dNTPs (各 2. 5mM) 2 μ L，Imol521-F/Imol521-R(10 μ Μ) 2 μ L，加 ddH20 至 50 μ L。 PCR 反应条件：94°C 5min ;94°C 30s，55°C 50s，72°C 3min(2.5min)，34 个循环；72°C lOmin。
[0052] PCR产物经琼脂糖凝胶电泳（片段大小见图I)，然后用DNA切胶回收试剂盒回收 纯化。
[0053] (2)、表达载体的构建：将步骤（1)中所得的PCR扩增产物用限制性内切酶BamH I和Hind III进行双酶切；PCR产物双酶切体系为（50yL):10XBamH I buffer 5yL， BamH I lyL，Hind III 2 μ L，PCR产物42 μ L。将酶切体系加入200 μ L离心管，充分混 匀，37°C酶切3h。反应结束后65°C 20min灭活限制性内切酶，用PCR清洁试剂盒纯化目的 DNA，得aut〇2基因序列；然后将双酶切后所得的aut〇2基因片段与载体pET-22b用T4DNA 连接酶连接，得连接产物；将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5 α，提取pET-22b-aut〇2重 组质粒，将重组质粒转化至BL21 (DE3)。重组载体测序，通过测序获得aut〇2基因的碱基序 列（见SEQ ID No:2)和AUT02蛋白氨基酸序列（见SEQ ID No: 1)。将所得重组质粒命名 为pET-22b-auto2 ;由LM-CMCC54007 (血清型4b)菌株中克隆出的碱基序列与E⑶-e菌株 (NC_003210)中lmol521基因比对，发现存在35个碱基差异，对应的编码蛋白仅存在3个 氨基酸差异，分别是123位由A(丙氨酸）代替了 S (丝氨酸）、271位由S (丝氨酸）代替了 A(丙氨酸）404位由S(丝氨酸）代替了天冬酰胺；说明本发明aut〇2基因与现有基因完全 不同，为一个新基因。
[0054] (3)、auto2基因的原核表达
[0055] 用热激法将pET-22b-aut〇2重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21 (DE3)，将 转化后的细胞涂布在含l〇〇ug/mL Amp的LB固体培养基（蛋白胨10g/L、酵母浸膏5g/L、氯 化钠 l〇g/L、琼脂10g/L，去离子水补充至1L)中，在37°C培养48h ;取阳性单菌落，接种于LB 液体培养基中，在37°C、220rpm条件下培养4h，加甘油分装，-20°C冰箱保存。
[0056] (4)、取保存的转化菌株，接种于含lOOug/mL Amp LB液体培养基（蛋白胨10g/L、 酵母浸膏5g/L、氯化钠10g/L，去离子水补充至1L)，在37°C、220rpm条件下过夜培养，次日 按1:100比例更换新鲜液体LB培养基，扩大培养细菌0D_到0. 7时，添加异丙基-β -D-硫 代吡喃半乳糖苷（IPTG)到终浓度0. 5mmol/mL，在28°C、160rpm条件下培养5h ;收集菌液转 到离心管，在4°C、4500rpm下离心9min，收集沉淀细胞。
[0057] (5)、细胞破碎与增溶
[0058] 按1:4 (g/ml)的比例向步骤（3)所得的沉淀细胞添加 Ix裂解缓冲液（裂解缓冲 液的组成成分为：10mM 咪唑，5% 的甘油，300mM NaCl，50mM NaH2P04,0. ImM PMSF pH8. 0)， 得混合液；将混合液置于冰水混合的水浴中超声破碎仪（超声功率为200W，超5s停5s)中 破碎至细胞完全（溶液清亮透明）；加入聚乙二醇单辛基苯基醚（Triton X-100)至终浓度 为0. 1%，置于4°C冰箱中，过夜增加溶解度；次日在4°C、8000rpm条件下离心15min，收集 上清液；SDS-PAGE电泳检测，所述的AUT02蛋白的分子量为47. 5KD。
[0059] (6)、Ni-NTA树脂纯化目标蛋白
