一种重金属转运蛋白及其编码基因PtHMA5与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种重金属转运蛋白及其编码基因PtHMA5与应用。该蛋白质是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物重金属转运能力相关的蛋白质。通过实验证明：本发明提供的蛋白具有提高植物重金属转运的功能，可以为植物富集重金属基因工程育种提供重要的基因资源。
【专利说明】-种重金属转运蛋白及其编码基因PtHMA5与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种重金属转运蛋白及其编码基因PtHMAS 与应用。
【背景技术】
[0002] 随着城市化、工业化、汽车尾气排放W及农业集约化经营的加剧，重金属污染问题 越来越受到人们的关注。重金属污染不仅导致±壤退化、农作物产量和品质降低，而且能 通过直接接触、食物链传递等途径危及人类的生命和健康。領（Cd)是重要的重金属之一， 在工农业生产中具有广泛的应化如制造合金、颜料、塑料稳定齐U、英光粉、杀菌剂、油漆、电 锻、电池、电器等，也因此成为全球性的五大重金属污染源之一。近几年来国内外陆续有領 污染的报道，如2009年湖南浏阳領污染事件、2011年云南曲靖領污染事件、2012年广西龙 江領污染事件和2013年湖南領超标大米事件等。相比于領在食物、大气、水体中污染的情 况，±壤領污染情况更为严重，且影响深远。±壤中的領不但可W被水载带进行迁移，而且 可W释放到大气中与大气颗粒物结合进行长距离传输。因此，領污染±壤的修复和治理成 为近年来人们关注的热点问题。
[0003] 植物修复（phytoremediation)是近年来国际上兴起的一种治理重金属污染±壤 的新技术，其基本思想是将利用植物对±壤重金属的吸收和富集作用，达到降低±壤重金 属含量的目的。由于该技术具有高效、低耗、保持水±、工程小、无二次污染、能减少±壤侵 蚀、美化景观等优点，被誉为廉价的绿色修复技术，因此在清除±壤重金属污染方面有着广 泛的应用前景，已经成为业界研究的热点。
[0004] 研究显示，大多数植物品种吸收的領多位于地下部分，转运至地上部分的含量较 少，不能有效地去除±壤中的領。近年来，随着分子生物学技术的发展，利用基因工程技术 培育高效的領富集转基因植株成为可能，为短期内获得目标品种提供了有效的途径。目前， 此类研究成果非常有限，主要原因在于缺乏高效的基因资源，对其相应的结构、功能认识较 为浅显，发掘更多的基因资源已成为必然。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种蛋白质。
[0006] 本发明提供的蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：
[0007] a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0008] b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且与植物顶端优势相关的蛋白质。
[0009] 本发明提供的所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B6)中的任一种：
[0010] B1)编码上述所述蛋白质的核酸分子；
[0011] B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
[0012] B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
[0013] B4)含有Bl)所述核酸分子的重组质粒、或含有B2)所述表达盒的重组质粒；
[0014] B5)含有B1)所述核酸分子的重组菌、或含有B2)所述表达盒的重组菌、或含有 B3)所述重组载体的重组菌；
[0015] B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因 植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系。
[0016] 上述相关生物材料中，B1)所述的核酸分子如序列表中序列1的DNA分子所示。
[0017] 本发明的另一个目的是提供上述所述蛋白质或上述所述相关生物材料在提高植 物重金属转运能力中的应用。
[0018] 上述应用中，所述重金属具体为領。
[0019] 本发明的最后一个目的是提供一种构建转基因植物的方法。
[0020] 本发明提供的构建转基因植物的方法包括如下步骤；使上述所述蛋白质在出发植 物中过表达，进而使植物的重金属转运能力提高。
[0021] 上述方法中，所述使上述所述蛋白质在出发植物中过表达的方法为：向出发植物 中导入上述所述蛋白质的编码基因，得到转基因植物；转基因植物与出发植物相比，重金属 转运能力提局。
[002引上述方法中，所述蛋白质的编码基因如序列表中序列1的DNA分子所示。
[0023] 上述方法中，所述重金属具体为領。
[0024] 上述方法中，所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为 烟草。
[00巧]本发明提供了一种重金属转运蛋白及其编码基因PtHMA5与应用。本研究从毛白 杨中获得了一个重金属转运相关基因PtHMA5,该基因在茎中高表达，根中表达较弱，具有典 型的重金属转运酶蛋白PlB-ATPase的基本元件，将该基因导入烟草中，通过領转运试验证 明，转基因烟草由地下部分转运領至地上部分的效率明显高于野生型烟草，可W为植物富 集重金属基因工程育种提供重要的基因资源。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1为利用简并引物Pt2-F/Pt2-R扩增毛白杨HMA基因片段。其中，M;100bp DNALadder ;1 ;水；2 ;叶片；3 ;茎；4 ;根。
