专利名称：转化生长因子β2的克隆和表达的制作方法
1.引言本发明涉及转化生长因子-β2的克隆和表达。
2.本发明的背景转化生长因子-β(TGF-β)是近年描述的一个可调节细胞分化和增殖之多肽家族的成员。这个家族的其他成员包括穆勒氏抑制物质(Cateetal.，1986，Cell45∶685-698)、抑制素(Masonetal.，1985，Nature318∶659-663)及由果蝇十五效性基因复合物(decapentaplegicgeneComplex)之转录本推测的蛋白质(Padgettetal.，1987，Nature325∶81-84)。
转化生长因子β1(TGF-β1)是由两个相同的二硫键合之112氨基酸亚单位组成的24，000KD均二聚体，最初述及TGF-β1是它能够刺激正常大鼠肾成纤维细胞的锚地依赖性生长(anchorage-independentgrowth)、(Robertsetal.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.78∶5339-5343)。后来进一步表明它是一种影响细胞生长和分化的多功能调节剂(Spornetal.，1986，Science233∶532-534)，具有抑制几种人肿瘤细胞系(Robertsetal.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82∶119-123;Ranchalisetal.，1987，Biochem.Biophys.Res.Commun.148∶783-789)、小鼠角质细胞(Coffeyetal.，1988，CancerRes.48∶1596-1602;ReissandDibble，1988，InVitroCell.Dev.Biol.24∶537-544)，及T和B淋巴细胞(Kehrietal.，1986，J.Exp.Med.163∶1037-1050;1987，J.Immunol.137∶3855-3860;Kasidetal.，1988，J.Immunol.141∶690-698;Wahletal.，1988，J.Immunol.140∶3026-3032)生长的多方面效应。另外，还可抑制早期原始造血细胞增殖(Goeyetal.，1989，J.Immunol.143∶877-880)、刺激大鼠肌肉间质细胞分化并继而产生软骨特异性大分子(Seyedinetal.，1986，J.Biol.Chem.262∶1946-1949)，诱导粘连蛋白和胶原蛋白的合成与分泌(IgnotzandMassaque，1986，J.Biol.Chem.261∶4337-4345;Centrellaetal.，1987，J.Biol.Chem.262∶2869-2874)，刺激骨质形成(NodaandCamilliere，1986，Endocrinology124∶2991-2995)，以及加速伤口愈合(Mustoeetal.，1987，Science237∶1333-1335)。
已分离了编码人(Deryncketal.，1985，Nature316∶701-705)、小鼠(Deryncketal.，1986，J.Biol.Chem.261∶4377-4379)和猴(Sharplesetal.，1987，DNA6∶239-244)TGF-β1的cDNA克隆。对这些克隆的DNA顺序分析表明，TGF-β1是作为大的前体多肽合成的，其羧基末端被裂解后即产生成熟的TGF-β1单体。已发现上述所有来源的TGF-β1前体蛋白质均具有显著的顺序同源性。
已在CHO细胞内高水平表达了TGF-β1(Gentryetal.，1987，Mol.Cell.Biol.7∶3418-3427)。借助位点特异性抗肽抗血清用免疫印迹法分析由这些细胞分泌的蛋白质，以及测定HPLC纯化之溴化氰裂解片段的蛋白质顺序，表明重组TGF-β1(rTGF-β1)是作为高分子量潜在复合物的一部分被分泌的，所说的复合物是由非共价结合到99-110KD二硫键合之复合物上的成熟TGF-β1组成的，所说二硫键结合的复合物则包含成熟顺序及前区特异性顺序(Gentryetal.，1987，Mol.Cell.Biol.7∶3418-3427;Gentryetal.，1988，Mol.Cell.Biol.8∶4162-4168)。已描述了由人293S细胞分泌之rTGF-β1的相似结构(Wakefieldetal.，1989，GrowthFactors1∶203-218)。
用〔3H〕-葡糖胺和〔32P〕-正磷酸放射标记，分析重组CHO细胞之条件培养基的无血清无细胞上清液，表明TGF-β1前体的前区是已磷酸化和糖基化了的(Brunner et al.，1988，Mol.Cell.Biol.8∶2229-2232)。进一步分析还显示，磷酸是作为甘露糖-6-磷酸(M-6-P)掺入的，并且这种修饰发生在前区内三个糖基化位点中的二个位点上(Purchio et al.，1988，J.Biol.Chem.263∶14211-14215)。已证明了TGF-β1前体与M-6-P受体的特异性结合(Purchioetal.，1988，J.Biol.Chem.263∶14211-14215;Kovacinaetal.，1989，Biochem.Biophys.Res.Commun.160∶393-403)。
近年，已从几个来源，包括脱矿物质骨组织(Seyedinetal.，1987，J.Biol.Chem.262∶1946-1949)、人前列腺腺癌细胞系(Ikedaetal.1987，Biochemistry26∶2406-2410)、人成胶质瘤细胞系(Wrannetal.，1987，EMBOJ.6∶1633-1636)及猪血小板(Cheifetzetal.，1987，Cell48∶409-415)中分离了称为转化生长因子-β2(TGF-β2)的第二种蛋白质。TGF-β2的整个氨基酸顺序与TGF-β1有71%同源性(Marquardtetal.，1987，J.Biol.Chem.262∶12127-12131)，并与TGF-β1有几方面的功能相似性(Ranchalisetal.，1987，Biochem.Biophys.Res.Commun.148∶783-789;Seyedinetal.，1987，J.Biol.Chem.262∶1946-1949;Mcphersonetal.，1989，Biochemistry28∶3442-3447)。现已知道，这些蛋白质是包括TGF-β3〔Ten-Dijkeetal.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85∶4715-4719;Deryncketal.，1988，EMBOJ.7∶3737-3743;Jakowlewetal.，1988a，Mol.Endocrinol.2∶747-755)、TGF-β4(Jakowlewetal.，1988b，Mol.Endocrinol.2∶1064-1069)、穆勒氏抑制物质(Cateetal.，1986，Cell45∶685-698)和抑制素(Masonetal.，1985，Nature318∶659-663)在内的相关生长调节蛋白家族的成员。
3.本发明的概要本发明涉及用含有在表达调节元件控制下之TGF-β2编码顺序的重组DNA载体转染真核宿主细胞，然后由该宿主细胞大量产生TGF-β2的方法。
在一特定实施方案中，由tamoxifen处理的人前列腺腺癌细胞系pC-3中制得cDNA文库，并由该文库筛选得到编码人TGF-β2前体的cDNA克隆。由其中一个克隆的cDNA顺序推测，TGF-β2是作为442氨基酸多肽前体合成的，由该前体经蛋白水解作用裂解得到成熟的112氨基酸TGF-β2亚单位。这一称为TGF-β2-442的TGF-β2前体与TGF-β1的前体有41%同源性。在另一实例中，由非洲绿猴肾细胞系BCS-40构建cDNA文库，并由之得到编码猴TGF-β2前体的cDNA克隆。根据其中一个克隆的cDNA顺序推断，TGF-β2也是作为414氨基酸多肽前体合成的，并由该前体经蛋白水解得到成熟的112氨基酸TGF-β2亚单位。这一称为TGF-β2-414的前体物，具有一个414氨基酸残基的顺序并与TGF-β2-442的氨基酸顺序相同，所不同的是它含有一个信号门冬酰胺残基，取代人TGG-β2-442顺序中的29个氨基酸顺序(残基116至135)。
也已鉴定了得自编码猴TGF-β2-442前体之BSC-40cDNA文库的克隆及得自编码人TGF-β2-414前体之人PC-3cDNA文库的克隆。人和猴TGF-β2-442前体与人和猴TGF-β2-414前体一样，似乎在氨基酸水平上也有很好的同源性。TGF-β1和TGF-β2的成熟112氨基酸单体有71%同源性。
在本发明的另一实施方案中，借助实施例描述了构建含TGF-β2成熟编码顺序(该顺序同向协调地连接到TGF-β1信号和前体顺序上)之表达载体(共同待批美国专利申请189，984号)及同于转染中国仓鼠卵细胞(CHO细胞)和COS细胞的方法。所得到的CHO和COS转化株可产生并分泌成熟的、生物学活性TGF-β2。在一相关的实施方案中，使用完整的猴TGF-β2-414前体基因构建表达载体，用于在被转染的CHO细胞中高水平表达成熟和前体形式的TGF-β2。
3.1.定义本文所用的下列术语无论是单数还是复数的，均分别定义为TGF-β2为基本上含图1a中所示氨基酸残基331至442之氨基酸顺序的人或猴来源的转化生长因子β2。
TGF-β2前体为一族人或猴来源的转化生长因子β2分子，其基本上包含如图1a中所示约从氨基酸残基1至残基442，或缺失其中残基116至144而代之以单一天冬酰胺残基之氨基酸残基1至残基442的氨基酸顺序。该术语是指命名为TGF-β2-442或TGF-β2-414的人或猴来源的TGF-β2前体。
杂合TGF-β1/TGF-β2前体为基本上包含图1b中所示约从氨基酸残基1至390之氨基酸顺序的新的转化生长因子β前体分子。
TGF-β1前体为基本上包含图1b中所示约从氨基酸残基1至278之单一顺序的猴源转化生长因子β前体。
4.
图1a显示人TGF-β2-442cDNA的核苷酸顺序及由之推断的氨基酸顺序。将PC-21的2597bp插入段再克隆到pEMBL(Danteetal.，1983，NucleicAcidsRes.11∶1645-1654)中并用二脱氧链终止法(Sangeretal.，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74∶5463-5467)测定双股核苷酸顺序。图中显示了编码顺序并在其上面给出了推断的氨基酸顺序。方框内是成熟TGF-β2顺序，信号肽上面加有横线，潜在的糖基化位点则由星号标示。箭头指示假定的信号顺序裂解位点。猴TGF-β2-414cDNA的核苷酸顺序与人TGF-β2-442cDNA基本相同，只是缺失核苷酸346至432(加有括号)并代之以顺序AAT，另外结构中有的地方出现几处沉默核苷酸改变(在改变之核苷酸下方标有单个字母)。推断的猴TGF-β2-414前体氨基酸顺序与人TGF-β2-442前体氨基酸顺序相同，只是由门冬酰胺取代了人TGF-β2-442结构中的氨基酸残基116至144。已测定了下加破拆线区域的核苷酸顺序，并发现其与人TGF-β2-442cDNA有很好的同源性，不同的是其中的核苷酸346至432被删除而代之以顺序AAT。
图1b显示杂合TGF-β1/TGF-β2前体DNA的核苷酸顺序以及由之推断的氨基酸顺序。其中给出了编码顺序，并在其上方列出推断的氨基酸顺序。方框内是成熟TGF-β2顺序，上加横线处是前体信号肽。糖基化位点由星号标示。箭头则指示假定的信号顺序裂解位点。图示者是人来源的TGF-β2成熟编码顺序。猴TGF-β2成熟编码顺序与人顺序大致相同只是其中有3个沉默碱基改变(在改变的核苷酸下方以单个字母标示)。有关TGF-β2的cDNA克隆方法和杂合TGF-β1/TGF-β2基因的构建将在下文第8节中描述。
图1c显示杂合的TGF-β1/TGF-β2前体基因。
图1d为pPC-14(2.2Kb)和pPC-21(2.3Kb)的限制性酶切图。方框区域代表TGF-β2单体的编码顺序。ATG为起始蛋氨酸密码子。pPC-21(2.34Kb)中ATG与KpnⅠ位点间距离约420bp。涂黑的区域代表pPC-21(2.3Kb)中84bp插入段的位置。
图1e显示pPC-14(2.2Kb)的部分DNA顺序分析结果。用与pPC-21(2.3Kb)之插入片段内距KpnⅠ位点约140bp上游杂交的合成寡核苷酸5′-AGGAGCGACGAAGAGTACTA-3′引导DNA顺序测定反应。该区域中，pPC-14(2.2Kb)的顺序(上面一行)相同于pPC-21(2.3Kb)中编码Asn-116以前之核苷酸的顺序。其中显示了见于pPC-21(2.3Kb)中的pPC-21(2.2Kb)之Asn-116密码子处的84bp插入段。标示了该插入段内的KpnⅠ位点。
图2显示人TGF-β1与TGF-β2-442前体顺序的同源性。A一级结构同源性方框内为完全相同的残基。标示了潜在的信号顺序裂解位点和成熟多肽的裂解位点。B使用GenePro程序作斑点矩阵比较。各个斑点均标定10个氨基酸中有5个相同的点。对角线表示同源性区域。
