专利名称：由母体血液中分离胎儿细胞的方法来实现产前诊断的制作方法
技术领域：
本发明涉及从妊娠哺乳动物血液中分离滋养层(胎盘)细胞的方法，以提供重要的起始材料即源于胎儿的细胞，以使获得胎儿的遗传和/或生物化学信息，更具体地，本发明涉及利用对哺乳动物滋养层上的膜蛋白标志特异的单克隆抗体从母体血液中分离出滋养层细胞。这些细胞然后可被用于获得妊娠初期胎儿的遗传和/或生物化学信息。本发明与检测人胎儿的异常特别有关。
目前，产前检查是用羊膜穿刺术或绒毛膜绒毛采样(CVS)得到的胎儿细胞实现的。羊膜穿刺一般在妊娠16周左右进行，该方法是由技术熟练人员把注射针刺入胎儿的羊膜囊内抽取20-30毫升的羊水，羊水中含有胎儿细胞，使以后的检查能实现。这种获取胎儿细胞的方法伴随着引起自发性流产的危险，此外，如果随后进行的胎儿的遗传诊断揭示出异常胎儿，中期三个月要进行妊娠中止既对母亲带来心理上的压力又伴随着某些生理上的危险。
绒毛膜绒毛采样也要求由技术熟练人员从妊娠8-12周胎儿的胎盘上取下一小块活组织，尽管任何染色体异常的早期诊断使得该方法比羊膜穿刺术更具有吸引力，但是这种方法也有可能造成自发性流产的危险。然而，需要技术熟练人员和这两种方法会造成自发性流产的可能性都表明现行的产前遗传评价法只能对被认为是可能怀有染色体缺陷的胎儿的妊娠妇女进行。
本发明的方法提供一种更为简单的方法，它包括从妊娠哺乳动物如孕妇的手臂静脉上抽取血液并提取胎儿细胞，这些细胞通常是从胎盘脱落到母体的循环血液中。获得这种血样不需要专门的专家，而且胎儿细胞的这种非侵入性的分离方法不存在引起自发性流产的危险。血液可以在与绒毛膜绒毛采样相同的妊娠时间被采取，因此，得到了早期诊断的好处。
虽然在母体外周血液中存在着滋养层细胞一直是一些争论的主题，如Goodfellow和Taylor(1982)已经报导了利用差示离心法提取在妊娠期外周血液中循环的滋养层细胞。Covone等人(1984)研究了用单克隆抗体H315(Johnson等，1981)从不同妊娠阶段孕妇的外周血液中探测滋养层细胞的可能性，然而，在以后的报导中(Pool等人，1987，Adinolfi等，1989)提出分离H315阳性细胞作为胎儿异常的出生前诊断的一种诊断材料来源是不现实的。最近的资料提出，在母体循环中的胎儿细胞的出现率(妊娠12-36周)低于十万分之一(Adinolfi等，1989，Schwinger等，1989)。
按照本发明的一个方面，提供了一种从妊娠母体的血样中分离滋养层细胞的方法，该方法包括使所说的血液与一有效结合量的绒毛合胞体滋养层和非绒毛细胞滋养层细胞的特异抗体接触一定的时间。所说的接触是在足以使所说的抗体结合到靶细胞上的条件下进行的，然后从所说的血样中分离由所说的抗体结合了的所说的细胞。
本发明的另一个方面是针对一种用于在妊娠哺乳动物中获得胎儿遗传和/或生物化学信息的方法，该方法包括从所说的妊娠哺乳动物体分离出一个血样，并使所说血样与一个结合有效量的绒毛合胞体滋养层和非绒毛细胞滋养层细胞特异抗体在足以使所说的抗体结合到所说的细胞上的条件下接触一段时间，然后从所说的血样中分离由所说抗体结合了的细胞，然后从该分离的细胞获得遗传和/或生物化学信息。
本发明的另一个方面涉及用于妊娠哺乳动物的血样中分离滋养层细胞的试剂盒，以及也可以是用于获取所说细胞的遗传和/或生物化学信息的试剂盒，它包括隔室形式的第一容器，该容器适合于容纳一种绒毛合胞体滋养层和非绒毛细胞滋养层细胞的特异抗体;一个可附加选择的第二容器，它适合于接收和放置来自所说的妊娠哺乳动物的血样;和一个可附加选择的第三个容器，它适合于容纳用于从被分离的细胞中获取遗传和/或生物化学信息的装置。
在本发明的一个最佳实施例中，哺乳动物是怀孕的妇女，并且使用抗体FDO161G或FDO66Q或FDO338P中的一个或几个。
本发明还有一个方面是涉及这种均匀的或接近均匀的抗原，FDO161G或FDO66Q蛋白质和FDO338P蛋白质，或者它们的衍生物。
本发明参照
图1进一步说明，该图是从妊娠妇女的外周血液中分离出来的滋养层细胞的PCR产品分析的照片。分析是在15%(W/V)聚丙烯酰胺凝胶中进行的。图中痕迹1和8DNA分子大小标志(pUC19/HpaⅡ消化物;从头到尾为501、489、404、331、242、190、147、111、110、67、34bp);痕迹2和3从怀有男孩的两个不同妇女血液中分离出来的滋养层细胞;痕迹4和5从怀有女孩的两个不同妇女血液中分离出来的滋养层细胞;痕迹6没有DNA的空白;痕迹7从男孩的足月胎盘中获得的对照滋养层细胞。
本发明是针对从妊娠哺乳动物的血样中分离滋养层(胎盘)细胞的方法，这样分离出的滋养层细胞是遗传和/或生物化学物质的一个方便的来源，从该物质来源可以对诸如潜在的胎儿异常等进行胎儿分析。滋养层细胞的分离是基于使用绒毛合胞体滋养层和非绒毛细胞滋养层细胞的特异抗体，特别是单克隆抗体，尽管并不限于此。因此，本发明的一个方面提供了一种从妊娠哺乳动物的血样中分离滋养层细胞的方法，该方法包括使所说血样与结合有效量的绒毛合胞体滋养层和非绒毛细胞滋养层细胞的特异抗体在足以使所说的抗体结合到细胞上的条件下接触一段时间，然后分离由所说的抗体结合了的细胞。