[0027] 图2为利用引物P地MAF/PtHMAR扩增毛白杨HMA基因片段。其中，1 ;茎；2;根；M: 500bp DNA Ladder。
[002引图3为PtHMA5蛋白高级结构的模式图。其中，箭头所指为氨基酸的N端。
[0029] 图4为植物表达载体阳ZR化)-LC-P地MA5的构建。
[0030] 图5为阳ZR化)-LC-PtHMA5重组表达质粒的检测。其中，a为利用基因特异引物 PtHMAF/PtHMAR扩增转化农杆菌克隆；b为Sal I /Avrll双酶切鉴定阳性重组表达质粒。
[0031] 图6为转基因的烟草组培苗。
[003引 图7为转PtHMAS基因烟草阳性株系PCR电泳检测。其中，M aOObp DNA Ladder ; 1 ;PtHMA5质粒；2-6 ;转基因烟草株系T1-T4 ;7 ;水。
【具体实施方式】
[0033] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0034] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[OOW] 实验材料；毛白杨（Populus tomentosa Carr.)，基因型为TC152,公众可从山东省 冠县苗圃毛白杨基因库获得。
[0036] 烟草（Nicotiana t油acum)在文献"Liu Jie, Xu Xiao, Xu Qian, Wang Shuhui, Xu Jichen. Transgenic tobacco plants expressing PicW gene from Picea wilsonii exhibit enhanced freezing tolerance. Plant Cell, Tissue and Organ Culture(PCTOC) ,2014, 118(3) :391-400."中公开过，公众可从北京林业大学获得。
[0037] 阳ZR(K)-LC 质粒在文献"Eirini Kaiserli, Sl:ua;rt Sullivan, Matthew A.Jones, Kevin A.Feeney and John M.Christie. Domain Swapping to Assess the Mechanistic Basis of Arabidopsis Phototropin IReceptor Kinase Activation and 化docytosis by Blue Li曲t(2009).Ilie Plant Cell.21(10):3226-3244.，，中公开过，公众 可从北京林业大学获得。
[003引 实施例1、毛白杨PtHMAS基因的获得
[0039] 1、領转运相关HMA基因的筛选
[0040] 本研究W TC152基因型的毛白杨作为实验材料，将其幼苗分别置于氯化領浓度为 0mg/L、50mg/L和lOOmg/L的1/2化agland营养液中处理1天，分别提取叶片、茎和根的RNA, 逆转录成cDNA。
[0041] 分别W上述获得的領处理的毛白杨的叶片、茎和根的cDNA样本为模板，采用 Pt2-F和Pt2-R引物进行PCR扩增，获得一个长度600bp左右的基因片段，该片段只在茎、根 中表达，叶中不表达，且茎中表达量明显高于根（图1)，推测与領的转运有关。引物序列如 下：
[0042] Pt2-F ;5, -WCCNAC服CWGTVMTGGTTG-3,；
[0043] Pt2-R ; 5，-YCBWDYTRTCMCCWGWSAMCATG-3，。
[0044] 回收PCR扩增的特异片段，克隆到祀ASY-Blunt载体上，转化大肠杆菌得到阳性克 隆，并对阳性克隆进行测序。
[0045] 2、PtHMA5基因全序列克隆及序列分析
[0046] W領处理的毛白杨茎、根的cDNA为模板，采用PtHMAF和PtHMAR进行扩增，获得 3000bp左右的特异条带（图2)。引物序列如下：
[0047] PtHMAF ;5, -CTTTATTTCATGGCAACCAAATTCTTG-3,；
[0048] PtHMAR ; 5，-GTAATTATTGATCACTCGATCATTATTC-3，。
[0049] 对该片段回收、克隆，测序显示包含完整的基因结构，全长cDNA大小为2964bp (女口 序列表中序列1所示），可编码一个987个氨基酸的肤链（如序列表中序列2所示）。蛋 白相对分子量107kD，等电点（pi)为6. 5,包含全部20种氨基酸，含量较高的氨基酸有 Ala化 20% )、Ile(8.90% )、Val(8.70% )、Ser(8.30% )、Leu(8.20% )等，含量较少的包 括切s(1.00% )、Trp(1.00% )、His(l. 10% )等。
[0050] 由化yre2在线服务软件预测PtHMA5蛋白的二级结构，其a螺旋所占比例为 49%，目折叠所占比例为17%。利用在线蛋白H维结构模拟软件预测，得到PtHMA5蛋白高 级结构（图3)，可W看出，PtHMA5蛋白是由N端的重金属离子结合域、多个a跨膜螺旋组 成的跨膜结合域W及包含ATP结合位点、磯酸化位点的亲水结构域H部分组成。
[0051] 实施例2、转PtHMAS基因烟草的获得及領含量的检测
[0052] 1、植物表达载体构建
[005引 W实施例1中得到的阳性克隆质粒为模板，采用Ptl-F和Ptl-R引物PCR扩增获 得PtHMA5基因的开放阅读框全序列。引物序列如下（下划线为酶切位点）：
[0054] Ptl-F ;5> -CGCGTCGACATGGCAACCAAATTCTTGGC-3^ ；
[00巧]Ptl-R ;5, -CGCCCTAGGTCACTCGATCATTATTCC-3'。
[0056] 利用限制性内切酶Sal I /甜a I分别双酶切扩增片段和阳ZR化)-LC表达载体， 回收后连接，得到重组质粒阳ZR化)-LC-PtHMA5(图4)。对重组质粒阳ZR化)-LC-PtHMA5 进行测序验证，结果表明；在阳ZR化)-LC表达载体的Sal I和甜a I酶切位点间插入的 PtHMAS基因序列如序列表中序列1所示，表明载体正确。PtHMAS基因编码的蛋白的氨基酸 序列如序列表中序列2所示。利用电击转化技术将重组质粒导入农杆菌中，利用PCR及双 酶切检测，鉴定阳性的重组菌株（图5)。