图3显示BSC-40与PC-3聚腺苷酸化RNA的Northern印迹分析结果。由BSC-40和PC-3细胞中分离聚腺苷酸化RNA，经琼脂糖-甲醛凝胶分级分离，转移到Hybond-N滤膜上并与〔32P〕标记的TGF-β2特异性探针、pPC-21(A)或〔32P〕-标记的TGF-β2和TGF-β1(Sharples et al.，1987)特异性探针的混合物(B)杂交。泳道1为BSC-40聚腺苷酸化RNA(5μg);泳道2为PC-3聚腺苷酸化RNA(5μg)。
图4显示不同来源之聚腺苷酸化RNA的Northern印迹分析结果。由MCF-7(人乳腺癌)、SK-MEL28(人黑素瘤)、KB(鼻咽癌)和HBL-100(人乳腺上皮)细胞中分离聚腺苷酸化RNA，并与TGF-β2特异性探针(pPC-21)进行Northern印迹杂交分析。各泳道均含有5μg得自SK-MEL28(泳道1)、MCF-7(泳道2)、HBL-100(泳道3)或KB(泳道4)细胞的聚腺苷酸化RNA。
图5显示重组TGF-β2的生物学活性试验结果。1β9，12.5，Cl.36细胞在100mm组织培养皿中生长会合。细胞用无血清培养基洗3次并在5ml无血清培养基中保温24小时。收集培养基，对0.2M乙酸透析并按已述方法(Gentryetal.，1981，Mol.Cell.Biol.7∶3418)检测对CCL64细胞中DNA合成的抑制作用。该试验中，3.3PgTGF-β1标准品产生50%抑制;计算的TGF-β2比活性约为TGF-β1的一半。
图6显示由1β9，12.5，克隆36细胞分泌之重组蛋白质的Western印迹分析结果。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分级分离酸透析的1β9，12.5，克隆36细胞之无血清条件培养基，并用抗TGF-β2前体内氨基酸顺序395-407之合成肽NH2-YNTINPEASASPC-COOH的抗血清(抗TGF-β2 395-407)进行Western吸印分析。
图7显示对经过放大的被转染CHO细胞分泌的重组蛋白质的定性分析结果。A使用抗TGF-β2395-407(泳道2)或在免疫吸印分析前已与过量肽保温过的抗-TGF-β2359-407(泳道3)抗血清以免疫吸印法分析由1β9，12.5Cl.36培养物中收集的无血清上清液。泳道1含有天然TGF-β2(MWrquardt et al.，1987，J.Biol.Chem.262∶12127-12131)。于还原条件下，用线性15%聚丙烯酰胺-SDS凝胶分离样品。B于非还原条件下用梯度7.5-15%聚丙烯酰胺-SDS凝胶电泳分离1β9，12.5CL36条件培养基(泳道2)和天然TGF-β2(泳道1)并用抗TGF-β2395-407进行免疫吸印分析。
图8显示鉴定由1β9，12.5CL35细胞无血清条件培养基中纯化之重组TGF-β2(rTGF-β2)的结果。A于非还原条件下在15%聚丙烯酰胺-SDS凝胶上分离rTGF-β2并进行银染色。B于还原(泳条1)和非还原(泳道2)条件下在7.5-15%梯度聚丙烯酰胺-SDS凝胶上分离rTGF-β2并用抗-TGF-β2395-407抗血清以免疫吸印法检测之。C于还原(泳道1)和非还原(泳道2)条件下在7.5-15%梯度聚丙烯酰胺-SDS凝胶上分离碘标记的rTGF-β2，并用放射自显影法检测。
图9显示rTGF-β2与HEPM细胞表面受体的结合。于还原条件下，在6.25%聚丙烯酰胺-SDS凝胶上分析用〔125Ⅰ〕-rTGF-β1和〔125Ⅰ〕-rTGF-β2标记的TGF-β受体亲合性。泳道1-3是用〔125Ⅰ〕-rTGF-β1标记的，并与未标记的rTGF-β1(泳道2)或未标记的rTGF-β2(泳道3)竞争。泳道4-6是用〔125Ⅰ〕-rTGF-β2标记的并与未标记的rTGF-β1(泳道5)或未标记的rTGF-β2(泳道6)竞争。
图10显示鉴定由转化的COS细胞分泌之重组蛋白质的结果。A为TGF-β质粒编码区域的线形图。pβ1′编码TGF-β1;pβ2′编码TGF-β2;pβ1/β2′编码β1(NH2)/β2(COOH)杂合蛋白质。B用pβ1′转染的COS细胞;转染后48小时将培养基换成无血清培养基，并于48小时后收集之。样品对0.2M乙酸透析，干燥并使用抗TGF-β1369-381于还原条件下作免疫印迹分析。泳道1，COS细胞+pβ1′;泳道2，COS细胞+载体(pπXH3M);泳道3，COS细胞+PBS。C用pβ1′(泳道1)、pβ1/β2′(泳道2)、pπXH3M(泳道3，只有载体)和PBS(泳道4)转染COS细胞。转染后48小时收集无血清上清液并使用抗TGF-β2395-407于还原条件下作免疫印迹分析。D用pβ1/β2′转染COS细胞并使用抗TGF-β2395-407于还原条件下对上清液作免疫印迹分析。E用pβ2′(泳道1)、pβ1/β2′(泳道2)、pπXH3M载体(泳道3)、PBS(泳道4)转染COS细胞;使用抗TGF-β2395-407对无血清上清液作免疫印迹分析。
右边的(图面E的左侧)数据指示分子量标准品(千道尔顿数)的位置。于7.5-15%梯度(图面C中为15%线性梯度)聚丙烯酰胺-SDS凝胶上分离样品。
图11显示rTGF-β1和rTGF-β2对貂肺细胞的生长抑制作用。A按已述方法(Gentry et al.，1988，Mol.Cell.Biol.8∶4162-4168)纯化rTGF-β1，并按下文10.1.7节中所述方法作生长抑制试验。Bβ2(414)Cl.32细胞在100mm培养皿中生长会合。细胞用无血清培养基洗3次并加5ml无血清培养基保温24小时。收集培养基，以2000Xg离心5分钟。对0.2M乙酸(O-O)或50mM NH4HCO3，pH7.0(-)透析，并检测其对貂肺细胞的生长抑制作用。C由正常CHO细胞(泳道1)或β2(414)Cl.32细胞(泳道2)中提取总RNA;在琼脂糖-甲醛凝胶上分离30μg总RNA，转移到尼龙膜上并按下文10.1.4.节所述用〔32P〕标记的TGF-β2特异性探针〔pPC-21(2.3Kb)〕检测之。
图12显示用免疫吸印及直接代谢标记法检测TGF-β2特异性蛋白质。A显示用于制备抗肽抗体之TGF-β1前体肽顺序的线性图。a指示前TGF-β2-414区;b指示FGF-β2-414前体的前区;c指示TGF-β2单体。B于还原条件下用SDS-PAGE法分离β1Cl.17细胞(泳道1和3)或β2(414)Cl.32细胞(泳道2和4)的无血清无细胞条件培养基上清，并使用抗TGF-β181-94(泳道1)、抗TGF-β2(414)51-66(泳道2)、抗TGF-β1369-381(泳道3)或抗TGF-β2(414)367-379(泳道4)以免疫吸印法检测之。C于非还原条件下用SDS-PAGE法分离β1cl.17细胞(泳道1和3)或β2(414)Cl.32细胞(泳道2和4)的无血清无细胞条件培养基上清，并使用抗TGF-β181-94(泳道1)、抗TGFβ2(414)51-66(泳道2)、抗TGF-β1369-381(泳道3)或抗TGF-β2(414)367-379(泳道4)以免疫吸印法分析之。D用〔35S〕-蛋氨酸加〔35S〕半胱氨酸标记β1Cl.17细胞(泳道1)、β2(414)Cl.32细胞(泳道2)和β2(414)Cl.35细胞(泳道3)，并于非还原条件下用17.5-17.5%凝胶以SDS-PAGE法分析无血清上清液。E用〔35S〕-蛋氨酸加〔35S〕一半胱氨酸标记β1Cl.17细胞(泳道1)、β2(414)Cl.32细胞(泳道2)和β2(414)Cl.35细胞(泳道3)，并于还原条件下用7.5-17.5%凝胶以SDS-PAGE法分析其无细胞上清液。
图13显示用〔32P〕-正磷酸和〔3H〕-葡糖胺标记，分析重组CHO细胞分泌的蛋白质。用1mCi/ml〔32P〕-正磷酸标记会合的β1Cl.17细胞(泳道1)或β2(414)Cl.32细胞(泳道2)，4小时后取无血清无细胞上清液对0.2M乙酸透析，并于还原条件下用15%凝胶作SDS-PAGE分析。另外，用〔3H〕-葡糖胺标记会合的β1Cl.17细胞(泳道3)、β2(414)Cl.32细胞(泳道4)和β2(414)Cl.35细胞(泳道5)，并取无血清无细胞上清液于还原条件下用7.5-17.5%凝胶作SDS-PAGE法分析。
图14显示鉴定TGF-β2-414前区内甘露糖-6-磷酸的结果。A用〔32P〕-正磷酸标记会合的β1Cl.17细胞并用SDS-PAGE法分离无血清无细胞上清液。分离图13泳道1中的带a和b，在6M HCl中水解并按已述(Cooper et al.，1983，Methods Enzymol.99∶387-402)的二维电泳法分级分离。图中标示了TGF-β1前体(Purchio et al.，1988，J.Biol.Chem.263∶14211-14215)内M-6-P的迁移位置。B用〔32P〕-正磷酸标记会合的β1(414)Cl.32细胞，并用SDS-PAGE法分级分离无血清无细胞上清液。分离图13泳道2中的带b，在6M HCl中水解并以二维电泳法分析之。C为A和B的混合物。使用了得自A和B的等同CPm数。
图15显示对纯化之rTGF-β2的分析结果。由β2(414)Cl.32细胞的条件培养基中纯化rTGF-β2，于还原(泳道1)或非还原(泳道2)条件下在7.5-17.5%凝胶上以SDS-PAGE法分析1μg样品。凝胶用考马斯兰染色。泳道3含有1μgrTGF-β1(未还原的)。
5.发明的详细描述本发明涉及由TGF-β前体基因编码顺序生产成熟的生物学活性TGF-β2的方法及其产品。可在宿主细胞内克隆和表达TGF-β2前体及其功能等同物的全长核苷酸编码顺序，以产生成熟的生物学活性TGF-β2。所说的宿主细胞中具有适当的前体物，以致使产生的有生物活性的成熟TGF-β与天然TGF-β2几乎没有区别。TGF-β2前体之全长核苷酸编码顺序的功能等同物包括任何当在适当宿主内表达时能够指导成熟TGF-β之合成、加工和泌出的DNA顺序。就这一点来说，例如可构建包括与读码内TGF-β1成熟顺序连接之TGF-β1前体顺序的杂合前体编码顺序，并用以产生生物学活性TGF-β2。
同样，本发明还涉及用含完整TGF-β2前体编码顺序的载体转染真核宿主细胞，以生产TGF-β2的前体物，包括潜在的高分子量TGF-β2前体复合物、TGF-β2的前区及未加工的TGF-β2前体。
为了便于描述，可将本发明的方法分为下列几个步骤(a)分离或产生TGF-β2前体形式的编码顺序;(b)构建用于表达TGF-β2编码顺序的表达载体;(c)转染能复制和表达基因并加工基因产物的宿主细胞，以产生成熟的生物学活性TGF-β2，或潜在的TGF-β2前体形式;以及(d)鉴定和纯化成熟的生物学活性TGF-β2或潜在的TGF-β2前体形式。一旦鉴定了高水平表达TGF-β2的转染体，下一步即可扩增该克隆并分离被表达的基因产物。
本发明的方法是通过实施例进一步阐明的，其中包括制备TGF-β2前体编码区的cDNA、克隆、测定顺序并用以构建能在哺乳动物宿主细胞内高水平表达TGF-β2的表达载体。在一特定实施方案中，申请人由PC-3cDNA文库中鉴定了编码TGF-β2的克隆。分析其中一个克隆的DNA顺序，表明同TGF-β1一样，TGF-β2也是作一个大的前体蛋白质合成的，其羧基末端被裂解而产生成熟的TGF-β2单体。虽然这些分子的成熟部分之间有71%同源性，但前体的其余部分内则最大只有31%是同源的，此提示TGF-β1和TGF-β2的氨基末端区可能在功能上是不同的。
本发明的另一特定实施方案，是通过在CHO细胞内表达新的TGF-β1/TGF-β2杂合基因来产生大量生物学活性TGF-β2。另外，可由工程化CHO细胞高水平表达完整的TGF-β2前体编码顺序，以得到成熟及前体形式的TGF-β2。申请人已检测了由这些细胞分泌之重组TGF-β2蛋白质的各种生物化学、免疫学及结构特性。
下面各节及继后的实施例将更详细地描述本发明方法的各个方面。
5.1.分离或产生TGF-β2编码区TGF-β2的核苷酸编码顺序如图1a所示。在本发明方法的实践中，可用其中所示的核苷酸顺序或其片段或其功能等同物产生将指导在适当宿主细胞内表达TGF-β2产物的重组分子。在一特定实施方案中(如下文第10节所述)，FGF-β2和414氨基酸TGF-β2前体的高水平表达是在用重组质粒转染的中国仓鼠卵细胞内完成的，所说的重组质粒含有处于SV-40启动子调节控制下的猴TGF-β2(414)前体和二氢叶酸还原酶(DHFR)编码顺序。用氨甲喋呤进一步扩增表达可分离到高水平分泌成熟TGF-β2及高分子量前体复合物的克隆。这些克隆在每毫升培养基内约分泌5μg重组TGF-β2。初步分析这些分泌的TGF-β2前体，表明它的前区是糖基化了的，并含有甘露糖-6-磷酸。在另一相关实施方案中，构建了TGF-β1/TGF-β2杂合基因，并用以转染CHO细胞;所得到的转染体可在每毫升培养基中分泌0.4μg重组TGF-β2。
鉴于核苷酸编码顺序的简并性，在本发明的实践中还可使用图1a和1b中所示的编码同样氨基酸顺序的其他DNA顺序克隆和表达TGF-β2。这些修饰包括缺失、加入或置换不同的核苷酸残基，得到编码相同的或功能上等同的基因产物的顺序。基因产物可包含缺失、加入或置换顺序内的氨基酸残基，导致沉默改变，从而产生生物活性产物。氨基酸取代可在有关残基具有相似极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性性质的基础上实现。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸;带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸;具有不带电荷极性头部基团或有相似亲水性之非极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸;甘氨酸、丙氨酸;天冬酰胺，谷氨酰胺;丝氨酸，苏氨酸;苯丙氨酸，酪氨酸。