只是为了举例说明的目的。本发明是用来自妊娠妇女的血液分离人的胎盘细胞来描述的。然而，不难理解，本发明可以推广到所有的哺乳动物，但在推广到人以外的哺乳动物中的时候，必须改变滋养层结合抗体的特异性。因此，除了对人的绒毛合胞体滋养层和非绒毛细胞滋养层细胞特异的抗体外，本发明扩展到所有这样的一些抗体。
在说明书和权利要求书中所用的术语“一个结合有效量的抗体”意指足以结合到靶细胞上去用以分离这样一些细胞的抗体的量，本发明的一个最佳实施例是抗体被耦合到一种基质上，诸如预先涂有抗鼠IgG(Fc片段)血清的磁性聚苯乙烯的小珠上(Dynabeads M-450，Dynal AS，Oslo，Norway)。然而，其它的基质也可使用，诸如荧光药品。血样与一有效量的珠接触，即每毫升全血大约2000-10000个珠，最好是4000个珠/毫升(亦即约每25毫升血样105个珠)，并在4℃温度下保温过夜，通过对滋养层有活性的特异抗体而连接有滋养层细胞的小珠用钴-钐磁铁(Dynal AS)取出。这些方法就性能和/或方法而论代表了一个最佳方案，但可以经受各种变化以适合于特定的情况。但这些仍在考虑了所有这些变化的本发明范围之内。
因此，本发明涉及用于从孕妇血样分离滋养层细胞的方法，该方法包括使该血样与绒毛合胞体滋养层和非绒毛细胞滋养层细胞的特异抗体接触，然后从所说的血样中分离由所说抗体结合了的细胞。
从哺乳动物血样中如此分离出的胎儿滋养层细胞，就可以用已知的诊断技术来评估他们的遗传和/或生物化学特征。
无论是单克隆或多克隆抗体或它们的组合都可以用于从血样中分离滋养层细胞的步骤中，然而最好使用单克隆抗体。
在本发明特别推荐的实施例中，已使用了三种抗体来分离滋养层细胞，它们被称为FDO161G(Muellex等人，1987)，FDO66Q和EDO338P。
这些抗体的每一种都是由在组织培养中无限生长的并能在液氮中冷冻储藏的各个杂交瘤细胞系分泌的小鼠单克隆抗体，在此将给出这些单克隆抗体和生产它们的详细细节。这三种单克隆抗体的每一种具有重链亚类G和轻链Kappa，其它单克隆抗体的来源均由本发明所包括。
单克隆抗体FDO161G和FDO66Q对滋养层膜蛋白相同的或密切相关的抗原决定基(以后称为“FDO161G/FDO66Q蛋白或抗原)具有明显的特异性，该抗原决定基存在于人的前三个月和足月的胎盘的绒毛合胞体滋养层和非绒毛细胞滋养层细胞上和侵入人的蜕膜内的非绒毛细胞滋养层细胞上。
无论用FDO161G抗体还是FDO66Q抗体，还没有在绒毛细胞滋养层细胞上检测到该蛋白，它在有限数目的人的其他组织上被检测，这些组织是成熟的卵巢卵泡的膜和粒膜细胞、睾丸间质细胞、肾上腺皮质的带束/小球细胞，但它不能在广泛范围的人的其他组织和细胞上被检测，包括外周血液细胞和绒毛间质。这些结果已列在表1和表2中，然而由FDO161G抗体识别的膜蛋白抗原决定基(以及由FDO66Q识别的同样的或极有关的抗原决定基)在狒狒和狨的胎盘上被检测到。它也存在于经过培养的人的前三个月的滋养层细胞和人的绒毛膜癌系JEG-3上。
表1单克隆抗体对人体组织的反应活性Mab克隆FDO161GFDO338P(FDO66Q)(FDO78/93P)组织6-12周胎盘++++++足月胎盘++++蜕膜--子宫内膜(增殖的)--子宫肌层--卵巢 +1-睾丸 +2-肾--肝--脾--肝--肺--肾上腺 +3-
胰--皮肤--纹状肌--甲状腺--垂体--胃--直肠--结肠--注1.与在成熟的卵泡内的thecal细胞和黄体反应。
2.与间质细胞反应3.与皮质细胞(带束/小球)反应表2单克隆抗体与人体细胞悬浮液的反应活性细胞单核粒性 T-ALL1粒膜白细胞白细胞细胞Mab克隆FDO161G(FDO66Q)---+++FDO338P(FDO78P)--NT-(FDO93P)FDO 81C2+++ +++ +++ +++
注NT未试验1T-急性淋巴性白血病(JM系)2FDO81C与所有细胞起反应，用于阳性对照。
单克隆抗体FDO338P检测到一个存在于人的滋养层膜上的一种蛋白的抗原决定基(“FDO338P蛋白质或抗原)，这种抗原决定基在人的前三个月胎盘和足月胎盘的绒毛合胞体滋养层上被表达。该抗原决定基也存在在人蜕膜的侵入的非绒毛细胞滋养层细胞上，但密度甚低。它不能在人的胎盘的绒毛细胞滋养层细胞上或者在绒毛间质中被检测到，这种由FDO338P抗体识别的膜蛋白抗原决定基在广泛范围的人体其他组织或细胞上检测不到，包括外周血细胞和血清成分。这些结果已列入表1和表2中，虽然由FDO338P所确定的抗原决定基在狒狒和狨的滋养层上未被检测到，但存在一种相关的糖蛋白类似物，这种类似物可以由在本发明人实验室中生产的针对人的FDO338P抗原上的其它抗原决定基的其它单克隆抗体、即FDO78P和FDO93P来鉴别。
由FDO161G或FDO66Q单克隆抗体，和FDO338P或者FDO78P或者FDO93P单克隆抗体所检测到的滋养层膜蛋白的细胞和组织的分布彼此是各不相同的，并且与以前描述的其它滋养层抗原也不相同。
因此，由Johnson等人(1981)所描述的与合胞体滋养层起反应的单克隆抗体也能识别蜕膜腺细胞(H315)或淋巴细胞(H316)。抗体NDOG1(Sunderland等人，1981)与合胞体滋养层和细胞滋养层结合，并识别一种糖类抗原决定基，由Lipinski等人所描述的Trop.1和Trop.2能与合胞体滋养层和绒毛细胞滋养层两者结合，由Loke和Day(1984)描述的单克隆抗体与绒毛细胞滋养层和子宫内膜腺(Anderson等人，1987)结合，单克隆抗体FDO161G、FDO66Q和FDO338P，与提交给1986年举行的世界卫生组织赞助的专题讨论会的抗体的特异性作比较，它们都是有区别的(Anderson等人，1987)。