[0057] 2、转PtHMAS基因烟草的获得
[0058] 挑取含有重组质粒阳ZR化)-LC-PtHMA5的农杆菌单菌落，接种于含利福平 巧i f，50mg/L)和卡那霉素化an, 50mg/L)的LB液体培养基中，28 °C摇菌36-4她。吸取 适量菌液于不含抗生素的LB液体培养基中，摇菌3-1化至菌液ODe。。= 0. 4。选取烟草 (Nicotiana t油acum)无菌苗幼嫩叶片剪2-3刀，放入菌液中浸泡lOmin。将侵染过的叶片 接种到芽分化培养基（MS+2mg/L 6-BA+0. Img/L NAA+3%藏糖+0.8%琼脂）上，28C暗培养 2d后，把叶片转移到筛选分化培养基（MS+2mg/L 6-BA+0. Img/L NAA巧Omg/L Kan+200mg/L Cef+3%藏糖+0.8%琼脂）上，约20-40d分化出抗性芽。待不定芽达到l-2cm时，转接到 (MS+0. Img/L NAA巧Omg/L Kan+200mg/L Cef+3%藏糖+0. 8%琼脂）生根培养基上，7-15d 后长出不定根（图6)。
[0059] 提取再生烟草苗的RNA，逆转录成cDNA。利用PtHMAS基因的特异引物PtHMAF/ PtHMAR进行PCR扩增，发现有4个株系已成功导入并表达PtHMAS基因（图7)，即得到转 PtHMAS基因烟草。
[0060] 3、转PtHMAS基因烟草領含量的测量
[0061] 对转PtHMAS基因株系及野生株系进行无性扩繁，待幼苗长到3-4片叶，开瓶炼苗 2天，移植于含幢石的培养鉢中（直径10cm，高8. 5cm)。培养箱中恢复生长2周后，选大小 相近（每株约10个叶片）、长势一致的转PtHMAS基因烟草及野生型各H盆，一次性施加 50ml領溶液巧Omg/L)处理，10天后分别收集植株地上部分、地下部分样本杀青、烘干。利 用DigiBlock消解仪消解植物组织，利用7500a ICP-MS仪器（Agilent Technologies)进 行領含量的测定，利用AN0VA软件进行数据的方差分析。
[0062] 结果表明；不同株系地下部分領含量差异不大，而转PtHMAS基因株系地上部分的 領含量显著高于野生型。其中，T2株系地上部分領含量最高，达到114. 3mg/kg，而野生型株 系仅为81. 9mg/kg，提高了 1.4倍。比较不同株系的转运系数（地上部分/地下部分），转 基因株系的領转运系数显著高于野生型，平均提高达28%，其中T2株系提高了 42. 3% (表 1)。由此可见，PtHMAS基因能显著提高重金属領由地下部分向地上部分转运的能力。
[006引表1、转PtHMAS基因烟草化?T4)与野生型（CK)的領含量
[0064]
【权利要求】
1. 蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质： a) 由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； b) 将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且与植物重金属转运能力相关的蛋白质。
2. 与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B6)中的任一种： B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子； B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒； B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体； B4)含有B1)所述核酸分子的重组质粒、或含有B2)所述表达盒的重组质粒； B5)含有B1)所述核酸分子的重组菌、或含有B2)所述表达盒的重组菌、或含有B3)所 述重组载体的重组菌； B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物 细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系。
3. 根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子的核苷酸序列 如序列表中序列1的DNA分子所示。
4. 权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述相关生物材料在提高植物重金属转 运能力中的应用。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述重金属具体为镉。
6. -种构建转基因植物的方法，包括如下步骤：使权利要求1所述蛋白质在出发植物 中过表达，进而使植物的重金属转运能力提高。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述使权利要求1所述蛋白质在出发植 物中过表达的方法为：向出发植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因，得到转基因 植物；转基因植物与出发植物相比，重金属转运能力提高。
8. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因如序列表中 序列1的DNA分子所不。
9. 根据权利要求6-8所述的方法，其特征在于：所述重金属具体为镉。
10. 根据权利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于：所述出发植物为单子叶植物或 双子叶植物；所述双子叶植物具体为烟草。
【文档编号】C07K14/415GK104447971SQ201410697116
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月26日 优先权日:2014年11月26日
【发明者】徐吉臣, 王晓桐, 陈永坤, 徐筱 申请人:北京林业大学