可由产生TGF-β2样活性的细胞内得到TGF-β的核苷酸编码顺序。可由这些细胞中分离并纯化RNA，制备cDNA克隆或基因组克隆以得到编码顺序。可由使用本领域内已知的技术，如限制性酶切法产生的DNA片段中制得克隆的cDNA或基因组DNA文库。可用基本上互补于图1a中所示顺序之任何部分的核苷酸探针筛选这些文库，以鉴定编码TGF-β2的片段。可选择含整个TGF-β2前体编码区的全长克隆用于表达。
在本发明的另一实施方案中，可使用已知的化学方法全部或部分合成图1a所示的编码顺序(如参见Caruthersetal.，1980，Nuc.AcidsRes.Symp.Ser.7∶215-223;CreaandHorn，1980，Nuc.AcidsRes.9(10)∶2331;MatteucciandCarruthers，1980，TetrahedronLetters21∶719;ChowandKempe，1981，Nuc.Acids.Res.9(12)∶2807-2817)。另外，可使用化学方法全部或部分合成图1a所示的氨基酸顺序，得到蛋白质。例如，可使用Beckman990合成仪以固相技术合成肽，并按已知方法从树脂上裂解之(Gentry，L.E.etal.，1983，J.Biol.Chem.258∶11219-11228;Gentry，L.E.andLawton，A.，1986，Virology152∶421-431)。可用制备性高效液相层析法进行纯化并经氨基酸分析进一步证实肽的氨基酸组成。
在一特定实施方案中(详见第6节)，可由预先证明能产生TGF-β2之tamoxifen处理的人前列腺腺癌细胞系PC-3中分离聚腺苷酸化RNA，再经cDNA克隆由之衍生人TGF-β2前体编码顺序，以得到TGF-β2编码顺序。同样，如下文第7节中所述，可由非洲绿猴肾细胞系BSC-40中分离聚腺苷酸化RNA，cDNA克隆由之衍生的TGF-β2前体编码顺序，从而得到TGF-β2编码顺序。人和猴TGF-β2前体似乎有相同的氨基酸顺序，而且它们的核苷酸顺序也几乎是相同的。
TGF-β2cDNA克隆的DNA顺序分析表明，与TGF-β1一样，TGF-β2也是作为大的前体蛋白质合成的，其羧基末端被切掉后即产生成熟的112氨基酸TGF-β2单体。已证明TGF-β2分子量为24，000，由两个二硫键结合的13，000道尔顿亚单位组成(Ikedaetal.，1987，Biochemistry26∶2406-2410;Cheifetzetal.，1987，Cell48∶409-415)。因此，产生成熟的TGF-β2需要适当的蛋白水解性裂解及形成分子内和分子间二硫键。前体内存在一个可能与蛋白质由细胞内泌出有关的氨基末端疏水先导顺序(残基3-19)。在此期间，成熟TGF-β2可能仍与前体的其余部分相联接。
就前体的整个成熟部分来说，TGF-β2与TGF-β1有71%同源性，这意味着它们之间存在已经实验证实了的功能相似性(Seyedinetal.，1987，J.Biol.Chem.262∶1946-1949;Cheifetzetal.，1987，Cell48∶409-415)。人、啮齿动物和猴TGF-β1前体区域的氨基部分(Deryncketal.1985，Nature316∶701-705;Deryncketal.，1986，J.Biol.Chem.261∶4377-4379;Sharplesetal.，1987，DNA6∶239-244)是高度保守的，提示分子的这个部分可能具有重要的生物学功能。反之，TGF-β1和TGF-β2的N末端前体区域间则有不是31%的同源性。TGF-β1和TGF-β2前体蛋白质氨基末端区域内一级结构的差异可能反映两者间的功能差异。然而，前体内的显著同源区是见于分隔的区段内，此提示甚至在N末端前体区域内也保留有重要的功能区。
Northern印迹分析揭示了BSC-40细胞内有4.1和6.5Kb这两大类TGF-β2特异性mRNA。Tamoxifen处理的PC-3细胞含有三种分别为4.1Kb、5.1Kb和6.3Kb的TGF-β2转录本。这三种不同大小的信息顺序可能同其他基因的情况一样，是产生不同RNA切接、聚腺苷酸化或同时有这两种作用的结果(Helfmanetal.，1986，Mol.Cell.Biol.6∶3582-3595;Sayreetal.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84∶2941-2945)。对另一TFF-β2cDNA克隆的初步分析表明，其含有一大约1Kb3′非转译区(大于pPC-21和pPC-14的相当区域)及不同的聚腺苷酸化位点，此提示聚腺苷酸化作用是产生见于Northern印迹中之多个TGF-β2mRNA的因素之一。
BSC-40细胞含有水平相当的TGF-β1和TGF-β2特异性转录本;tamoxifen处理的PC-3细胞则含有比TGF-β2更多的TGF-β1mRNA(图3B)。后者是一个意想不到的结果，因为这些细胞可产生比TGF-β1更多的TGF-β2蛋白质(Ikedaetal.，1987，Biochemistry26∶2406-2410)，提示就这种生长调节剂的合成来说，可能存在着转录后水平的调节作用。如TGF-β1一样，用DNA重组技术生产足够量的TGF-β2将有助于进一步研究和利用这种蛋白质。
5.2.含TGF-β2编码顺序之表达载体的构建为了表达有生物学活性的、成熟形式的TGF-β2，应选择不仅能提供高水平转录和转译作用，而且还能正确加工基因产物的表达载体/宿主系统。当在表达构建体中利用整个TGF-β2前体编码顺序时，这一点是特别重要的，因为成熟形式的TGF-β2似乎是通过细胞加工过程由前体产物衍生的。另外，可选择有利于产物分泌的表达/宿主细胞系统。
具体地说，可通过细胞内加工，包括在前体的Arg-Ala(即图1a中所示的残基330和331)氨基酸之间的水解作用，形成成熟的TGF-β2，即二硫键结合的112氨基酸亚单位同二聚体。此外，TGF-β2前体含有三个见于成熟形式中的潜在N-糖基化位点;前体的适当糖基化作用对于成熟分子的细胞内合成、释放或分泌可能是很重要的。在这方面，申请人已证明TGF-β2前体的前体是糖基化并且磷酸化了的(见下文10.2.节)。还发现成熟TGF-β2由二硫键连接的二聚体中，每个亚单位包含9个半胱氨酸。其中有的存在于链内，有的则参予形成链间二硫键，以影响成熟分子的三级结构和构型，进而影响其生物学活性。因此，用于表达系统之宿主细胞正确表达和加工TGF-β2基因产物的能力对于产生有生物学活性的成熟TGF-β2及产生TGF-β前体是很重要的。
可利用本领域内已知的各种动物宿主/表达载体系统(即含有TGF-β2编码顺序，及在适当宿主细胞内复制、转录和转译所必需之元件的载体)。这样的系统包括但不仅限于病毒表达载体/哺乳动物宿主细胞系统(如细胞巨化病毒、牛痘病毒、腺病毒等);昆虫病毒表达载体/昆虫细胞系统(如杆状病毒);或得自哺乳动物细胞基因组的非病毒启动子表达系统(如小鼠金属硫因启动子)。
这些载体的表达元件在其强度和特异性上有所不同。根据所使用的宿主/载体系统，可使用任何一个适当的转录和转译元件。例如，当在哺乳动物细胞系统内克隆时，可使用由哺乳动物细胞基因组中分离的启动子(如小鼠金属硫因启动子)，或由生长于这些细胞内的病毒分离的启动子(如牛痘病毒7.5K启动子)。也可使用以重组DNA或合成技术产生的启动子以确保被插入顺序的转录。
为了转译被插入的蛋白质编码顺序，还需要有特异的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子及邻近顺序。当包括其自身起始信号和邻近顺序的完整TGF-β2基因被插入适当表达载体时，可不需要附加的转译控制信号。但只有一部分编码顺序被插入时，则须提供包括ATG起始密码子在内的外源转译控制信号。此外，起始信号必须与TGF-β2编码顺序的读码同时协调存在，以确保整个插入段的转译。这些外源转译控制信号和起始密码子可以是不同来源的(天然的和合成的)。可通过加入转录衰减顺序、增强子等来提高表达效率。
可使用以前介绍的任何将DNA片段插入载体的方法来构建包含TGF-β2基因和适当转录/转译控制信号的表达载体。这些方法可包括体外DNA重组技术、合成技术与体内重组(基因重组)方法。
当使用腺病毒作表达载体时，可将TGF-β2编码顺序连接到腺病毒转录/转译控制复合物上，如晚期启动子和三联先导顺序上。然后用体外或体内重组法将该杂合基因插入腺病毒基因组中。插入一个病毒基因组的非必需区(如E1或E3区域)将产生存活的、能在被感染宿主内表达TGF-β2的重组病毒。同样，也可使用牛痘病毒7.5K启动子。
可用于表达TGF-β2的另一适用的表达系统是昆虫系统。在该系统中，使用了Autographacalifornica核多用体病毒(AcNPV)作为表达外来基因的载体。该病毒生长于Spodopterafrugiperda细胞中。可将TGF-β2编码顺序克隆到病毒的非必需区域(如多面体基因)中，并置于AcNPN启动子(如多面体启动子)的控制下。成功地插入TGF-β2编码顺序将导致多面体基因的活化和未包裹之重组病毒(即缺乏由多面体基因编码之蛋白质被膜的病毒)的产生。然后用这些重组病毒感染Spodopterafrugiperda细胞，以表达已插入的基因。
另外，可选择能调节被插入顺序之表达或以特定方式修饰与加工基因产物的宿主细胞株。可在某些诱导剂(如用于诱导金属硫因启动子的锌和镉离子)存在下提高由某些启动子起始的表达。因此基因工程化TGF-β2的表达是可以控制的。如果外来基因的蛋白质产物对宿主细胞是致死性的，这一点尤为重要。再者，蛋白质产物的修饰(如糖基化)和加工(如裂解)对于蛋白质的功能也是很重要的。就转译后加工和蛋白质的修饰来说，不同的宿主细胞有不同特征和特异机制。可选择适当的细胞系或宿主系统以保证正确地修饰和加工被表达的外来蛋白质。
5.3.表达TGF-β2基因产物之转染体或转化体的鉴定至少可用下述四种一般方法鉴定含有重组TGF-β2编码顺序并表达生物学活性成熟产物的宿主细胞(a)DNA-DNA杂交;(b)存在或不存在“标志”基因功能;(c)检测TGF-β2mRNA转录本在宿主细胞内的表达，以估计转录的水平;以及(d)进行免疫分析，最后检测其生物学活性以检定成熟和/或前体基因产物。
第一种方法中，可使用含有基本上与图1a中所示TGF-β2编码顺序或其部分或其衍生物同源之核苷酸顺序的探针，以DNA-DNA杂交法确定是否存在已插入到表达载体内的TGF-β2编码顺序。
在第二种方法中，可基于存在或不存在某些“标志”基因功能(如胸苷激酶活性、抗生素抗性、氨甲喋呤抗性、转化表型、杆状病毒中包涵体的形成等)来鉴定和选择重组表达载体/宿主系统。例如，如果TGF-β2编码顺序已插入到载体的标志基因顺序内，即可根据不存在标志基因功能来鉴定含TGF-β2编码顺序的重组体。另外，可使标志基因与TGF-β2顺序串联，并置于可控制TGF-β2编码顺序之表达的相同或不同启动子的控制下。在对诱导和选择起反应中表达该标志，即证明TGF-β2编码顺序能得以表达。
在第三种方法中，可用杂交法估计TGF-β2编码区的转录活性。例如，可使用与TGF-β2编码顺序或其特定部分同源的探针，以Northern印迹法分析已分离的聚腺苷酸化RNA。另外，可提取宿主细胞的总核酸，并与上述探针杂交以进行检测。
在第四种方法中，可用免疫学方法，如Western印迹法、放射免疫沉淀法、酶联免疫检测法等判定成熟和/或前体蛋白质产物的表达。然而，表达系统是否成功的最终试验，应包括对生物学活性TGF-β2基因产物的检定。当宿主细胞分泌基因产物时，可检测转化体宿主细胞的无细胞培养基中有无TGF-β2活性。如基因产物没有被分泌出来则可检测溶胞产物中的TGF-β2活性。在每种情况下，均可使用本文所述的生长抑制法及刺激靶细胞锚地依赖性生长的方法(TwardzikandSherwin，1985，J.Cell.Biochem.28∶289-297;DelarcoandTodaro，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA75∶4001-4005)等进行生物学检测。
一旦鉴定了产生高水平生物学活性TGF-β2的克隆，即可扩增该克隆并使用本领域内已知的技术纯化TGF-β2。这类方法包括免疫亲合纯化法、包括高效液相层析法在内的层析法等。
5.4.使用杂合TGF-β1/β2前体基因在CHO细胞内稳定地表达TGF-β2在一本发明的特定实施方案中，用含有杂合TGF-β1(NH2)/β2(COOH)之编码顺序的重组表达质粒转染中国仓鼠卵(CHO)细胞，合成并分泌已正确加工过的成熟的生物活性TGF-β2。如下文第8节中详细描述的，经免疫吸印、受体结合和氨基酸顺序分析，证明了由表达质粒编码的杂合前体蛋白质(即TGF-β1(NH2)/TGF-β2(COOH))已在转染的CHO细胞得到正确加工。