因此，在本发明的一个最佳实施例中，用于分离滋养层细胞的方法包括用一种对滋养层膜蛋白的抗原决定基特异的抗体，最好是单克隆抗体接触该母体的血样，接着从所说的血样中分离由所说抗体结合了的细胞，最好是三种单克隆抗体中的一个，即抗体FDO161G和FDO66Q，它们与位于绒毛合胞体滋养层和非绒毛细胞滋养层细胞上的膜蛋白抗原决定基结合，而抗体FDO338P与位于绒毛合胞体滋养层上的一个不同的膜蛋白抗原的抗原决定基结合，并以更低的程度与非绒毛细胞滋养层细胞上的一种不同的膜蛋白抗原的抗原决定基结合。因此，在发明人的实施室里产生的这些抗体是对下面将要说明的两种不同的膜蛋白抗原，FDO161G/FDO66Q蛋白质和FDO338P蛋白质特异的。因此，结合使用多于一种抗体也在本发明的范围内。所以可以使用一种或多种抗体。
用单克隆抗体FDO161G或FDO66Q和FDO338P检测的蛋白抗原已由人的足月胎盘制备，胎盘组织用一种洗涤剂(CHAPS)增溶，以释放各个膜蛋白。FDO161G或FDO66Q或者FDO338抗体共价结合的琼脂糖(Sepharose)珠然后被加入该混合物中，在适当保温后，回收这些小珠，被结合到该单克隆抗体上的各个抗原然后用一个酸溶液从该抗体上被离解。
已经用亲和凝胶色谱法从用洗涤剂增溶的人的足月滋养层膜中分离出FDO161G/FDO66Q蛋白。它在十二烷基硫酸钠聚丙烯酸酰胺凝胶电泳中作为单独一个实体迁移，成为具有分子量为43千道尔顿的二硫苏糖醇还原蛋白。未还原蛋白以相似的分子量迁移，表明该蛋白不是由多肽的亚单位组成。在被培养的滋养层细胞表面上，用免疫化学分析法，而在人的卵巢粒膜细胞中用荧光分析法检测到该蛋白，表明这是一种被糖基化的蛋白质。
用酶和化学裂解相结合的方法确定出链接到FDO161G/FDO66Q蛋白质的多肽主链上的该糖链的性质。用糖苷内切酶F，一种裂解邻近于氨基酸，天冬酰胺的高甘露糖，杂化的和复合聚糖(亦即所有的N-链碳水化合物)，观察不到分子量的减少。这表明FDO161G/FDO66Q蛋白质不含N-链聚糖。使用三氟甲烷磺酸，一种从多肽主链上裂解N-和O-链聚糖的试剂，可以观察到分子量明显减少(从43KDa到31KDa)，这表明FDO161G/FDO66Q蛋白质只含O-链聚糖(即链接到丝氨酸或者链接到苏氨酸)。因为寡聚糖的每个链引起2000-4000道尔顿的分子量差。可以估计，FDO161G/FDO66Q蛋白质每个分子有3-6个寡聚糖链。
这种蛋白质抗原的氨基酸定序是用标准方法对该分子的N-末端和一个内部的链段这两者进行的，后者是用在磷酸缓冲剂中的蛋白酶V8(得自金黄色葡萄球菌V8)蛋白分解(消化)后得到的，这种丝氨酸蛋白酶在这些条件下在Glu(谷氨酸)的羰基部位和ASP(天冬氨酸)残基上裂解。氨基酸序列是用自动气相序列分析仪和传统的Edman降解化学来确定的，获得了下列序列FDO161G/FDO66Q蛋白质N端序列Thr〔1〕-Gly-Trp-Ser-His-Leu-Val-Thr-Gly-Ala〔10〕-Gly-Gly-Phe-Leu-Gly-Gln-(Arg)-Ile-(Ile)-(Arg)〔20〕-Leu-(Leu)-Val-Lys-(Lys)〔25〕从FDO161G/FDO66Q蛋白质的蛋白酶V8消化获得的内部序列-Phe〔1〕-(X)-Leu-Arg-Leu-Glu-Ser-Arg-(X)-Ser〔10〕-Phe-Pro-Leu-(Ser)-(X)-Met-Tyr-(X)-Ile〔19〕。
除了圆括号中(以后称为Y)的以外，排布被认为是清楚的。标志(X)的排布表示没有氨基酸被释放，并且可能是O-链的糖基化部位(即氨基酸或者是Ser，或者是Thr)。
上述两个序列已经与以下的数据基准作了比较NBRF标准数据基准;NBRF辅助数据基准、京都数据基准;瑞士数据基准;Newat数据基准(总共4525个序列-1，116，976个氨基酸残基)。相关系数定在0.75。这些数据基准中只有两个蛋白质超出这个水平，即对于N-端序列是PaperWasp(PolistesJadwigae)，对内部的用蛋白酶V8消化的片段是小鼠的α-2u-球蛋白前体。由于相关系数仅分别为0.764(超过14个氨基酸)和0.779(超过9个氨基酸)，可得出结论，由FDO161G或FDO66Q单克隆抗体所确定的蛋白质以前还没有被定序过。
在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，用亲和色谱法(如前所述)制备的FDO338P抗原以一系列分子量范围从30KDa到最大值67KDa的实体迁移。相同的谱带在还原或非还原条件下都可以看到，表明该蛋白不具有或者在内的或者内链的二硫化物键。两个最大的和最丰富的种类，即63和67KDa带已经用电洗脱法从SDS聚丙烯酰胺凝胶中分离出来，成为表观均匀物质。从FDO 338P凝胶洗脱的蛋白质被表明含有糖类残基。该糖类用三氟甲烷磺酸去除，引起该蛋白质的分子量降到30KDa。假定每个寡聚糖链对SDS-PAGE凝胶上的表观分子量的贡献在2000-4000Da之间，估计FDO 338P糖蛋白具有8-16个寡聚糖链。链接到多肽链的寡聚糖的性质是用糖苷内切酶F和H进行研究的。糖苷内切酶F裂解复合的和高的甘露糖N-链接的(即天冬酰胺残基)，但不是O-链接(即丝氨酸/苏氨酸残基)的寡聚糖。用这种酶的裂解把两个主要带的分子量从63和67KDa分别降到43和48KDa。糖苷内切酶H只裂解高甘露糖型的N-链接的寡聚糖。用这种酶处理之后，看不到分子量的减少，表明不存在高甘露糖链。因此，FDO 338P糖蛋白似乎具有3-6之间的O-链接的寡聚糖链和5-10复合的N-链接的寡聚糖链。