[0060] 将步骤（5)所得上清液用0. 22um滤膜过滤，取滤液；按1. 0 :1的体积比比例将滤 液与50% Ni-NTA混合，在4°C、水平摇床上80rpm条件下结合3h，然后装入色谱柱（室温 10-30°C )，收集流出液；用 Ix 漂洗缓冲液（50mM 咪唑，300mM NaCl，50mM NaH2P04，pH8. 0)漂 洗2-3个柱床体积（除去未与金属镍结合或结合较弱的其它蛋白）后（可参考紫外检测仪 检测中至低280吸收值）；更换为Ix洗脱缓冲液（250mM咪唑，300mM NaCl，50mM NaH2PO4, PH8.0)用量为2个柱床体积，分步收集洗脱缓冲液加入后的流出液（可参考紫外检测仪检 测数据280高峰吸收值），SDS - PAGE电泳分析检测流出液的蛋白组分；收集47. 5KD单一 组分蛋白的流出液，弃去其他部分流出液。
[0061] 出）、蛋白脱盐、透析复性和冷冻保存
[0062] 合并Ni-NTA 柱纯化洗脱缓冲液（250mM咪唑，300mM NaCl，50mM NaH2PO4, ρΗ8· 0)加 入后淋洗出含单一 AUT02蛋白的洗脱液（SDS-PAGE电泳显示含近乎单一的47. 5KD条带）； 用lAmicon? Ultra-15(截留分子量MWCO :10kDa)离心过滤器（GE公司产品，不限）浓缩洗 脱液，浓缩条件为4°C、5000rpm离心20-30min ;收集浓缩液转移至14kDa MWCO的透析袋， 在超纯水中4°C透析24h,中间更换用超纯水3次；透析后的溶液-20°C冰箱冷冻过夜,冷冻 干燥，得提纯的AUT02蛋白冻干粉末；制备的冻干粉末蛋白在-20°C冰箱保存。
[0063] 实施例2本发明AUT02蛋白水解自身单增李斯特菌细胞壁的试验
[0064] 试验材料：单增李斯特菌LM - CMCC54007菌株的细胞壁和实施例1制备的AUT02 蛋白。
[0065] 试验方法：
[0066] (1)、细菌细胞壁的制备：取过夜培养的野生型单增李斯特菌（CMCC54007)(来 自杭州市疾控中心，本试验室保存）离心，收集细胞沉淀，〇. 9 %的生理盐水洗涤细胞沉 淀，KKTC煮30min (或高压灭菌），超声破碎（超声功率为300W，破碎7s，停3s)细胞lh， 2000rpm，离心IOmin除去未破碎的菌体，取上清液在12000rpm下离心20min，收集沉淀，沉 淀即为粗制的细胞壁，冻干保存备用。
[0067] (2)、按常规方法配置SDS-PAGE电泳4%的浓缩胶，在12%的分离胶中加入1. 5% (wt/vol)的单增李斯特菌的细胞壁作为底物，配制成复性SDS-PAGE电泳胶。做水解活性分 析的蛋白样品用非还原性上样缓冲液（250mMTris-HCl(pH6. 8),10% (w/v)SDS，0. 5% (w/ v)溴酚蓝，50% (v/v)甘油）处理，4°C、20mA恒流电泳。
[0068] (3)、在同一块添加了细胞壁底物的SDS-PAGE胶上将相同的电泳样品点在左右不 同的区域。电泳结束后，将SDS-PAGE左右两侧切开，分别做考马斯亮蓝染色和复性处理。 考马斯亮蓝染色一侧的凝胶含有分子量标记样品。将另外一侧的凝胶转移至250ml去离 子水中，室温、SOrpm漂洗30min，然后切除溴酚蓝指示剂以下胶，将指示剂以上部分转移至 复性缓冲液中（0.1%Triton X-100，10mM MgC12,25mM 1^8-!1(：1，口!17.5)，室温、80印111漂 洗30min，更换新鲜的复性液中，37°C、80rpm孵育3-16h。孵育结束后用去离子水漂洗复性 胶2-3次，用0. 1 %亚甲基蓝染色液（含0.01 %的Κ0Η)染色3h，用去离子水脱色8h，在凝 胶成像系统分析结果。此时SDS-PAGE分离胶中的细菌细胞壁被亚甲基蓝染成不透明的蓝 色。而含有水解细胞壁活性的AUT02蛋白，则可把凝胶中的细菌细胞壁底物水解破坏掉，产 生透明的区域。结果（见图2)在实施例1制备的AUT02蛋白，添加单增李斯特菌细胞壁的 SDS-PAGE电泳板上，用考马斯亮兰染色，结果（见图2,泳道1)显示主要为47. 5kDa处的 AUT02蛋白。而经复性孵育水解16h亚甲基蓝染色，在对应的47. 5kDa处有透明区域（（见 图2,泳道2,向左箭头所示），说明AUT02蛋白具有水解自身细胞壁活性。
[0069] 实施例3 :本发明AUT02蛋白破坏单增李斯特菌活细胞试验
[0070] 试验样品：单增李斯特菌活细胞（CMCC54007)(来自杭州市疾控中心，本试验室保 存）；实施例1制备的AUT02蛋白。