鉴于TGF-β1氨基末端前体区具有指引重组TGF-β2成熟的能力，从而提出了与成熟TGF-β2的加工有关之分子行为的问题，并提示TGF-β1和TGF-β2可能具有共同的成熟途径。由于发现TGF-β1前体的氨基末端区含有能使该前体与甘露糖-6-磷酸受体结合的M-6-P残基(Purchioetal.，1988，J.Biol.Chem.263∶14211-15215)，从而进一步支持了TGF-β1前体的这个区域在成熟TGF-β1的加工中起积极作用的见解。TGF-β前体与M-6-P受体结合，很可能促进分子进入溶酶体，以借助溶酶体蛋白酶得到加工。TGF-β1前体的氨基末端区中存在甘露糖-6-磷酸残基，暗示了前体的这个区域在TGF-β1成熟过程中的功能性作用。申请人发现，包括这个区域的杂合TGF-β前体被正确加工以形成成熟的TGF-β2，此提示TGF-β1和TGF-β2间存在共同的成熟途径。尽管如此，但借以实现加工过程的这一途径的效力似乎是可变的，並且可能取决于遵循这一途径之前体分子的整个结构组成。在这方面，用编码全长TGF-β2前体蛋白质之质粒转染的COS细胞在加工成熟生长因子时似乎比用编码全长TGF-β1或杂合TGF-β1(NH2)/TGF-β2(COOH)前体蛋白质(上文第9节)之质粒转染的COS细胞更为有效。虽然对这种加工可变性的原因尚不明瞭，但蛋白酶对裂解位点的识别可能是影响因素之一。例如，较之其他结构形式来说蛋白酶识别和作用可能有利于某一特定的二级结构，因此，一种前体形式可能是比其另一形式更适于加工的底物。
本发明还涉及纯化的重组TGF-β2。可由培养之CHO转化体的无血清条件培养基中纯化生物活性TGF-β2(有关纯化方法的细节将在下文第8和10节中描述)。本发明纯化的重组TGF-β2于还原条件下用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析时，作为单一的12KD蛋白质迁移，而于非还原条件下则作为单一的24KD蛋白质迁移，这就表明了制剂的均一性。顺序分析显示，重组产物得以正确加工，并具有与天然TGF-β2一样的氨基末端氨基酸顺序。受体结合研究表明，重组TGF-β2(rTGF-β2)与人胚胎腭间质(HEPM)细胞上的TGF-β受体结合。总之，本发明的纯化的rTGF-β2在免疫学上、功能上及结构上似乎均与天然TGF-β2相同。
5.5.TGF-β2在COS细胞内的瞬时表达在本发明的另一实施方案中，用含有上述杂合前体编码顺序或完整TGF-β2前体编码顺序的表达质粒转染非洲绿猴肾COS细胞以产生成熟的生物活性TGF-β2。为了便于分析比较，还用编码完整TGF-β1前体的合成的构建物转染COS细胞。所有这三种情况下，成熟和前体生长因子产物都是由转染的COS细胞分泌的。而且成熟蛋白质主要是以其生物学上的潜在形式分泌的，此结果与被转染的CHO细胞分泌生物学潜在形式的TGF-β1(Gentryetal.，1987，J.Mol.Biol.7∶3418-3427)是一致的。为得到最大生物学活性的产品，需要有一个常规的酸化步骤，以激活该潜在形式。
表达TGF-β2前体编码顺序的COS转化体要比表达TGF-β1或杂合TGF-β1(NH2)/β2(COOH)前体编码顺序的COS转化体分泌更多的生物学活性蛋白质。这些研究结果(有关细节将在第9节中讨论)表明，在表达TGF-β2前体的细胞中，少数成熟的TGF-β2单体仍与高分子量前体蛋白质相联系。已观察到了单体TGF-β1和TGF-β1前体之间的这种二硫键结合的关联(Gentry et al.，1977，Mol.Cell.Biol.，待出版)，并可在加工过程中用作中间体复合物。关于用TGF-β2前体编码顺序转染的细胞可分泌有更高生物学活性的产物，一个可能的解释是TGF-β2可比TGF-β1和杂合TGFβ1/β2前体更有效地被蛋白酶识别并裂解。另外，TGF-β2前体的二级结构特征可能使其比其他TGF-β前体更易于加工。利用完整的TGF-β2前体基因得到了较高水平的生物活性重组TGF-β2，并且已由申请人获得的实验数据(参见下文第5、6、节所述的特定实施方案)得到进一步证实。
5.6.使用TGF-β2-414前体基因在CHO细胞中稳定地高水平表达TGF-β2在本发明的一个特定实施方案中(参见下文第10节实实例所述)，高水平rTGF-β2是用含414氨基酸TGF-β2前体编码顺序的表达质粒转染，然后用氨甲喋呤放大表达，进而由CHO细胞(β2(414)Cl.32细胞)合成并分泌的。因为TGF-β2是以潜在形式分泌的，所以为了检测最大生物学活性水平而需要经过一个酸化步骤。
对纯化之rTGF-β2的氨基末端顺序分析表明，成熟的生长因子是在预定裂解位点(TGF-β2(414)中的Ala303)经蛋白水解作用得以加工的。另外，对rTGF-β2羧基末端溴化氰肽的蛋白质顺序分析，提示其为完整的蛋白质。可见，CHO细胞具有正确加工前TGF-β2的适当蛋白酶。
使用对前区和成熟区顺序特异的抗肽抗体，经免疫吸印法分析由这些CHO细胞分泌的重组蛋白质，证明分泌了三个含大的前区的蛋白质，且于非还原条件下经SDS-PAGE分析其分子量分别为130KD、105KD和85KD。用抗TGF-β2之残基367-379的抗体只能检测到130KD和105KD蛋白质，提示这些蛋白质含有成熟区和前区特异性顺序，而85KD带可能代表二聚合的前区蛋白质。用这些抗体也可检测到成熟的TGF-β2。
由β2(414)Cl.32细胞分泌的高分子量含前区蛋白质不同于由β1Cl.17细胞分泌的蛋白质，在于后者分泌单一的90-110KD复合物。这种差异很可能是由于分子的前区中二硫键结合分布型不同，因为用杂合TGF-β1/β2表达载体(见下文第8节)转化的CHO细胞主要分泌见于β1Cl.17条件培养基上清中的90-110KD复合物。在用编码突变型TGF-β1前体(其中33位上的半胱氨酸被丝氨酸取代)(Brunneretal.，1989，J.Biol.Chem.264∶13660-13664)之质粒转染的COS细胞条件培养基上清中，可见到90-110KD蛋白质被裂解并出现了85KD前区二聚体，从而进一步提示前区内的二硫键结合分布型与这些高分子量复合物的形成有着密切关联。
于还原条件下经SDS-PAGE分离后，用免疫吸印法分析β1(414)Cl.32细胞的条件培养基，证明只含有前区顺序的12KD TGF-β2单体和30-42Kb蛋白质是主要的分泌蛋白质(见下文第10节)。相反，仅发现很少量未裂解的前TGF-β2，经分析用〔35S〕-蛋氨酸和〔35S〕-光胱氨酸、〔32P〕-正磷酸，以及〔3H〕-葡糖胺总体标记的由这些细胞分泌的蛋白质(见下文第10节)，进一步证明了这一观察结果。
先前的实验表明，rTGF-β1前体在前区内三个糖基化位点中的两个位点上含有甘露糖-6-磷酸。TGF-β2(414)前体的前区也被糖基化并含有M-6-P(见下文10.2.3.节)。一般认为M-6-P是与M-6-P受体结合的识别标志，而所说的受体参予这些蛋白向酸性载体的运输，并在载体上经蛋白水解作用得以加工(Kornfeld，1986，J.Clin.Invest，77∶1-6;Dahmsetal.，1989，J.Biol.Chem.264-12115-12118)。当受体结合到塑料上(Purchioetal.，1988，，J.Biol.Chem.263∶14211-14215)或在CHO细胞表面上过表达(Kovacinaetal.，1989，Biochem.Biophys.Res.Comm.160∶393-403)时，TGF-β1受体即与M-6-P受体结合。Monensin、氯喹和氯化铵等试剂可阻断酸性蛋白酶的作用，阻断对对前TGF-β1的裂解，提示与M-6-P受体结合及被酸性蛋白酶裂解可能与TGF-β前体的加工过程有关(Shaetal.，1989，Mol.Endocrinol.3∶1090-1098)。在加工TGF-β2(414)前体的过程中可能存在相同或相似的途径。
如上所述，rTGF-β2是以生物学上的潜在形式由β2(414)Cl.32细胞分泌的。已在分泌rTGF-β1的哺乳动物细胞观察到了这种现象(Centryetal.，1987，Mol.Cell.Biol.7∶3418-3427;Madisenetal.，1989，DNA8∶205-212;Wakefieldetal.，1989，GrowthFactors1∶203-218)，并且至少其部分原因是由于成熟rTGF-β1与含高分子量前区之复合物的非共价结合。
6.实施例来自PC-3细胞之TGF-β2前体的cDNA克隆下面描述预先由人前列腺腺癌细胞系PC-3中分离的TGF-β2前体编码顺序的cDNA克隆方法。
6.1材料和方法6.1.1细胞生长及RNA提取按已述方法(Ikedaetal.，1987，Biochemistry26∶2406-2410)在添加tamoxifen的培养基中培养人前列腺腺癌细胞系PC-3。MCF-7细胞则生长于Dulbecco氏改良的含10%胎牛血清和6单位/ml胰岛素的Eagle氏培养基中。所有其他细胞系均培养在没有胰岛素的同种培养基内。按已述方法(PurchioandFareed，1979，J.Virol.29∶763-769)经Oligo〔dT〕-纤维素层析分离聚腺苷酸化RNA。
6.1.2.cDNA文库的构建和筛选按已述方法(Maniatis et al.，1982，Molecular ClohingALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York)由用Xamoxifen处理(24小时)的PC-3细胞中分离聚腺苷酸化RNA，并以其合成双股cDNA。按已述方法(Webb et al.，1987，DNA6∶71-79)将大于1000碱基对的cDNA克隆到λgt10中。首先用〔32P〕标记的、互补于编码氨基酸WKW IHEP(其在TGF-β1和TGF-β2之间是保守的)之DNA的24重简并探针(探针1)重复筛选该文库
〔5′-GGTTCGTGTATCCATTTCCA-3′〕CAGCA然后用第二个互补于编码氨基酸CFRNVQD(这七个氨基酸中有五个是TGF-β2特异的)之DNA的128重简并探针(探针2)筛选阳性克隆〔5′-TCTTGAACGTTTCTGAAGCA-3′〕CCACAAGT于42℃下，在6×SSC、5×Denhart氏溶液、0.15mM焦磷酸、100μg/ml变性牛胸腺DNA、100μg/ml酵母tRNA和1mM EDTA中杂交(Maniatis et al.，1982，Molecular Cloning∶ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York)。滤膜于42℃下在2×SSC、0.1%NaDodSO4中洗4次每次30分钟。分离出几个与两探针杂交的cDNA克隆，并再克隆到pEMBL(Dante et al.，1983，Nucleic Acids Res.11∶1645-1654)中。使用各种限制酶和核酸外切酶Ⅲ删除与特异寡核苷酸引导部分结合的片段(Henikoff，1984，Gene28∶351-359)，经二脱氧链终止法(Sanger et al.，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74∶5463-5467)基于两条链测定一个含2.6Kb插入段之克隆(pPC-21)的核苷酸顺序。对另一个含2.2Kb插入段的克隆(pPC-14)则测定部分顺序。使用RiversideScientificEnterprises公司(Seattle，WA)的GenePro软件程序在IBMATPC上进行点阵分析(dotmatrixanalysis)。
6.1.3.Northern印迹分析在1%琼脂糖甲醛凝胶上分离聚腺苷酸化RNA(Lehrach et al.，1977，.Biochemistry 16∶4743-4751)，转移到尼龙薄膜(Hyboud Amersham)上，并于42℃下，在含有0.9MNacl、50mM磷酸钠(pH7.0)、5mM EDTA、0.1%NaDodSO4、4×Denhardt氏溶液、0.4mg/ml酵母DNA和0.25mg/ml变性牛胸腺DNA的50%甲酰胺中与〔32P〕标记的探针杂交。65℃下用0.25×SSC、0.1%NaDodSO4洗滤膜，干燥并借助Lightening Plus增强屏(Dupont)对Cronex-4 X-ray胶片(Dupont)曝光。
6.2.结果使用由tamoxifen处理的PC-3细胞分离的聚腺苷酸化RNA构建cDNA文库。早期研究表明，tamoxifen处理可使TGF-β2的分泌量增加2至5倍(Ikedaetal.，1987，Biochemistry26∶2406-2410)。按上述方法用探针1和2筛选该文库。得到5个可与两探针杂交的克隆选择一个含有2.6Kb插入段的克隆pPC-21进行顺序测定;另一个含有2.2Kb插入段的克隆则作部分顺序测定。表1中显示了DNA和推断的氨基酸顺序。
pPC-21含有编码推断之442氨基酸多肽的单一开放读码;112羧基末端氨基酸包含成熟的TGF-β2单体(图1a中括号内部分)。由开放读码编码的第一个蛋氨酸后面跟着一段疏水的和未改变的氨基酸(图1a中上方划线部分)，其具有信号肽的特征。编码该蛋氨酸及开放读码中另外两个蛋氨酸的核苷酸顺序都不与编码起始蛋氨酸之相符顺序(consensussequence)同源(Kozak，1986，Cell44∶283-292)。因为转译通常是以开放读码中第一个氨基酸开始的，并且如下文所述，与TGF-β1同源的区域出现在第二个蛋氨酸的上游，所以暂且将第一个蛋氨酸定为转译起始位点。据此，TGF-β2似乎与TGF-β1一样，也是作为较大的分泌前体的一部分表达的。pPC-21克隆含有假定起始蛋氨酸的467bp上游，以及polyA印迹的约800bp3′未转译区，其15碱基上游区限定了聚腺苷酸化信号顺序(ProudfootandBrownlee，1976，Nature263∶211-214)。