因此，本发明延伸到均匀的或接近均匀的FDO161G/FDO66Q蛋白质和FDO338P蛋白质和/或它们的衍生物。衍生物意指对氨基酸和/或糖类序列或者所说的蛋白质的成份的任何变换，诸如增加、删去和/或替代，并延伸到与不同分子有关的蛋白质和它的组成部份(例如脂类，其它蛋白质等等)。所有这些蛋白质和用于它们的抗体、单克隆或多克隆都为本发明所包括。术语“均匀或接近均匀”意指相对于其它蛋白质至少是70%纯的制剂，最好是80-90%纯。
本发明的用于在血样中分离胎儿滋养层细胞的步骤包括，例如用鼠的单克隆抗体FDO 161G或者FDO 66Q或者FDO 338P偶联到一种基质、如磁性小球上。商售的并已发现是有效的这样一种基质由一些均匀的磁性聚苯乙烯小珠组成，小珠的表面共价结合了亲和法提纯的绵羊的抗鼠IgG。每个单克隆抗体(MAb)由一个单独的杂交细胞系分泌，所说的细胞系是由融合了产生抗体的鼠脾脏细胞的鼠骨髓瘤细胞(P3×63-Ag8-653)产生的，使每个感兴趣的杂交细胞系保存不灭。在培养物中生长后，每个细胞系分别把MAb分泌到培养介质中，它们可以被收集并作为抗体的一个来源。这种培养物的上层清液利用在示例2所描述的方法被用于涂到磁性小珠上，为了从孕妇的血液中提取滋养层细胞，使用MAb FDO 161G、FDO66Q或FDO 338P、以使它们特异地结合到母体血液中的滋养层细胞上，而不与任何其它的循环血液细胞结合。由此，MAb特异地连接到如前所述的由每个MAb所确定的携有滋养层膜蛋白的细胞和/或细胞碎片上。然后，可以用磁铁从血液细胞悬浮物中提取出连接有滋养层细胞的小珠，在另一种分离方法中，MAb可以用一种荧光标记做记号，而由荧光标记的MAb结合了的滋养层细胞在一个荧光激活细胞分选仪中从该血样中被鉴别和取出。
无论用哪种方法分离的滋养层细胞都可以被检查，以获取遗传的和/或生物化学的信息。许多已知技术都可以用于获得遗传信息，特别是用于确定胎儿性别和遗传异常。一种这样的技术包括使用核酸片段作为探针或引物。
核酸探针可以被杂交到被分离的滋养层细胞的核酸中。这种方法是基于在脱氧核糖核酸(DNA)的双螺旋中的两个互补的链可以通过变性作用被分离，然后在有利于碱基对的氢键键合的条件下再退火(杂化)。因此，如果正确的互补核酸序列出现在被分离的滋养层细胞的核酸链上，就引起该核酸探针的杂化，就能测量到一个适当的信号。由于胎儿滋养层细胞的数目很少，所以希望一个放大该信号的技术。例如通过使用DNA引物，可以利用聚合酶链反应，在这种方法中，由DNA引物瞄准的特定核酸序列通过一种酶、Taq聚合酶被多次复制。这就能够用在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上的电泳法检测被放大了的产品。在用溴化3.8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓染色之后用紫外光可以对该DNA进行目视观察，或者通过由放射性同位素示踪标记的核苷酸而来的放射性同位素示踪产品的探测来实现对其目视观察。此外，分离的滋养层细胞可以用于生物化学分析。
为了说明使用单克隆抗体FDO161G或FDO66Q或FDO338P和磁性聚苯乙烯小珠从血液中分离的滋养层细胞的实用性，已使用聚合酶链反应(PCR)来区别雄性或雌性来源的细胞。为了确定探测的灵敏度。采用了外周血液淋巴细胞。使用Y染色体特异引物，在PCR和30个放大周期之后，由少至6个雄性淋巴细胞已经可以复现地获得一个信号。通过用同样的方法的相等数目的雌性细胞或者没有产生可探测的放大了的产品(更为通常)，或者产生少量的很易于区别于雄性细胞产品的略微更小尺寸的产品。
为了探测胎儿遗传异常，从大概要经受绒毛膜绒毛活检的孕妇取得血样(约25毫升)，如上所述，用涂有MabFDO161G或FDO338P的磁性小珠从所取的血样分离出胎儿滋养层细胞，附着到小珠上的被分离的细胞用Y染色体特异引物通过PCR处理，就能预测胎儿性别，在被处理的十一个试样中，在一个不相关的实验室里独立地进行的绒毛膜绒毛样品的常规染色体分析证实了这十一例的预测(P＜0.0005)。该结果说明这个方法的实用性。因而证实1.确实两种独立的人的滋养层膜蛋白的抗体FDO161G或FDO66Q或FDO338P能被用于分离胎儿细胞。
2.被分离的细胞是来源于胎儿的，因为雄性细胞在七个情况下被鉴别。
3.被分离的细胞随后可以用适当的探针进行探测遗传标记的过程。
本发明的另一个方面是在培养该分离的细胞之后用染色体检查法探测遗传异常和/或胎儿性别。例如，这将能探测通常的遗传失调，Down氏综合症，对于这种综合症，似乎不大可能在不久的将来有可供利用的遗传探针。