[0071] 试验方法：低速离心收集过夜培养的单增李斯特菌活细胞（CMCC54007)，加水解 反应缓冲液（〇· 1% Triton X-100, IOmM MgCl2, 25mM Tris-HCl，去离子水补充到 lL，pH7. 5) 调至OD6tltl = 1. 0, IO5-IO6CFU左右，作为水解底物细菌悬浮液备用。
[0072] 取用IOmM PBS缓冲液溶解实施例1制备的AUT02蛋白为浓度为15. Oug/ul的蛋白 样品IOul与水解反应缓冲液中IO5-IO6CFU左右的单增李斯特菌活细胞悬浮液90ul混合均 勻，在37°C、IOOrpm摇床上反应90min。分别在反应Omin、15min、30min、90min时间点各取 样5ul，立即均匀涂在载破片上烘干。采用革兰氏染色，用Nikon显微镜观察重组蛋白降解 单增李斯特菌活细胞过程中细胞形态及密度变化。结果未加 AUT02蛋白（见图3, Omin时 对照）时，单增李斯特菌细胞菌体呈杆状，菌体细胞密集布满整个视野；反应15min时（见 图4)，细胞形态开始发生变化，部分短杆状的单增李斯特菌变为球状，细胞密度开始降低； 反应30min时（见图5)，细胞密度持续降低，细胞进一步变成球状并开始聚集；当反应至 90min时（见图6)，几乎看不到完整的单一杆状菌体，细胞聚集成团状，显微镜视野中几乎 观察不到单一的细菌菌体。说明本发明AUT02蛋白具有破坏细菌活细胞的作用。
[0073] 实施例4本发明AUT02蛋白抑制单增李斯特菌生长试验
[0074] 试验方法：用水解反应缓冲液（其组成成分及其比例为：0. 1 % Triton X-100, IOmM MgCl2, 25mM Tris-HCl，去离子水补充到 1L，ρΗ7· 5)制备 IO5-IO6CFU 的新鲜培 养的单增李斯特菌LM-CMCC54007(来自杭州市疾控中心，本实验室保存）细胞悬浮液。实 验组添加实施例1制备的的AUT02蛋白至终浓度为I. 5ug/ul，对照组用PBS缓冲液代替蛋 白液。反应30min时，实验组取IOul用涂布法接种于9cm培养皿的BHI固体培养基，反应 60min时，对照组取IOul用涂布法接种于9cm培养皿的BHI固体培养基，实验组、对照组均 设3个重复。两组平板在恒温培养箱中37°C倒置培养24h。
[0075] 结果未添加 AUT02蛋白的对照组（见图7)平板菌落正常生长，而添加 AUT02蛋白 的实验组（见图8)平板未见菌落生长。说明经过30min的本发明AUT02蛋白处理，AUT02 蛋白破坏了单增李斯特菌的细胞壁，使单增李斯特菌细胞失去正常的生活能力。
【权利要求】
1. 一种可破坏细菌细胞壁的蛋白，其特征在于所述的蛋白由SEQIDN〇:l所示的氨基 酸序列组成。
2. 编码权利要求1所述的蛋白的基因，其特征在于所述的基因由SEQIDNo:2所示的 核苷酸序列组成。
3. 含有权利要求1所述的基因的表达载体。
4. 按照权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述的载体是指pET-22b、pET-28a或 pET-28c之一种。
5. 上述可破坏细菌细胞壁的蛋白的制备方法，包括如下步骤： (1) 、以单核细胞增生李斯特菌菌株LM-CMCC54007 (血清型4b)的基因组DNA为模板， 以lmol521-F和lmol521-R为引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；所述的引物为： lmol521-F：CGCGGATCCGAATTCCGTTGTCGTCAAAGCAGAAG；(SEQIDNo:3) lmol521-R：CCCAAGCTTATTAGAGAAGTAATTAGATAGGCCGTCTG(SEQIDNo:4)； (2) 、将步骤（1)中所得的PCR扩增产物用BamHI和HindIII进行双酶切，得aut〇2 基因片段；然后将双酶切后所得的aut〇2基因片段与载体pET-22b用T4DNA连接酶连接，得 连接产物；将所得的连接产物转化大肠杆菌DH5a，提取重组质粒，测序，得含有aut〇2基因 的重组质粒，将所得重组质粒命名为pET-22b-auto2 ; (3) 