TGF-β1和TGF-β2pPC-21cDNA克隆编码区内核苷酸顺序同源性为53%。编码成熟蛋白质的区域有57%同源性，而上游前体区有48%同源性。在两个顺序呈最适线性排列后，TGF-β2前体区内见有几个核苷酸插入段，其中一个延伸75核苷酸。尚不知道这些插入是否因为TGF-β2中存在附加外显子。未测知两克隆的非编码区中DNA顺序间有明显的同源性。事实上，在TGF-β1扩展了富G-C非编码区的同时，TGF-β2也扩展了富A-T的非编码区。两个cDNA克隆在3′非编码区中都含有重复结构特征，只是TGF-β1中的重复部分包括(嘌呤)CCCC(Sharplesetal.，1987，DNA6∶239-244)，TGF-β2中包括ATG或A(嘧啶)(嘌呤)。
许多克隆的限制性酶切图显示，克隆pPC-3在位于TGF-β2编码顺序的氨基部分中缺少KpnⅠ限制性酶切点。pPC-14和pPC-21的限制性酶切图如图1d所示。用互补于图1a中核苷酸277至296的20mer寡核苷酸进行特异引导，测定pPC-14中相当于分子之该区域的约100个核苷酸区段的顺序。结果表明，pPC-14克隆有-87核苷酸缺失部分(图1a中核苷酸346至432;同时参见图1e)，这说明失去了KpnⅠ位点并被顺序AAT(天冬酰胺密码子)所取代。这一结果提示，pPC-14克隆编码含414个氨基酸的较短TGF-β2前体，其与pPC-21编码的顺序不同只在于氨基酸残基116至144被删除并由单一天冬酰胺残基所取代。
虽然没有测定pPC-14的整个编码区，但它与pPC-21编码顺序可能有很好的一致性，因为除了KpnⅠ位点外，两个克隆的限制性酶切图是完全可以重迭的(图1d)。此外，如第7节所述，已鉴定了编码414氨基酸TGF-β前体的猴克隆，其包括同样的29氨基酸缺失及置换部分。该猴克隆在5′和3′至缺失区域中几乎有与人pPC-21克隆完全相同的编码顺序。
图2A显示推测的人TGF-β1蛋白质顺序(Deryncketal.，1985，Nature316∶701-705)与人TGF-β2-442氨基酸蛋白质顺序的比较。已确定TGF-β2与以前报导的人TGF-β1整个成熟分子部分(Marguardtetal.，1977，J.Biol.Chem.，262∶12127-12131)有71%同源性。成熟分子之前体上游的氨基部分在TGF-β1和TGF-β2-442之间有31%同源性。图2B中所示的点阵同源性比较表明，蛋白质的几个特定区域中存在明显的同源性。对假定信号肽区域中N末端氨基酸顺序的比较则没有看到明显的同源性。
TGF-β2中，推测信号顺序裂解位点在氨基酸20(丝氨酸)之后，而在TGF-β1中则在氨基酸29(甘氨酸)之后(VonHeijne，1983，Eur.J.Biochem.133∶17-21)。该裂解位点直接位于TGF-β1和TGF-β2之间第一个同源性区段的前面，且后者向下游延伸34个氨基酸。除去信号肽后，TGF-β1和TGF-β2前体将分享有前四个氨基酸(包括第4位上的半胱氨酸)的N末端。该假定N末端的14氨基酸下游区、继后21个氨基酸中的19个在TGF-β和TGF-β2之间都是保守的，同源性区段比在任何含成熟蛋白质的C末端区中所见到的都大些。如图2A和2B中所示，成熟蛋白质上游区域内存在由一段非同源氨基酸分隔的、有强同源性的更多几个区段。
TGF-β2前体具有三个潜在的N-糖基化位点(位于图1a所示残基72、168和269处)。在TGF-β1中只有第一个位点是保守的，并位于保守残基的较大区段内，此提示该潜在糖基化位点具有结构和/或功能特性。
除去信号肽后，TGF-β2前体将比其TGF-β1对应物多含31个或59个氨基酸。TGF-β2中的一个附加半胱氨酸残基正好位于成熟顺序前面非同源氨基酸一较大区域的上游。同TGF-β2一样，成熟TGF-β2蛋白质的裂解位点恰在如图2A中所示4-5个碱性氨基酸区域之后。成熟区域含有9个半胱氨酸。9个半胱氨酸中有7个保守，这对于TGF-β家族不同成员是特征性的。TGF-β1和TGF-β2的“水疗法”分析展示前体和成熟区都有相似图形，而两种蛋白质在本质上都是亲水的。
图3A显示使用pPC-21探针对得自BSC-40(一种非洲绿猴肾细胞系)和tamoxifen处理之PC-3细胞的聚腺苷酸化RNA进行Northern印迹分析。PC-3细胞含有3种大小分别为4.1、5.1和6.5Kb的TGF-β2特异性的mRNA(图3A，泳道2);BSC-40细胞主要含有4.1和6.5Kb转录本和较少量的5.1KbRNA(图3A，泳道1)。值得注意的是，pPC-21探针在所用杂交条件下不能测出存在于该细胞系内的2.5KbTGF-β1特异性mRNA。这些结果和以前的研究(Sharplesetal.，1987，DNA6∶239-244)提示，BSC-40细胞含有TGF-β1和TGF-β2特异性mRNA。为了更明确地证明这一点，使Northern印迹与含等量放射标记之TGF-β1和TGF-β2探针的混合物杂交(得有同样的比活性)。图3B的泳道1显示BSC-40细胞含有2.5KbTGF-β1特异性mRNA以及4.1和6.5KbTGF-β2mRNA;图3B的泳道2显示tamoxifen处理的PC-3细胞也含有2.5KbTGF-β1特异性mRNA。图3B还显示tamoxifen处理的PC-3细胞含有比TGF-β2更多的TGF-β1特异性信息。
鉴定TGF-β2特异性cDNA克隆使我们能够筛选各种细胞系中的TGF-β2mRNA。图4中所示Northern印迹表明，可在含有很低水平TGF-β2mRNA的HBL100(一种得自人乳中的正常上皮细胞系)、MCF-7(一种人乳癌细胞系)、SK-MEL28(一种黑色素瘤细胞系)和KB细胞(一种鼻咽癌细胞系)中检测出TGF-β2特异性转录本。
7.实施例BSC-40细胞中TGF-2前体的cDNA克隆下列实施例描述由非洲绿猴肾细胞系BSC-40(已证明其含有TGF-β2特异性mRNA，参见上文第6节)得到的TGF-β2编码顺序的cDNA克隆方法。结果表明，猴TGF-β2与人TGF-β2一样，是作为至少两个较长前体之一合成的，而成熟TGF-β2分子正是由前体物经蛋白水解作用得到的。
7.1.材料和方法7.1.1.细胞生长与RNA提取BSC-40细胞生长于Dulbecco改良的含10%胎牛血清的Eagle培养基中。按已述方法(PurchioandFareed，1979，J.Virol.29∶763-769)经Oligo〔dT〕-纤维素层析分离聚腺苷酸化RNA。
7.1.2.cDNA文库构建与筛选按已述方法(Maniatisetal.，1982，MolecularCloning∶ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY，371-372)由BSC-40聚腺苷酸化RNA合成双链cDNA，用EcoRⅠ甲基化酶处理后，连接到含EcoRⅠ限制酶识别位点的寡核苷酸衔接子(EcoRⅠ衔接子)上。用EcoRⅠ消化cDNA并在SephacrylS-1000柱上层析分离之。收集大于750bp的cDNA并连接到已用EcoRⅠ切割的λgt10(Davisetal.，1980，AManualforGeneticEngineering∶Advanced Bac terial Genetics;Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)中，包装并铺敷在大肠杆菌C600rK-mK+hfl上。用噬斑杂交法(Bentonet et al.，1977，Science 196∶180-182)筛选文库中与〔32P〕标记的pPC-21和pPC-14探针杂交的克隆。分离其中与pPC-21探针杂交的克隆pBSC-40-16，以及与pPC-14探针杂交的克隆pBSC-40-1，并再克隆到pEMBL中。使用双脱氧链终止法(Sanger et al.，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74∶5463-5467)测定pBSC-40-1之TGF-β2编码顺序(两条链)，对pBSC-40-16则测定部分顺序。
7.2结果由BSC-40cDNA文库得到两个克隆，它们分别与由人TGF-β2-442和TGF-β2-414前体编码顺序构建的探针杂交。
测定了与TGF-β2-442探针杂交之克隆pBSC-40-16中150个核苷酸区段(图1a中核苷酸300至450)的核苷酸顺序(预期其含有图1a中所示氨基酸346至432这29个氨基酸片段的编码顺序)。结果发现，pBSC-40-16的这个区域与人TGF-β2-442cDNA克隆中相应顺序编码完全相同的氨基酸顺序，并提示pBSC-40-16编码442氨基酸TGF-β2前体。
测定了与TGF-β2-414探针杂交之克隆pBSC-40-1整个编码区的核苷酸顺序。结果表明该克隆编码与人TGF-β2-442前体完全相同的414氨基酸TGF-β2前体，不同的是人TGF-β2-442的氨基酸残基116至144被删除并被一个门冬酰胺残基取代。在核苷酸水平上，pBSC-40-1的缺失区域与人TGF-β2-442不同即图1a中的核苷酸346至432被删除，并被门冬酰胺密码子AAT取代。除13个沉默碱基改变(SilentbaseChanges)外，两个结构的其余编码顺序是完全同源的。
8.实施例TGF-β2在CHO细胞中的表达下列实施例描述成熟的生物学活性TGF-β2在经重组质粒转化之中国仓鼠卵细胞(CHO细胞)内的表达，所说的重组质粒包含成熟人TGF-β2的编码顺序，该顺序与下游相连接并在读码内有猴TGF-β1前体的编码顺序，这些顺序均处于SV40启动子顺序的调节控制之下，该构建体以大约0.4mg/L的水平指导成熟之生物学活性TGF-β2的合成与分泌。
8.1材料和方法8.1.1.细胞培养物在添加10%胎牛血清(FBS)和150μg/mlL-脯氨酸的HamsF-12培养基(GibcoLaboratories，NY)(其中含有青霉素和链霉素各100μ/ml和100μg/ml)中增殖缺乏二氢叶酸还原酶(DHFR)的中国仓鼠卵(CHO)细胞(UrlaubandChasin，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，77∶4216)。CHO转化株则生长在含上述同样添加剂的Dulbecco改良的Eagle培养基中。CHO细胞及其衍生株均以1∶5脱落比例经胰蛋白酶消化进行常规传代。
在水中以储备浓度10mg/ml配制氨甲喋呤(Sigma，MO)溶液，并加入稀NaOH(0.2M)使最终pH达到6以溶解之。储备液过滤除菌后保存于-20℃下。该氨甲喋呤储备液在培养基(100μM)中4℃保存期不超过1个月。
8.1.2.DNA操作及质粒构建限制性酶、T4DNA连接酶、牛小肠磷酸酶、DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段及其他DNA片段均购自BethesdaResearchLaboratories，MD。按Maniatis，T.等人所述方法(1982，MoleculaCloning∶ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，NY)进行标准的DNA操作。
按已知方法(Gentryetal.，Mol.CellBiol。7∶3418)构建含有串联之猴TGF-β1DNA和小鼠DHFR基因以及插入SV40顺序的质粒pSV2(β1-TGF-dhfr)。
有关质粒pSV2/β1-β2/dhfr的构建参见8.2节。
8.1.3.DNA转染在100mm培养皿上接种106个DHFR缺陷性CHO细胞后约24小时，用20μg NdeⅠ切割的pSV2-(β1-TGF-dhfr)质粒(作为磷酸钙沉淀物)(Wigler，M.，et al.，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA76∶1373-1376)转染培养物。简单地说，即将20μg切成线形的DNA加到1ml250mM无菌CaCl2中。然后逐滴加入1ml2×HEPES溶液(280mM NaCl，50mM HEPES，1.5mM磷酸钠，pH7.1)，并将混合物在水上放置30分钟。再将沉淀物逐滴分散在含细胞的10mlF12培养基上。37℃保温4小时后，除去培养基并换成10ml含25%甘油的F12培养基，室温放置90秒钟。用20mlF12培养基冲洗细胞并在非选择性F12培养基(20ml)中继续保温48小时。将培养基换成添加10%透析之FBS(Gibco，NY)和150μg/mlL-脯氨酸的DMEM，以选择表达DHFR的转化体。在选择培养基中培养10-14天后观察菌落。用巴斯德吸管抽吸10个菌落并扩增之。