用磁性小珠技术分离的细胞可以放在塑料培养器皿内，并通过加入由其他培养细胞获得的生长因子引起分裂。最佳的细胞培养物是取自选择中止妊娠妇女的蜕膜细胞和为试管授精收集卵过程中获得的人的粒膜细胞，从这些细胞培养物得到的没有细胞的上清液以适当的浓度加到被分离的滋养层细胞悬浮液中。可以在适当的时间通过加入已知的试剂、如秋水仙碱来抑制细胞的分裂，然后用标准的细胞遗传诊断技术来分析染色体。
本发明也延伸到用于从妊娠哺乳动物的血样中分离滋养层细胞、和附加地用于获得关于所说细胞的遗传和/或生物化学信息的试剂盒(Kit)，它包括隔室形式的第一容器，适合于安放对绒毛合胞滋养层和非绒毛细胞滋养层细胞特异的抗体;可附加有的第二容器，适用于接收和盛放来自所说妊娠哺乳动物的血样，和可附加有的第三容器，适合于容纳用于由分离的滋养层细胞获得遗传和/或生物化学信息的装置。
第一个容器内的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体或者它们的组合，而最好是FDO161G或者FDO66Q或FDO338P和/或它们的组合。诸如前面讲到过的先被结合到磁性聚苯乙烯小珠这样的基质上的单克隆抗体是一个最佳实施例。
下面的例子详细说明本发明用于人的滋养层膜蛋白的单克隆抗体的生产和这些抗体的使用，以说明本发明的效用。用于这个说明中的方法是示例性的，而不是对本发明的限制，应当理解，在本发明的范围之内，可能作出各种不同的改进。
例1单克隆抗体的生产a.合胞体滋养层的制备前三个月的胎盘是从选择中止妊娠的明显健康孕妇得到的，在怀孕6至10周时通过抽吸得到的，仔细地将凝集的血液和任何附着的蜕膜从胎盘上分开，合胞体滋养层通过在一个250目的筛子上轻轻地梳理胎盘被分离，这些合胞体滋养层片显然比污染的细胞要大，很容易在单位重力下在Earle氏平衡盐溶液(FlowLaboratories，Sydney，Australia)中沉积，沉积约2分钟，轻轻倒出上层清液，这些细胞被再悬浮在新鲜的溶液中，这种清洗程序要进行三次，然后细胞或者用于小鼠免疫，或者放入培养液内。滋养层的成功分离是在三天保温后在培养液中用合成的人的绒毛膜促性腺激素证实的。人绒毛膜促性腺激素的浓度是用固相的两位免疫放射测定法测量(Hybritech，California，USA)。
用0.5毫升的滋养层细胞悬浮液以腹膜注射方式对Balb/C小鼠进行免疫。免疫原是在首次注射后停滞三周后的六周内以一周的间隔给药的。
b.绒毛膜癌细胞悬浮液的制备绒毛膜瘤细胞系JEG-3是从美国典型培养物收藏中心(ATCC)提供。细胞在37℃温度下、在空气含5% CO2的湿润气氛下、在6井器皿中、在补充有10%(V/V)热失活的牛胎血清，L-谷氨酰胺(2mM)，青霉素(100国际单位/毫升)和链霉素(100微克/毫升)的RPMI-1640中培养。当这些培养物被汇集在一起时，细胞从2个井中被挖出，再悬浮在0.5毫升不添加的RPMI-1640中，并进行腹膜内注射。这种免疫原以一周的间隔通过腹膜内注射进入Bal b/c小鼠，持续六周。
C.麦胚外源凝集素洗脱液的制备麦胚外源凝集素洗脱液是用前三个月的胎盘制备的，胎盘膜蛋白是通过以1∶10(W/V)的比例加入在20mMTris-HCl、具有0.02%(W/V)叠氮化钠的pH8.0的缓冲液，5mM乙二胺四乙酸(EDTA)和1mM苯基甲磺酰氟(PMSF)中的8mM3-〔(胆酰胺丙基)二甲胺〕1-丙基磺酸酯(3-〔cholamidopropyl)dimethylammonio〕1-propanesulphonate)(CHAPS)溶液被增溶。在4℃下搅拌17小时后，以2000g离心15分钟去除不溶性物质。用增溶了的胎盘制剂(约30毫升)在搅拌17小时下，分批地培养共价方式结合到琼脂糖小珠(约1毫升的充填小珠)上的麦胚外源凝集素。然后在200g下离心5分钟回收小珠，并转移到一个柱上，以便用三倍体积的在均匀化缓冲剂中的200mMN-乙酰氨基葡萄糖清洗。对于Balb/c小鼠的最初免疫，提取物用Freund氏完全佐剂(1∶1，V/V)乳化。1/2毫升的乳化液被皮下注射到Balb/c小鼠的几个部位上，最初免疫后三周，三次每周单独0.5毫升提取液的加强免疫通过腹内注射给药。
d.免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤的融合在融合处理的前5天，向鼠腹内注射0.5毫升的Freund氏不完全佐剂，在接下来那天，施用最后一次辅助剂，免疫小鼠的脾细胞用小鼠骨髓瘤P3×63.Ag8.653细胞融合，融合的细胞混合物最初以脾细胞浓度2×107细胞·毫升被分配到24井的培养器皿内，并使其能在有RPMI1640(Flow Laboratories)的情况下在空气含5%CO2的湿润气氛中、在37℃温度下生长约10天，该介质包含了10%(V/V)热失活的牛胎血清(Flow Laboratories)，1×10-7氨基碟呤、1.6×10-5M胸苷，2mM L-谷氨酰胺，100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素。取出每个杂交克降的少量细胞，并转移到另外的24井培养皿的各个井中。为了使分离克隆分泌识别糖类抗原决定基的Mab的概率最小并促进在免疫亲和凝胶中使用对滋养层有反应活性的Mab的可能性，IgG分泌克隆用一种抗原俘获ELIST技术来识别。简要地说，ELISA培养皿用抗鼠Ig和由所加的每个杂交克隆得到的培养物上清液涂覆。在适当的培养时间和清洗之后，结合了第二抗体的IgG类特异酶被加入，并用适当的酶基质发展。所有IgM分泌克隆被废弃，含IgG或A的培养物上清液用一种免疫过氧化酶技术(见下)在前三个月胎盘的冷冻切片上筛选抗体结合活性。感兴趣的培养物然后用限制稀释法被克隆二次，并在培养物中进一步扩大。