、用热激法将pET-22b-aut〇2重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21 (DE3)， 将转化后的细胞涂布在含100ug/mLAmp的LB固体培养基中，在37°C培养24-48h;取阳 性单菌落，接种于LB液体培养基中，在37°C、150?220rpm条件下培养4?6h，加甘油分 装，-20°C冰箱保存； (4) 、取步骤（3)所得的转化菌株，接种于含100ug/mLAmpLB液体培养基，在37°C、 150?220rpm条件下过夜培养；次日按1 :80?120比例更换新鲜液体LB培养基，扩大 培养细菌〇D6(l(l到0. 5?0. 7时，添加异丙基-0 -D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)到终浓度 0. 5mmol/mL，在26?30°C、130?160rpm条件下培养3?6h;收集菌液转到离心管，在4°C、 4000?5000rpm下离心8?10min，收集沉淀细胞； (5) 、按1:3?5(g/ml)的比例向步骤（4)所得的沉淀细胞添加lx裂解缓冲液，得混 合液；将混合液置于冰水混合的水浴中超声破碎仪（超声功率为200W，超5s停5s)中破碎 至细胞完全（溶液清亮透明）；加入聚乙二醇单辛基苯基醚（TritonX-100)至终浓度为 0. 1%，置于4°C冰箱中过夜；次日在4°C、8000rpm条件下离心15min，收集上清液； (6) 、将步骤（5)所得上清液用0. 22um滤膜过滤，取滤液；按0. 5?1. 5 :1的体积比比 例将滤液与50%Ni-NTA混合，在4°C、水平摇床上80rpm条件下结合3h，然后装入色谱柱， 收集流出液；用lx漂洗缓冲液漂洗2?3个柱床体积后，更换为lx洗脱缓冲液用量为2个 柱床体积，分步收集洗脱缓冲液加入后的流出液，SDS-PAGE电泳分析检测流出液的蛋白组 分；收集47. 5KD单一组分蛋白的流出液，弃去其他部分流出液； (7) 、用Amicon?Ultra-15超滤离心管浓缩步骤（6)所得的洗脱液，浓缩条件为4°C、 5000rpm离心20-30min;收集浓缩液转移至14kDaMWC0的透析袋，在超纯水中4°C透析 24h，中间更换用超纯水3次；透析后的溶液-20°C冰箱冷冻过夜，冷冻干燥，得提纯的AUT02 蛋白冻干粉末；将所得的冻干粉末蛋白在_20°C冰箱保存。
6. 按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于其步骤（3)中所述的LB固体培养基的 组成成分及其比例为：蛋白胨l〇g/L、酵母浸膏5g/L、氯化钠10g/L、琼脂10g/L，去离子水补 充到1L;所述的LB液体培养基的组成成分及其比例为：蛋白胨10g/L、酵母浸膏5g/L、氯化 钠l〇g/L，去离子水补充到1L。
7. 按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于其步骤（5)中所述的裂解缓冲液的组 成成分为：1〇禮咪唑，5%的甘油，30〇1111似(：1，5〇1111恥11 2?04,0.11111?]\074118.0。
8. 按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于其步骤（6)中所述的漂洗缓冲液的组 成成分及其比例为：50mM咪唑，300mMNaCl，50mMNaH2P04，去离子水补充到lL，pH8. 0。
9. 按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于其步骤（6)中所述的洗脱缓冲液的组 成成分及其比例为：250mM咪唑，300mMNaCl，50mMNaH2P04，去离子水补充到lL，pH8. 0。
10. 权利要求1所述的蛋白在破坏细菌细胞壁方面的用途。
【文档编号】C07K14/195GK104402979SQ201410696091
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月26日 优先权日:2014年11月26日
【发明者】李素芳, 潘家荣, 李唤弟, 张红娟, 管峰 申请人:中国计量学院