8.1.4.氨甲喋呤抗性细胞的选择基本上按已述方法(Gasser，C.S.and Schimke，R.T.，1986，J.Biol.Chem.261-6938-6946)由初级转化株中得到二氢叶酸还原酶(DHFR)放大的细胞。扩增后，将105个细胞接种在100mm平皿上并经逐渐增加氨甲喋呤浓度驯化之。用胰蛋白酶消化在最高氨甲喋呤浓度时含可见菌落的平皿，并驯化至氨甲喋呤浓度至少适于再作两次1∶5细胞传代。然后将细胞(105个)接种在5倍氨甲喋呤浓度的100mm平皿上。再次用胰酶消化含可见菌落的平皿并在含氨甲喋呤培养基中驯化之。在含40%FBS、10%二甲亚砜和50%DMEM的培养基中于不同的扩增阶段冷冻细胞。冷冻培养基中不含氨甲喋呤。
8.1.5.生长抑制试验利用对TGF-β1极其敏感的貂肺上皮细胞Mv1Lu(美国典型培养物保藏中心，登记号CCL-64)进行生长抑制试验。使用胸苷类似物5′-〔125I〕-碘代-2′-脱氧尿苷(125IdU)进行检测以确证DNA合成。与未处理的CCL-64细胞相比，将抑制50%125IdU掺入所需要的量定为一个活性单位。
为检测转染的细胞是否分泌活性TGF-β2，由细胞的24小时汇合培养物中收集无血清上清液并对0.2M乙酸彻底透析。冻干除去乙酸并将样品重新溶解在无菌的完全培养基中以备分析。
8.1.6.重组蛋白质的纯化和顺序分析将得自1β9，12.5CL36细胞的无血清和无细胞上清液酸化至1M乙酸、浓缩、对0.2M乙酸透析、冻干并使用0.1%TFA、40%CH3CN在Bio-Sil TSK-250柱上进行凝胶过滤层析。收集活性部分，用溶于H2O中的0.05%TFA作1∶1稀释并在μBondapak C18柱(3.9×30mm)上使用0.05%TFA和CH3CN作有机修饰剂进行层析。再次收集活性部分，用溶于H2O的0.05%TFA作1∶1稀释，并再次用溶于水的0.05%TFA和1-丙醇作有机修饰剂在同一柱上进行层析(Ikeda et al.，1987，Biochemistry 26∶2406-2410)。用470A型氨基酸顺序仪(Applied Biosystems)进行氨基酸顺序分析。按已述方法(Gentry et al.，1988，Mol.Cell.Biol.8∶4162-4168)由β-3-2000细胞的条件培养基中纯化重组的TGF-β1(rTGF-β1)。
8.1.7.肽合成和抗体的产生在Beckman990自动合成仪上用固相技术合成肽链并按已知方法(Gentryetal.，1987，Mol.Cell.Biol.7∶3418-3427;GentryandLawton，1986，Virology152∶421-431)由树脂载体上分离之。用高效液相层析法纯化肽并分析其氨基酸组成。
按已述方法(Gentry等，上述文献;Gentry和Lawton，上述文献)将合成的肽结合到牛β-球蛋白上。使用在完全弗氏佐剂中乳化的肽结合物(相当于100μg肽)于3至6个部位经皮下和皮内注射，免疫新西兰白兔。然后以2-3周间隔进行加强免疫。加强接种后7-14天放血。
8.1.8.免疫印迹分析用7.5%-17.5%梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，并转移到未改性的硝酸纤维素(0.45μm;SchleicherandSchuell)滤膜上，于4℃和200mA保持14-18小时(Burnette，W.N.，1981，Anal.Biochem.112∶195-203)。与溶于含0.2%NP-40之磷酸缓冲盐水(PBS)的2.5%BLOTTO(Johnson，D.A.，etal.，1984，GeneAnal.Techn.1∶3-8)一起保温以阻断硝酸纤维素的过度结合能力。在2.5%BLOTTO中稀释兔抗血清并于室温下与封闭的硝酸纤维素膜保温2小时。将硝酸纤维素膜在2.5%BLOTTO中洗涤5次每次5分钟，以洗去过量的抗体，然后与1∶500倍稀释(在2.5%BLOTTO中)的碱性磷酸酶结合的蛋白A一起保温。保温1小时后，在含0.2%NP-40的PBS中将硝酸纤维素膜洗5次(每次5分钟)并显色(Learyetal.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80∶4045-4059)。
8.1.9.受体结合试验以氯胺T法用〔125Ⅰ〕标记rTGF-β2和rTGF-β1(Frolik et al.，1984，J.Biol.Chem，259∶10995-11000)，使比活性达到100-150μCi/μg。用结合缓冲液(DMEM加0.1%BSA和25mM Hepes缓冲液，pH7.2)将大约3×105个会合成为单层的人胚胎腭间质(HEPM)细胞洗两次，并与同种缓冲液于37℃保温2小时，以解离同细胞表面受体结合的TGF-β。弃去缓冲液，并于存在或不存在1000μg/ml相应未标记蛋白的条件下，使细胞单层与1μCi〔125Ⅰ〕-TGF-β1或〔125Ⅰ〕-TGF-β2一起保温3小时。用水冷的结合缓冲液洗细胞单层(2次)并于4℃下与250μM二琥珀酰胺基辛二酸酯保温15分钟。再次用PBS将细胞单层洗两次并用1%TritonX-100、10mM Tris、1mM EDTA(pH7.0)溶解之。以12，000xg离心可溶性材料，然后作SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
8.2.用于TGF-β2表达之TGF-β1/TGF-β2架合前体基因的构建构建如图1c所示包含猴TGF-β1前体编码顺序和与读码相连之5′非转译顺序，以及人成熟TGF-β2编码顺序和3′非转录顺序的杂合TGF-β前体基因。
首先用EcoRⅠ消化pPC-21，用Klenow酶填充、将2.3Kb片段连接到HincⅡ消化的pEMBL上，并用以转化大肠杆菌。使用两个在相反方向上有插入片段的克隆pPC-21/HincⅡ+和pPC-21/HincⅡ-，用SstⅠ和BamHⅠ消化，再用ExoⅢ消化以产生交迭的ExoⅢ消化片段，用Klenow酶修补、重新连接DNA并转化大肠杆菌。将两个发现分别含有不同长度之5′和3′顺序的克隆E55.9和Exo25C再克隆到pEMBL中，产生pEMBL5.9和pEMBL25C。
用HindⅢ消化pEMBL5.9，用Klenow酶填成平头、用KpnⅠ消化并分离0.6Kb片段(片段1)。用EcoRⅠ和KpnⅠ消化Exo25C并分离1.1Kb片段(片段2)。用BamHⅠ消化pGS62，用Klenow酶充填末端，用EcoRⅠ消化并连接片段1和2〔pGS62是由pGS20(Mackettetal.，1984，J.Virol.49∶857)经删除单一EcoRⅠ位点而得到的〕。用此混合物转化大肠杆菌并分离pGS62/CIFB。
用PstⅠ和EcoRⅠ消化pGS62/CIFB，分离1600bp片段并进一步用XhoⅡ消化之。分离所得到的400bpXhoⅡ-EcoRⅠ片段(片段3)。用ApaⅠ和EcoRⅠ消化pSV2-β-TGF(Gentryetal.，1987，Mol.Cell.Biol.7∶3418)，并分离较大的3000bp片段(片段4)。
合成含下列顺序的两条互补DNA链、磷酸化、退火并连接到上述片段3和4上。
′5CAACATCTGCAAAGCTCCCGGCACCGCCGAGCTTTGGATGCGGCCTATTGCTTTAGAAATGTGCAGGATAATTGCTGCCTACGTCCACTTTACATTGATTTCAAGAGG5′GATCCCTCTTGAAATCAATGTAAAGTGGACGTAGGCAGCAATTATCCTGCACATTTCTAAAGCAATAGGCCGCATCCAAAGCTCGGCGGTGCCGGGAGCTTTGCAGATGTTGGGCC3′
用连接混合物转化大肠杆菌并分离质粒pβ1/β2。
用EcoRⅠ消化质粒pβ1/β2、用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段填成平头，用HindⅢ切割并分离1600bp片段将该片段插入pSV2，neo中(已先用HindⅢ和HpaⅠ消化除去neo基因)中，以构建pSV2，β1/β2。
用PvuⅠ和EcoRⅠ消化pSV2，β1/β2，用Klenow酶填充，再用NdeⅠ消化后分离2.6Kb(大约)NdeⅠ-EcoRⅠ片段，并连接到已用NdeⅠ和PvuⅡ消化的pSV2，dhfr上。用连接混合物转化大肠杆菌并分离pSV2/β1-β2/dhfr。
8.3在CHO细胞中表达TGF-β2用pSV/β1-β2/dhfr转染DHFR缺陷性CHO细胞并按上文材料和方法中所述由初级转化体中得到DHFR放大的细胞。使用8.1.5节中所述的生长抑制试验鉴定阳性克隆。还使用抗存在于成熟TGF-β2中之顺序NH2-YNTINPEASASPC-COOH(Gentry at al.，1987，Mol.Cell.Biol.7∶3418)的抗血清，以Western吸印法检测重组蛋白质。分析之前，为测定最适生物活性须有一个酸化步骤。
发现1β9，12.5可分泌240μg/mlTGF-β2(图5)。然后在96小井平板中克隆之。收集产率约400μg/ml的克隆1β9，12.5，CL36(图5)，并作进一步鉴定。
使用抗肽抗血清以Western吸印法分析由克隆1β9，12.5，CL36分泌的蛋白质(图6)，结果表明存在成熟的24KdTGF-β2二聚体及较大的(约90Kd)前体物。
8.4.分析由转化的CHO细胞分泌的重组蛋白质使CHO细胞产生的TGF-β1前体蛋白质糖基化，在甘露糖残基上进行磷酸化处理以产生甘露糖-6-磷酸，并结合到甘露糖-6-磷酸受体上(Brunner et al.，1988，Mol.Cell.Biol.8∶2229-2232;Puchio et al.，1988，J.Biol.Chem.263∶14211-14215)。结合甘露糖-6-磷酸参予了细胞内蛋白质向溶酶体的运输过程(参见Kornfeld，1986，J.Clin.Invest.77∶1-6)，此提示TGF-β1的氨基末端前体区可能在产生成熟TGF-β1所必需的蛋白水解过程中起作用。为此，有必要进一步研究杂合TGF-β1(NH2)/β2(COOH)，看是否TGF-β1的氨基末端前体区可有利于正确加工功能性成熟TGF-β2分子。用pSV2/β1-β2/dhfr转染CHO细胞并按上述方法(8.1.节)扩增个别克隆。
图7A中显示了用抗TGF-β2395-407对由1β9，12.5克隆36分泌的蛋白质进行免疫印迹分析的结果;从中可以看到代表还原之TGF-β2单体的12KD蛋白质以及较大的45-55KD前体多肽(图7A，泳道2)。在非还原条件下进行免疫印迹分析，显示出了24KD二聚体和高分子量前体物(图7B，泳道2)。将抗血清与肽一起预保温可阻断免疫反应活性(图7A，泳道3)。12KD和24KD rTGF-β2蛋白与还原和未还原的天然TGF-β共迁移(图7A，泳道1;图7B，泳道1)。
按上文8.1.6.节所述，由无血清条件培养基中纯化rTGF-β2。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法及银染色或免疫吸印法分析rTGF-β2，结果如图8A和图8B所示。经〔125Ⅰ〕标记后所作的进一步分析如图8C所示。结果表明，CHO细胞用pSV2/β1-β/dhfr转染并扩增后，在非还原条件下分析发现其可分泌分子量约24KD的多肽(在还原条件下为12KD)，该产物在免疫学和功能上均相当于天然TGF-β2。对图8A中所示24KD蛋白质之前12个残基的蛋白质顺序分析表明，其完全相同于天然TGF-β2，从而可认为成熟TGF-β2是由TGF-β1(NH2)/β2(COOH)前体经正确加工而得到的。
进一步分析了纯化的rTGF-β2与细胞表面TGF-β受体结合的能力。按8.1.9节中所述方法用HEPM细胞进行受体结合试验，结果示于图9中。用〔125Ⅰ〕-rTGF-β2标记对TGF-β有亲和性的HEPM细胞表面受体，并分析于还原条件下经SDS-PAGE分离的三个不同的带;其中大部分信号位于图9中所示的高分子量带内，其可能是相当于分子约为250至350KD的Ⅲ型TGF-β受体。还测出了约90KD和65KD的小受体结合成分(图9)。未标记的rTGF-β2能对抗〔125Ⅰ〕-rTGF-β的结合。
9.实施例在COS细胞中表达TGF-β2下列实施例描述在细胞巨化病毒和HIV表达调控元件的调节控制下，成熟生物活性TGF-β2和TGF-β2前体在用含TGF-β2前体或TGF-β1/TGF-β2杂合前体编码顺序之重组质粒转染的COS细胞内的表达。其中两个质粒，一个编码TGF-β2前体，一个编码杂合TGF-β1/TGF-β2前体，被用于支配TGF-β2前体和其生物活性成熟多肽的合成与分泌。
9.1.材料和方法
9.1.1.细胞培养物在添加10%胎牛血清的DMEM培养基(其分别含100μ/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中增殖COS细胞(一种非洲绿猴肾细胞系)。COS转化体也培养在同种培养基内。细胞以1∶5脱落比例经胰酶消化进行常规传代。
9.1.2.质粒构建和COS细胞转染对编码猴TGF-β1的质粒pTGF-β2和pPC-21(2.3Kb)(编码人TGF-β2)已作过描述(Sharplesetal.，1987，DNA6∶239-244;Madisenetal.，1988，DNA7∶1-8)。将λBSC-1β2(Webbetal.，1988，DNA7∶493-497)的插入段再克隆到pEMBL的EcoRⅠ位点中，得到含有猴TGF-β2之编码顺序的pBSC40，1/β2(414)。用AppliedBiosystemsDNA合成仪制备含5′非转译顺序之92个核苷酸及TGF-β2编码区之前73个核苷酸(上至PstⅠ位点)(Webbetal.，1988，DNA7∶493-497;Hanksetal.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85∶79-82)的双链DNA片段。该合成的片段在其5′端有一HindⅢ位点，从而有利于连接。