e.用冷冻切片的免疫过氧化酶染色确定单克隆抗体的组织特异性用一个美国光学低温箱(AmericanOpticalCryostat)在-20℃下切割冷冻组织的切片。5微米厚的切片在涂有铬-铝明胶的玻璃片上空气干燥2小时，这些组织切片用含抗体的细胞培养物的上清液在室温下保温1-2小时或者在4℃下保温过夜。被结合的抗体通过用生物素标记了的马的抗小鼠IgG抗体、接着由抗生物素-生物素化的过氧化酶复合物(VectorLaboratories，Burlingame，CA)揭示。在20mM咪唑缓冲溶液中(pH7.0)的具有0.01%过氧化氢的二氨基联苯胺(DAB)是该酶的基质。切片是用Mayer氏的苏木精明矾(Haemalum)复染色。然后用Depex将盖片固定到空气干燥的切片上。
对于包含相当数量内源生物素的组织，如肝和肾，使用一种间接的免疫过氧化酶技术。一种标记了山羊抗鼠IgG的过氧化酶的适当稀释液减少了用抗生物素一过氧化酶复合技术时发现的高的背景染色。
人的组织是如下获得的前三个月的胎盘和蜕膜是从选择终止妊娠妇女得到的，在分娩一小时内的足月胎盘，而子宫内膜、子宫肌层、卵巢、子宫颈、胃、结肠和直肠是在外科手术时得到，其余的是在死亡6小时内得到的。这些组织在液氮中冷冻，然后在-70℃下贮存，不多于2个月。
在发明人实验室中产生的单克隆抗体(FDO114G)，它与Ⅳ型胶原反应，在所有组织上起阳性对照的作用。
f.单克隆抗体对人的滋养层膜蛋白的选择性本发明中所述的单克隆抗体是按下列标准为基础选择的1.它们属于IgG类2.分泌各种抗体的细胞系是稳定的，并在培养液中快速生长、连续分泌有关的Mab，细胞系可以在液氮中冷冻贮存，且能从冰冻状态回复。
3.单克隆抗体是与整个怀孕过程中的人胎盘上的合胞体滋养层和非绒毛细胞滋养层强烈地起反应的，但不与胎盘的间质细胞起反应。FDO161G和FDO66Q与人的其它组织具有非常有限的反应活性，FDO338P不与任何大块的其它试验人组织起反应。也不与人的外周血液细胞或血清成分起反应。
4.这些单克隆抗体确定的蛋白抗原，即FDO161G/FDO66Q蛋白质和FDO338P蛋白质，是糖蛋白，因此，其抗原决定基很可能是在滋养层细胞的表面膜上被表达。
应用这些直观的标准意味着所选的Mab具有提取以极低的出现率在妊娠母体血液中循环的滋养层细胞的最佳能力。
例2滋养层细胞从母体血样中的分离和证实a.偶联了抗体的基质的制备每种Mab的来源是标准条件下(补充有10%(V/V)热失活牛胎血清，2毫升L-谷氨酰胺，100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的RPMI 1640介质，在空气含5%CO2的湿润气氛下，温度为37℃)培养的各个细胞系的无细胞的培养物上清液。上清液是从井生长的培养物收集的，用离心法去除细胞并贮存冷冻在-20℃下。
所使用的基质是用商业上可得到的配制品，预先用绵羊的抗鼠IgG(Fc碎片)血清涂在表面的磁性聚苯乙烯小珠(DynabeadsM-450，DynalAS，OSlo，Norway)。
1毫升灭菌的上清液与2千万个小珠混合，并于室温下在混合器上自一端到另一端地转动试管。然后，涂复了的小珠在4℃条件下贮存。使用之前，小珠在含1%(V/V)热失活牛胎血清的磷酸盐缓冲的盐水中清洗3次(每次清洗2分钟)。每次用钴-钐磁铁从清洗溶液中收集小珠，试管静放在磁铁上几分钟，使小珠能沉积在试管放在磁铁上的内表面上。倒掉清洗液，小珠最终被重新悬浮在含L-谷氨酰胺(2mM)的冰冷RPMI 1640培养介质中，使得达到大约2.5×105珠/毫升。
b.滋养层细胞从血样中的分离从孕妇的肘前静脉抽取25毫升的血样进入含每毫升全血10个国际单位锂肝素的注射器中，该血液用含2mM的L-谷氨酰胺、青霉素(100国际单位/毫升)、链霉素(100微克/毫升)和肝素(10国际单位/毫升)的冰冷RPMI1640介质稀释10倍，轻轻地搅拌。并在小珠如前所述正被清洗时被保持在4℃的温度下。稀释的血液和洗涤过的小珠轻轻地被搅拌(4000个珠/毫升全血，即每25毫升血样105个)并在4℃条件下保温过夜。这些通过对滋养层反应的特异抗体而附着了滋养层细胞的小珠用钴-钐磁铁(DynalAS)取出。大量的这种混合物可以连续地处理(由通过在磁铁上流动)或者分批处理以取出这些小珠。在分批处理的情况下，含有小珠的介质容积通过接连的提取和清洗，最终被减至0.4毫升。此时，小珠-细胞混合物或者可以作为DNA序列放大用，或者可被放入培养物中。
c.探测含有Y染色体的细胞的方法为了证明由连接有结合到滋养层膜蛋白上的Mab的小珠所分离的细胞真是来源于胎儿的细胞，采用一个Y染色体特异信号用于检测被分离细胞中的Y染色体，由于细胞以很少的数目存在，所以可以应用聚合酶链反应(PCR)。将一对DNA引物用到一个Y染色体的重复序列上，已经获得了雄性特异信号。找出了给出满意特异性和信号强度的这种引物，被命名为WYR7和WYR8。放大了的DNA序列的大小是124碱基对(bp)。这些引物的序列如下WYR75′TGGGCTGGAATGGAAAGGAATGGAAAC3′WYR85′TCCATTCGATTCCATTTTTTTCGAGAA3′已使用的方案如下1.连到磁性小珠上的细胞可等分放入一些含盐水的0.5毫升的Eppendorf试管中，盐水的体积已被减至最小，虽然对于25微升的PCR缓冲液混合物，反应能容忍到盐水高达至少10微升的体积。
2.在盐水中的细胞在一个100℃的水浴槽内加热10分钟被溶胞，该细胞悬浮液用一石蜡油层盖住，且试管在这种处理过程中被盖住。
3.然后加入PCR缓冲液(到25微升)。在反应混合液中各试剂的最终浓度是67mM Tris-HCl(在25℃时pH8.8)，2.0mM MgCl2，0.01%(W/V)明胶，10mM β-巯基乙醇，16.6mM硫酸铵，17微克/毫升牛血清清蛋白，10%的二甲亚矾，0.1mM三磷酸脱氧核苷酸，每种引物0.25微克以及0.2单位的Taq DNA聚合酶(Thermophilns aquaticus)。
4.然后如下进行PCR的30次循环变性步骤94℃1分钟退火步骤55℃1分钟聚合酶扩大步骤72℃1分钟每一轮放大是相同的，所不同的是(ⅰ)第一次变性步骤是6分钟，(ⅱ)最后一个循环的扩大步骤是10分钟。
5.PCR产品是在琼脂糖或聚丙烯酰胺中用标准方法电泳，在该凝胶已用溴化3，8-三氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓染色后在紫外线下进行目视观察。
连接到磁性小珠上的滋养层细胞已用显微镜精确地定量，Y染色体特异信号可以在PCR的30个周期后从只有6个雄性淋巴细胞中可复现地获得。用于相同PCR的等量的雌性细胞不产生出可探测的信号或者产生很容易与雄性细胞产生的信号相区分开来的极其微弱的信号。
图1说明了从一个足月男婴胎盘得到的对照滋养层细胞以及由Mab涂复小珠分离的用CVS(绒毛膜绒毛采样)证实的男、女胎儿细胞得到的信号。发明人的实验室已处理了经受绒毛膜绒毛采样活检的孕妇的十一个血样，在这十一例中，胎儿性别的预测十一例都被证实(P＜0.0005)。
d.分离的胎儿滋养层细胞的培养用小珠连接的滋养层细胞被放入48井的底部有盖片的塑料培养器皿内，并用1∶1∶1的以下培养基的混合物组成的复合培养介质覆盖，这些培养基是(a)由选择早期妊娠中止的妇女获得的人的蜕膜细胞培养物的上清液，(b)人的粒膜细胞培养物的上清液(在试管授精计划中收集卵过程中获得的);(c)含10%(V/V)正常的妇女血清，2mM L-谷氨酰胺，100单位/毫升青霉素和100微克/毫升的链霉素的标准培养介质RPMI1640，在空气含5%CO2的湿润气氛下，温度为37℃下培养。培养14至21天后，滋养层细胞培养物已达到足以进行染色体研究的细胞密度。这种研究是按细胞遗传学诊断中执行的标准技术进行的。培养物的上清液(a)和(b)是由标准介质中的蜕膜细胞和粒膜细胞得到的;收集该培养物的上清液，离心去除细胞并贮存在-20℃温度下。
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11.Sunderland，C.A.etal.(1981)Immunoloqy43，541。
权利要求
1.一种用于从妊娠哺乳动物血样中分离滋养层细胞的方法，该方法包括使所说血样与对结合是有效量的绒毛合胞体滋养层和非绒毛细胞滋养层细胞特异抗体在足以使所说抗体结合到靶细胞上去的条件下接触一段时间，然后从所说血样中分离由所说抗体结合了的细胞。
2.按权利要求1所述的方法，其中哺乳动物是人类女性。
3.按照权利要求1或2所述的方法，其中该抗体是对位于绒毛合胞体滋养层和非绒毛细胞滋养层细胞上的滋养层膜蛋白的抗原决定基是特异的。
4.按权利要求3所述的方法，其中该抗体是对位于绒毛合胞体滋养层和非绒毛细胞滋养层细胞上的滋养层膜蛋白的抗原决定基是特异的，但该抗原决定基不存在于母体或胎儿来源的任何其它血载细胞或任何血清成份中。
5.按权利要求4所述的方法，其中该滋养层膜蛋白的前体根据十二烷基硫酸钠聚丙稀酰胺凝胶上的电泳，具有从约30KDa到70KDa的分子量。
6.按权利要求4所述的方法，其中该蛋白是一种表面表达的滋养层膜蛋白，根据十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶上的电泳，它具有约60KDa到70KDa的分子量。
7.按权利要求4所述的方法，其中该蛋白是一种糖蛋白，且没有N-链的高甘露糖链，但每个分子具有3至6个O-链和5至10个复合N-链的寡聚糖链，或者其中糖蛋白没有N-链、但每个分子具有3至6个O-链的糖蛋白链。
8.按权利要求7所述的方法，其中该滋养层膜蛋白具有大约43KDa的分子量，具有一个N-末端序列为Thr-Gly-Trp-Ser-His-Leu-Val-Thr-Gly-Ala-Gly-Gly-phe-Leu-Gly-Gln-(Y)-Ile-(Y)-(Y)-Leu-(Y)-Val-Lys-(Y)，具有一个部分内部序列是-Phe-(X)-Leu-Arg-Leu-Glu-Ser-Arg-(X)-Ser-Phe-Pro-Leu-(Y)-(X)-Met-Tyr-(X)-Ile-，其中X和Y是如前所定义的。