用PstⅠ和StyⅠ消化质粒pBSC40，1/β2(414)得到TGF-β2前体编码区和3′非转译区的其余部分。用XhoⅠ消化在XhoⅠ位点间缺少多聚衔接子的质粒pπH3M(AruffoandSeed，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84∶8573-8577)，用Klenow片段填补末端，用HindⅢ消化并与上述两片段连接，得到编码TGF-β2前体的pβ2′。
为了在COS细胞中表达，将TGF-β1和杂合TGF-β1(NH2)/β2(COOH)编码顺序插入上述pπH3M载体中，得到pβ1′和pβ1/β2′。包含在pβ1′、pβ2′和pβ1/β2′内的TGF-β编码区如图10A所示。DNA连接、MC1061/p3细胞转化，及COS细胞转染均按已述方法进行(Seed and Aruffo，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84∶8573-8577)，其中所作改动包括在含106个细胞的100mm平皿内，使用5ml转染材料于37℃下转染2.5小时。在DMEM+10%FBS中保温48小时后，改换无血清DMEM培养基。在收获条件培养液之前，将已转染的细胞再保温48小时。
9.1.3.重组蛋白质的分析由转染细胞中收集无血清无细胞的条件培养基，对0.2M乙酸透析并按上文8.1.5.节中所述方法检测对貂肺细胞的生长抑制作用。同时按上文8.1.8.节所述，使用抗成熟TGF-β2区内肽顺序395-407的抗血清(抗-TGF-β2395-407)通过免疫吸印法分析重组蛋白。抗-TGF-β2395-407抗血清是对TGF-β2特异的，并且与TGF-β1无交叉反应(图10C，泳道1);抗-TGF-β2392-407的所有反应活性可被过量肽阻断(图7A，泳道3)。
9.2.结果用含编码TGF-β1、TGF-β2和TGF-β1(NH2)/TGF-β2(COOH)蛋白质之cDNA的质粒转染COS细胞，导致潜在成熟形式之TGF-β1和TGF-β2的分泌。测定生物学活性之前须先酸化，以激活由转染之COS细胞分泌的蛋白质产物，其结果与使用分泌rTGF-β1之转染的CHO细胞所得结果相一致(Gentryetal.，1987，Mol.Cell.Biol.7∶3418-3427)，此提示分泌与前体分子相关之潜在成熟TGF-β2并不是CHO细胞的表达特性。
图10A中给出了包括于pβ1′、pβ2′和pβ1/β2′中的TGF-β蛋白质区的线形图。分别用各质粒转染COS细胞并用免疫吸印法分析无血清上清液。图10B中显示当使用抗TGF-β1369-381于还原条件下进行免疫吸印分析时，可见用pβ1′转染的细胞分泌成熟的12KD TGF-β1单体(图10A中带C)以及45-55KD前体(图10A中带a)。这些蛋白质与用表达TGF-β1 cDNA之质粒转染的CHO细胞所产生的蛋白质相似(Gentry et al.，1987，Mol.Cell.Biol.7∶3418-3427)。应提到的是，用该抗血清没有检测出不含成熟TGF-β1的带b。
用pβ1/β2′转染的COS细胞分泌成熟的12KD TGF-β2单体及较高分子量(45-55KD)的TGF-β2，两者均可由抗TGF-β2395-407检测出来(图10C，泳道2)。在非还原条件下分析表明，这些细胞分泌24KD TGF-β2二聚体及高分子量前体蛋白质(图10D)。抗-TGF-β2395-407抗血清似乎是对TGF-β2特异的，因为经检测它与rTGF-β1蛋白质没有交叉反应性(图10C，泳道1)，当在还原条件下分析时，发现用pβ2′转染的COS细胞也分泌12KDTGF-β2单体及50KD前体蛋白质(图10E，泳道1)。值得注意的是，用pβ1/β2′转染的细胞(图10E，泳道2)比用pβ2′转染的细胞(图10E，泳道1)产生有更高分子量的前体蛋白质。
表1显示由转染之COS细胞分泌的生物学活性TGF-β1和TGF-β2;在分析之前，检测最大生长抑制活性须有一酸化步骤。
表1转染的COS细胞之条件培养基中的生长抑制活性活性;Pg/μL1+酸-酸pβ1′11.80.3pβ2′93.00.9pβ1/β2′8.3＜0.11用pβ1′、pβ2′和pβ1/β2′转染COS细胞;转染48小时后，上清换成无血清培养基48小时后，收集条件培养基，对0.2M乙酸(+酸)或50mM NH4HCO3，pH7.4(-酸)透析，并按上文8.1.5.节所述方法分析对CCL64细胞的生长抑制活性。
10.实施例猴TGF-β2和414氨基酸猴TGF-β2前体在中国仓鼠卵细胞内的高水平表达下面描述成熟TGF-β2和414氨基酸TGF-β2前体在中国仓鼠卵细胞内的高水平表达，所说的卵细胞是用处于SV-40启动子调节控制下的编码猴TGF-β2(414)前体及二氢叶酸还原酶的重组质粒转化的。用氨甲喋呤放大表达导致了分泌高水平成熟TGF-β2及高分子量前体复合物之克隆的分离。对已分泌之TGF-β2前体的初步分析表明，它们的前区是糖基化了的，并且含有甘露糖-6-磷酸。
10.1材料和方法10.1.1.细胞培养按上文8.1.1.节所述增殖二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷性中国仓鼠卵(CHO)细胞。
10.1.2.DNA操作及质粒构建按Maniatis等人(1982，上述文献)所述方法进行标准DNA操作。
按下述方法构建编码猴TGF-β2-414和DHFR的表达质粒pTGF-β2(414)用编码猴TGF-β2-414的pBSC-40-1(上文7.2.节)构建pEMBL中的第二个TGF-β2基因，该基因在编码顺序的PstⅠ位点，即转译起始位点的74碱基对下游处开始，并终止在转译终止编码子TAA后100碱基对处的StyⅠ位点。用StyⅠ消化pBSC-40-1，用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段修成平头，并用SphⅠ消化。分离所得到的具有SphⅠ-StyⅠ(平头)末端的298bp片段。同时用PstⅠ和SphⅠ消化pBSC-40-1并分离976bp片段。将这两个片段连接到已用PstⅠ和SmaⅠ消化过的pEMBL中，得到pβ2(Pst-Sty)。
然后用EcoRⅠ消化pβ2，用Klenow酶处理，并用PstⅠ消化，作为一个片段从pβ2(Pst-Sty)中分离TGF-β2编码顺序。将此仍缺失前73个TGF-β2编码核苷酸的1.3Kb片段连接到pSV2-neo中;该质粒事先已用HindⅢ和HpaⅠ消化(已除去neo基因)，并连有包含5′非转译顺序之92个核苷酸和TGF-β2编码顺序之初始73个核苷酸(达到PstⅠ位点)的合成的双链DNA片段(上文9.1.2.节，Madisenetal.，1989，DNA8∶205-212)。用所得连接产物构建表达载体pTGF-β2(414)，即包含编码TGF-β2-414及DHFR基因的pSV2表达载体。
10.1.3.DNA转染和氨甲喋呤抗性细胞的选择基本上按已述方法(Gentry et al.，1987，Mol.Cell.Biol.7∶3418-3427)将pTGF-β转染到CHO细胞中并得到放大的克隆。转染后，用含有10%FBS和150μg/ml L-脯氨酸及0.3mg/ml谷氨酰胺的DMEM替换非选择性F-12培养基，以选择表达DHFR的细胞。摘取并分散菌落，将105个细胞接种在100mm组织培养皿上，加入0.1μM氨甲喋呤驯化之。用胰酶消化并以1∶5脱落比例进行三次传代。此时，105个细胞在含0.5、2.5、10.0和50.0μM氨甲喋呤培养基中连续驯化。在96小井平板上用有限稀释法克隆细胞系。然后分离出两个分别生长于10μM和50μM氨甲喋呤中的克隆，β2(414)Cl.32和β2(414)Cl.35。选择两个约分泌5μM/ml TGF-β2的克隆作进一步定性分析。以下将分泌rTGF-β1的CHO细胞克隆称为β1Cl.17;分离该克隆并按已述方法(Purchio et al.，1988，J.Biol.Chem.263∶14211-14215)在20μM氨甲喋呤中增殖。
10.1.4.Northern印迹分析在1%琼脂糖-甲醛凝胶上分离总细胞RNA(Lehrach et al.，1977，Biochemistry16∶4743-4751)、转移到尼龙膜(Hybond，Amersham)上并与〔32P〕标记的探针(pPC-21(2.3Kb))杂交(参见上文6.1.3节)。
10.1.5.用PAGE和二维电泳法分析分泌的蛋白质按已述方法用〔32S〕-半胱氨酸加〔35S〕-蛋氨酸、〔3H〕-葡糖胺和〔32P〕-正磷酸标记无血清和细胞的条件培养基(Brunner et al.，1988，Mol.Cell.Biol.8∶2229-2232)，并于还原和非还原条件下，在15%或7.5-17.5%聚丙烯酰胺凝胶上以PAGE法分析之。对含〔35S〕和〔3H〕的凝胶作荧光照相，然后对Cronex-4X线胶片曝光。按已述方法(Cooper et al.，1983，Methods Enzymol.99∶387-402)对〔32P〕标记之蛋白质的酸水解产物作二维电泳分析。
10.1.6.免疫印迹分析和抗肽抗体按上文8.1.7.节所述方法，得到抗成熟TGF-β2区域内TGF-β2-414肽顺序367-379的抗肽抗血清(抗TGF-β2(414)-367-379，图12A)。对该抗血清已作过定性分析并证明是对TGF-β2特异的它不与TGF-β1反应，且所有反应活性均可被过量未标记的肽所阻断(参见上文第9节;应说明的是，第9节中称为抗TGF-β2395-407的该抗血清，其残基序号相当于442氨基酸TGF-β2前体)。按前述方法(上文8.1.7.节)产生抗位于TGF-β2(414)之前区内的相当于氨基酸51-66之肽顺序的抗肽抗血清(抗TGF-β2(414)51-66，图12A)。抗TGF-β1前体之前区和成熟区的抗-TGF-β181-91和抗TGF-β1369-381抗肽抗血清已在文献中作过描述(Gentryet al.，1987，Mol.Cell.Biol.7∶3418-3427)。将会合细胞在无血清培养基中洗3次并在无血清培养基中保温24小时;无血清和细胞的条件培养基对0.2M乙酸透析并按8.1.8.节所述用免疫印迹法分析。
10.1.7.生长抑制试验使细胞在100mm平皿上生长会合，并用无血清培养基洗3次;然后加入5ml无血清培养基保温24小时。收集培养基对0.2M乙酸或50mM NH4HCO3(pH7.0)透析，并按8.1.5.节中所述分析对貂肺细胞的生长抑制作用。该试验中，TGF-β1和TGF-β2有相似的比活性。
10.1.8.重组蛋白质的纯化和顺序分析用乙酸酸化β2(414)Cl.32细胞的无血清和无细胞条件培养基(每升培养基56ml水乙酸)，然后对0.2M乙酸透析。用1NNaOH将溶液pH调至4.0并以25，000×g离心澄清之。将上清液加于装有预先用50mM乙酸钠(pH4.0)平衡过的CM-Trisacryl柱(1×12Cm)上。使用溶于起始缓冲液的线性0-1M氯化钠梯度洗脱rTGF-β2。合并含rTGF-β2的各管，并加于预先用0.5%三氟乙酸(TFA，溶于水中)平衡过的Vydac柱(4.6×250mm)上。使用含0.05%TFA的线性25-35%乙腈梯度洗脱rTGF-β2。
为进行氨基酸顺序分析，用溶于100μl含6M酸盐胍和0.1%Na2EDTA之0.4MTris-HCl缓冲液(pH8.5)的20mM二硫苏糖醇于50℃下将rTGF-β2还原2小时，然后于23℃下用100mM4-乙烯吡啶处理18小时，使之产生S-吡啶基乙基化。用20%TFA将反应混合物酸化至pH2.0，并用反相HPLC法(Marquardt et al.，1987，J.Biol.Chem.262∶12127-12131)除盐。为在蛋氨酰残基处裂解，用溶于70%甲酸的CNBr处理60pMS-吡啶基乙基化的rTGF-β2。按已述方法(Marquardt et al.，1987，J.Biol.Chem.262∶12127-12131)用475A型氨基酸顺序仪(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，California)进行自动顺序分析。
10.2.结果10.2.1.以潜在形式分泌的重组TGF-β2按上文10.1.3.节所述，用pTGF-β2(414)转染CHO细胞并用氨甲喋呤扩增。选择在96小井平板内经有限稀释法分离的两个克隆β1(414)Cl.32和β2(414)Cl.35，以进行进一步定性分析。图11A和11B显示β2(414)Cl.32约分泌5μg/mlrTGF-β2，且在检测最大活性之前须用酸活化。对β2(414)Cl.35的分析也获得了相似的结果。Northern印迹分析表明，β2(414)Cl.32细胞含有一大的、在正常CHO细胞中检测不到的1.9KbTGF-β2特异性RNA(图11C)。