9.按前面任何一个权利要求所述的方法，其中该抗体或是单克隆抗体，或者是多克隆抗体，或者是它们的组合。
10.按权利要求9所述的方法，其中该抗体是FDO161G或FDO66Q或者FDO338P和/或它们的任何组合。
11.一种用于获得妊娠哺乳动物中的胎儿遗传和/或生物化学信息的方法，该方法包括取出妊娠哺乳动物的血样，以及使所说血样与对结合是有效量的绒毛合胞体滋养层和非绒毛细胞滋养层细胞的特异抗体在足以使所说的抗体结合到靶细胞上的条件下接触一段时间，然后从所说血样中分离由所说抗体结合了的细胞，并从该分离的细胞获得遗传和/或生物化学信息。
12.按权利要求11所述的方法，其中所说的哺乳动物是人。
13.按权利要求11至12中任一个所述的方法，其中该抗体是对位于绒毛合胞体滋养层和非绒毛细胞滋养层细胞上的滋养层膜蛋白的抗原决定基特异的。
14.按权利要求13所述的方法，其中该抗体是对位于绒毛合胞体滋养层和非绒毛细胞滋养层细胞上的滋养层膜蛋白的抗原决定基特异的，但该抗原决定基不出现在母体或胎儿来源的任何其它血载细胞或任何血清成份中。
15.按权利要求14所述的方法，其中该滋养层膜蛋白前体根据十二烷基硫酸钠聚丙烯酸酰胺凝胶上的电泳，具有约30至70KDa的分子量。
16.按权利要求13所述的方法，其中该蛋白是一种表面表达的滋养层膜蛋白，根据十二烷基硫酸钠聚丙烯酸酰胺凝胶上的电泳，具有约60至70KDa的分子量。
17.按照权利要求13所述的方法，其中该蛋白是一种糖蛋白，它不具有N-链的高甘露糖链，但每个分子具有3至6个O-链和5至10个复合N-链的寡聚糖链，或者在其中，该糖蛋白没有N-链，但每个分子有3至6个O-链的寡聚糖链。
18.按权利要求13所述的方法，其中该滋养层膜蛋白具有分子量约为43KDa，具有一个N-末端序列为Thr-Gly-Trp-Ser-His-Leu-Val-Thr-Gly-Ala-Gly-Gly-Phe-Leu-Gly-Gln-(Y)-Ile-(Y)-(Y)-Leu-(Y)-Val-Lys-(Y)，和一个部分内部序列-Phe-(X)-Leu-Arg-Leu-Gln-Ser-Arg-(X)-Ser-Phe-Pro-Leu-(Y)-(X)-Met-Tyr-(X)-Ile-，其中X和Y如前所定义。
19.按权利要求9至14中任一个所述的方法，其中该抗体是单克隆抗体或多克隆抗体或它们的组合。
20.按权利要求19所述的方法，其中该抗体是FDO161G或FDO66Q或FDO338P和/或它们的任何组合。
21.按前述权利要求中任一个所述的方法，其中该抗体首先被结合到一固体基质上。
22.按权利要求21所述的方法，其中所说的固体基质由磁性小珠组成。
23.按权利要求22所述的方法，其中该基质由用绵羊的抗鼠IgG(Fc碎片)血清预涂了的磁性聚苯乙烯小珠组成。
24.按权利要求22所述的方法，其中从血样中分离抗体结合了的细胞包括让血样连续地以水流方式通过一个磁铁的步骤。
25.按权利要求1至20中任何一个所述的方法，其中该抗体首先被结合到一种荧光标记上。
26.按权利要求25所述的方法，其中该荧光标记是一种适合用于荧光激活细胞分选的荧光标记。
27.均匀或接近均匀的抗原FDO161G/FDO66Q蛋白，或它们的任意组合。
28.均匀或接近均匀的抗原FDO338P蛋白。
29.一种用于从妊娠哺乳动物血样分离滋养层细胞，并附加地用于从所说的细胞获取遗传和/或生物化学信息的试剂盒，它包括按隔室形式的第一容器，适合存放对绒毛合胞体滋养层和非绒毛细胞滋养层细胞特异的抗体;附加的第二个容器，适合于接收和盛放妊娠哺乳动物的血样;以及附加的第三个容器，适合于放置从该分离的滋养层细胞获得遗传和/或生物化学信息的装置。
30.按权利要求29所述的试剂盒，其中在第一容器内的该抗体是单克隆抗体或多克隆抗体或它们的组合。
31.按权利要求30所述的试剂盒，其中该抗体是FDO161G或FDO66Q或FDO338P和/或它们的组合。
32.按权利要求29所述的试剂盒，其中用于获得遗传和/或生物化学信息的装置包括用于培养该分离的滋养层细胞的装置。
33.按权利要求29所述的试剂盒，其中用于获得遗传和/或生物化学信息的装置包括DNA探针或引物。
34.按权利要求29所述的试剂盒，其中该抗体被结合到一固体基质上。
35.按权利要求34所述的试剂盒，其中该基质由用绵羊的抗鼠IgG(Fc碎片)血清预涂过的磁性聚苯乙烯小珠组成。
36.按权利要求29所述的试剂盒，其中该抗体被结合到一种荧光标记上。
37.按权利要求36所述的试剂盒，其中该荧光标记是一种适用于荧光激活细胞分选的荧光标记。
全文摘要
本发明涉及用于从妊娠哺乳动物的血液中分离滋养层(胎盘)细胞的方法，以便提供重要的起始材料，即来自胎儿的细胞，使能获得有关将得到的胎儿的遗传和/或生物化学信息。更具体地，本发明涉及使用对哺乳动物滋养层上的膜蛋白标志特异的单克隆抗体，以便从母体血液中分离滋养层细胞。这些细胞然后可以用于在妊娠早期获得胎儿的遗传和/或生物化学信息。本发明特别与探测人胎儿的异常有关。
文档编号C07K16/00GK1043788SQ89109789
公开日1990年7月11日 申请日期1989年12月6日 优先权日1988年12月6日
发明者乌茨·沃尔特·梅勒, 凯瑟琳·斯特拉·霍斯 申请人:南澳大利亚·弗林德斯大学