10.2.2.对转染之CHO细胞分泌的重组TGF-β2蛋白质的分析图12A显示了可诱导抗肽抗体产生的TGF-β2-414前体区域。抗TGF-β2(414)367-379是对TGF-β2特异的，其不与TGF-β1反应，且可用过量的肽阻断所有免疫反应活性。抗-TGF-β2(414)51-66也具有相似的特异性。
图12B显示对β2(414)Cl.32细胞分泌之TGFβ2相关蛋白质所作免疫吸印分析的结果;为便于比较，靠近其旁边的是由β1Cl.17细胞分泌的TGF-β1特异性蛋白质。用SDS-PAGE法在还原条件下分离蛋白并用抗TGF-β181-94抗体进行免疫印迹分析，表明β1Cl.17细胞分泌包含前FGF-β1的44-56KD蛋白质(图12B，泳道1，带a)以及包含TGF-β1之前区的30-42KD蛋白质(带b)。用抗TGF-β2(414)51-66检测表明β2(414)Cl.32细胞也分泌这个分子量范围的蛋白质(图12B，泳道2)。但相对于被裂解的前TGF-β2前体区(带b)，β2(414)Cl.32细胞比β1Cl.17细胞分泌较少的未裂解之前-TGF-β2(带a)。当用抗TGF-β1前体成熟区的抗肽抗体进行免疫印迹分析时，在β1Cl.17细胞的条件培养基上清中则检测到44-56KD前TGF-β1蛋白(图12B，泳道3，带a)及12KD TGF-β1单体(带b)。抗TGF-β2(414)367-379也能检测出β2(414)Cl.32细胞之培养物上清中的45-56KD蛋白质(图12B，泳道4，带a)和12KDTGF-β2单体(带c)，此结果提示带a含有TGF-β2特异性顺序的成熟区和前区，而带b只含有前区顺序(参见图12A)。应注意的是，与β1Cl.17细胞的培养物上清相比，β2(414)Cl.32细胞之上清中带a的蛋白量高于带c。
当于非还原条件下用SDS-PAGE法分级分离，并用抗FGF-β181-94以免疫印迹法分析β1Cl.17细胞的条件培养基上清时，可检测到一大的90-110KD蛋白质产物(图12C，泳道1)。使用抗-TGF-β2(414)51-66对β2(414)Cl.32细胞的条件培养基作同样分析，可见到90-110KD蛋白质及成熟的24KD TGF-β1二聚体(图12C，泳道3)，TGF-β2(414)367-379可检测出β2(414)Cl.32细胞之条件培养基上清中的带Ⅰ和Ⅱ以及成熟的TGF-β2(图12C中箭头所指者)(图12C，泳道4)。因为该抗血清不能检测到带Ⅲ，故可证明其缺乏成熟的TGF-β2顺序，并且只包含前区二聚体。
图12D和12E显示于非还原(图12D)和还原(图12E)条件下，用SDS-PAGE法分离〔35S〕-半胱氨酸和〔35S〕-蛋氨酸标记的条件培养基后，对β1Cl.17、β2(414)Cl.32和β2(414)Cl.35细胞分泌之总蛋白所作分析的结果。可以看出，与β1Cl.17细胞的条件培养基上清相比，β2(414)Cl.32和β2(414)Cl.35细胞相对于带C(图12E)所示，成熟TGF-β2(图12D箭头所指)量增加了，而带a的量则减少了。另外，TGF-β2相关蛋白质代表了大部分由β2(414)Cl.32和β2(414)Cl.35细胞分泌的总蛋白质。
10.2.3.rTGF-β2前体前区的糖基化和磷酸化使重组TGF-β1前体在前区内的三个位点上糖基化，并使其中的两个位点含甘露糖-6-磷酸(M-6-P)(Brunner et al.，1988，Mol.Cell.Biol.8∶2229-2232;Purchio et al.，1988，J.Biol.Chem.263∶14211-14215)。为了确定在TGF-β2-414前体中发生了同样的修饰作用，用〔3H〕-葡糖胺和〔32P〕-正磷酸标记β2(414)Cl.32细胞并用SDS-PAGE法分析无血清和无细胞条件培养基。图13显示TGF-β2前体的前区已被磷酸化(图13，泳道2)和糖基化(图13，泳道4)。用免疫印迹法推断(图12)，图13泳道4中见到的高分子量材料可能与TGF-β2前体无关，而且在用〔3H〕-葡糖胺标记的β2(414)Cl.35细胞之条件培养基中也未测出;它很可能是该特定克隆分泌的非特异性产物。同TGF-β1一样，TGF-β2 12KD单体中没有见到〔32P〕或〔3H〕-葡糖胺标记物。
图14A显示对〔32P〕标记之rTGF-β1前体的酸水解物所作二维电泳分析的结果，其中标示了该分子内所含M-6-P残基的迁移位置。对〔32P〕标记的前TGF-β2-414(由β2(414)Cl.32细胞分泌的)所作同样分析显示，标记物并不与P-Ser、P-Thr或P-Tyr共迁移(图14B)，但与M-6-P共迁移(图14C)。
10.2.4.成熟重组TGF-β2的纯化与顺序分析按上文10.1.8节所述，由β2(414)Cl.32的无血清条件培养基中纯化成熟的rTGF-β2。图15显示于还原条件下作为12KD蛋白质迁移(图15，泳道1)、于非还原条件下作为24KD蛋白质迁移(图15，泳道2)的纯化蛋白质与纯化的rTGF-β1(图15，泳道3)完全相同。经蛋白质顺序分析(表2)进一步鉴定rTGF-β2。用溴化氰于残基104处裂解S-吡啶基乙基化的rTGF-β2，同时测定所得两个肽链的顺序一个相当于氨基末端顺序，另一个则相当于羧基末端顺序105-112。结果表明，生物学活性rTGF-β2已在预期裂解位点上得以正确加工。
表2rTGF-β2的氨基酸顺序数据HPLC纯化的rTGF-β2氨基末端羧基末端产率位置产率位置(pmol)(残基)(pmol)(残基)56.11(Ala)58.7105(Ile)82.32(Leu)77.7106(Val)55.83(Asp)62.1107(Lys)70.24(Ala)34.7108(Ser)79.35(Ala)53.0109(Cys)51.56(Tyr)39.8110(Lys)38.0 7(Cys)138.0 111(Cys)143.48(Phe)14.8112(Ser)
1.用CNBr裂解S-吡啶基乙基化的rTGF-β2。
按表中第一行(56、1pmolPTHAla-1和58.7pmolIle-105)和第7行(76.0pmolPTHCys-7和PTHCys-111)所示产率，顺序rTGF-β2(1-104)和rTGF-β2(105-112)几乎是以等摩尔产率得到的。
11.微生物保藏下列微生物已保藏在AgriculturalResearchCultureCollection，NorthernRegionalResearchCenter(NRRL)，其保藏登记号分别是微生物质粒登记号大肠杆菌HB101pPC-21B-18256大肠杆菌HB101pPC-14B-18333大肠杆菌HB101pBSC-40-1B-18335大肠杆菌HB101pBSC-40-16B-18334下列转化体已保藏在AmericanTypeCultureCollection，Rockville，MD，其保藏登记号分别是转化体质粒登记号中国仓鼠卵细胞pSV2/β1-β/dhfrCRL9800(CHO)1β9，12.5cl.36中国仓鼠卵细胞(CHO)β2(414)pTGF-β2(414)cl.32
本发明不仅限于已保藏的细胞系及本文公开的实施方案，这些不过是作为举例说明本发明的一个方面而给出的，它们的功能上的等同物均应包括在本发明的范围内。事实上，除本文所描述者外，根据上面的描述所作的各种改动对本领域内技术人员来说均应是显而易见的。这些改动也应落入本发明待批权利要求的范围内。
还应说明的是，本文给出的碱基对和氨基酸残基数目及核苷酸和肽的大小都是近似数值，并只用于描述之目的。
权利要求
1.编码转化生长因子β2前体的核苷酸顺序，其包含基本上如图1a所示约从核苷酸残基1到核苷酸残基1326的核苷酸编码顺序。
2.编码转化生长因子-β2前体的核苷酸顺序，其包含基本上如图1a所示约从核苷酸残基1至核苷酸残基1326的核苷酸编码顺序，其中缺失从核苷酸残基346至432并被核苷酸顺序“AAT”所取代。
3.编码成熟之转化生长因子-β2的核苷酸顺序，其包含基本上如图1a所示约从核苷酸残基991至核苷酸残基1326的核苷酸顺序。
4.转化生长因子-β2前体，其包含基本上如图1a所示约从氨基酸残基1至氨基酸残基442的氨基酸顺序。
5.转化生长因子-β2前体，其包含基本上如图1a所示约从氨基酸残基1至氨基酸残基442的氨基酸顺序，其中缺失氨基酸残基116至144并由单一的天冬酰胺残基所取代。
6.转化生长因子-β2前体，其包含基本上如图1a中所示约从氨基酸残基20至氨基酸残基442的氨基酸顺序。
7.转化生长因子-β2前体，其包含基本上如图1a中所示约从氨基酸残基20至氨基酸残基442的氨基酸顺序，其中缺失氨基酸残基116至144并由单一天冬酰胺残基所取代。
8.转化生长因子-β2，其包含基本上如图1a中所示约从氨基酸残基331至442的氨基酸顺序。
9.编码转化生长因子-β2前体的核苷酸顺序，其包含基本上如图1b中所示约从核苷酸残基-70至1755的核苷酸编码顺序。
10.转化生长因子-β2前体，其包含基本上如图1b中所示约从氨基酸残基1至390的氨基酸顺序。
11.转化生长因子-β2前体，其包含基本上如图1b中所示约从氨基酸残基30至390的氨基酸顺序。
12.转化生长因子-β2，其包含基本上如图1b中所示约从氨基酸残基279至390的氨基酸顺序。
13.一种生产转化生长因子-β2的方法，包括(a)培养含编码转化生长因子-β2之核苷酸顺序的真核细胞，所说的编码顺序处于第二个调节基因表达的核苷酸顺序的控制下，从而可由所说的真核细胞产生有转化生长因子-β2活性的肽或蛋白质;(b)由培养物中回收转化生长因子-β2。
14.根据权利要求13的方法，其中编码转化生长因子-β2的核苷酸顺序包含基本上如图1a所示之核苷酸1至1339的核苷酸顺序。
15.根据权利要求13的方法，其中编码转化生长因子β-2的核苷酸顺序基本上是包含如图1b中所示核苷酸-70至1755的核苷酸顺序。
16.根据权利要求13的方法，其中真核细胞包括中国仓鼠卵细胞。
17.根据权利要求13的方法，其中真核细胞包括COS细胞。
18.根据权利要求13的方法，其中控制基因表达的第二个核苷酸顺序是SV40启动子。
19.根据权利要求13的方法，其中第二个核苷酸顺序包括启动子和编码该真核细胞缺少之可选择标志的顺序，从而可以鉴定含转化生长因子β2编码顺序的真核细胞。
20.根据权利要求19的方法，其中可选择标志包括二氢叶酸还原酶。
21.根据权利要求20的方法，其进一步包括使真核细胞与氨甲喋呤接触，以便选择含有放大水平之二氢叶酸还原酶和转化生长因子-β2编码顺序的抗性菌落。
22.根据权利要求21的方法，其中真核细胞包括二氢叶酸还原酶缺陷性中国仓鼠卵细胞。
23.一种生产转化生长因子-β2的方法，包括(a)培养保藏于ATCC且保藏登记号为CRL9800的转化株CHO-1β9，12.5，CL36;以及(b)由培养物中回收转化生长因子-β2。
24.根据权利要求20的方法，其中转化株被培养在有氨甲喋呤的培养基中。
25.一种生产转化生长因子-β2的方法，包括(a)培养保藏于ATCC且保藏登记号为_的转化株CHOβ2(414)Cl.32;以及(b)由培养物中回收转化生长因子-β2。
26.根据权利要求25的方法，其中转化株被培养在加有氨甲喋呤的培养基中。
27.含有编码转化生长因子-β2之核苷酸顺序的真核细胞，所说的编码顺序处于调节基因表达的第二个核苷酸顺序的控制下，以便该真核细胞产生活性转化生长因子-β2。
28.根据权利要求27的真核细胞，其中编码转化生长因子-β2的核苷酸顺序包含基本上如图1b所示从核苷酸-70至1755的核苷酸顺序。
29.根据权利要求28的真核细胞，其中编码转化生长因子-β2的核苷酸顺序包含基本上如图1a中所示从核苷酸-467至2111的核苷酸顺序。
30.根据权利要求27的真核细胞，其包括中国仓鼠卵细胞。
31.根据权利要求27的真核细胞，其包括COS细胞。
32.根据权利要求27的真核细胞，其中控制基因表达的第二个核苷酸顺序包括SV40启动子。
33.根据权利要求27的真核细胞，其中第二个核苷酸顺序包括启动子和编码该真核细胞缺乏之可选择标志的顺序，从而可以鉴定含猴转化生长因子-β2编码顺序的真核细胞。
34.根据权利要求33的真核细胞，其中可选择标志包括二氢叶酸还原酶。
35.根据权利要求34的真核细胞，其包括二氢叶酸还原酶缺陷性中国仓鼠卵细胞。
36.包括保藏于ATCC且保藏登记号为CRL9800之CHO-1β9，12.5，克隆36的细胞系。
37.包括保藏于ATCC且保藏登记号为_之CHOβ2(414)克隆32的细胞系。
38.一种基本上纯的多肽，其包含基本上如图1b所示约从氨基酸残基279至390的氨基酸顺序。
39.一种治疗体内肿瘤的方法，其包括给予杀肿瘤有效剂量的转化生长因子-β2。
40.一种加强伤口愈合的方法，其包括给予刺激细胞增殖有效浓度的含重组转化生长因子-β2的组合物。
全文摘要
公开了编码TGF—β2的CDNA克隆，该克隆可用于构建能在转染的中国仓鼠卵细胞及COS细胞内高水平表达成熟之生物学活性TFG—β或其前体的表达载体。还公开了以高水平分泌TGF—β2的CHO和COS细胞转化株。用携带完整414氨基酸猴TGF—β2前体编码顺序之质粒载体转染的CHO细胞，每毫升培养物约分泌5μg表达产物。
文档编号C07K14/495GK1045992SQ8910981
公开日1990年10月10日 申请日期1989年12月16日 优先权日1988年12月16日
发明者安东尼·F·珀切尔, 琳达·麦迪逊, 南希·韦布 申请人:安柯金两合公司