专利名称：在凝血反应中有治疗活性的新型肽化合物，其制备方法及其药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及在凝血反应中有治疗活性的新型肽化合物及其制备方法和含该化合物的药物组合物。
众所周知，当血液中的促凝血因子和抗凝血因子之间的平衡被破坏时，就会导致血栓或血块的形成。促使血栓形成的主要病原因素有三个血流滞止或流速降低、凝固性高和血管壁内皮损伤。为防止这些发病机理的发生，确立一种以抗凝血药物为基本要素之一的治疗方法是可取的。
抗凝血剂确实可以用于治疗严重的静脉血栓形成、肺栓塞、四肢动脉栓塞、动脉血栓形成(如心肌梗塞)、动脉粥样硬化及所有其它血栓栓塞病症；抗凝血剂也可用于维持血液环境稳定，尤其是在体外循环中。
在已知的抗凝血剂当中，水蛭素，含有65个氨基酸的多肽，是从药物水蛭的唾液腺提取得到的一种专一的凝血酶抑制剂(Biochem.25，4622-28，1986)。
各种可用作凝血酶抑制剂的水蛭素均已得到过报导。专利EP209061或EP332523所报导的化合物就是一个例子。而且，一些人工合成的具有抗凝血性质的水蛭素片段的类似物也曾有过报导，专利EP276014、EP291981、EP291982和EP333356中要求的化合物即属此类。与天然样品相比，这些较短的肽段(10到20个氨基酸)具有“更易于控制”，尤其是合成更简单的优点。
最近，欧洲专利申请EP0,372,503报导了一些和水蛭素结构相似的肽，在这些肽化合物中一个天然的氨基酸被一个人工合成的氨基酸所取代。申请EP0,443,598所报导的与水蛭素结构相似的肽中是一个天然氨基酸被一个磺化的或磷酰化的衍生物所取代。
专利申请PCT 91/01328、EP443429报导了一些水蛭素类似物，其修饰不仅涉及引入非天然氨基酸，而且还引入磺酰-氧代或膦酰-氧代氨基酸。
本发明更具体地涉及式(I)的化合物H-phe-A1-Arg-Pro-(Gly)4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu-A2-Leu-glu-OH (I)其中，A1代表一个脯氨酸残基(Pro)、八氢吲哚-2-羰基(Oic)、2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羰基(Abh)或2-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-羰基(Abo)；A2代表一个对位或间位被一个PO3H2基团取代的苯丙氨酸残基(Phe(pPO3H2)，Phe(mPO3H2))；它们与药学上可接受的酸或者碱的加合盐，肽序列上的每一个氨基酸都是光学纯的，每一个氨基酸的碳原子都具有D或L构型。
没有任何限制意义，可以提及的药学上可接受的酸有盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、富马酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、抗坏血酸、草酸、甲磺酸和樟脑酸等等；可提及的药学上可接受的碱有氧氧化钠、氢氧化钾、三乙胺和叔丁基胺等等。
本发明还进一步涉及式(I)衍生物的制备方法，其制备方法有很多种，如顺序固相合成、液相肽段缩合合成、酶促合成、克隆并在转化细菌中表达基因的遗传合成，或上述各种方法的结合。
B.W.ERICKSON和R.B.MERRIFIED曾报导过固相肽合成的一般方法(“The Proteins”，Solid-Phase Peptide Synthesis，3rd edi-tion，257-527，1976)。
固相肽合成可以在自动化仪器上进行，这种自动化仪器以一种反复的程序控制方式执行去保护、缩合和洗涤的循环操作，从而把氨基酸按顺序接成肽链。氨基酸(最好是C-末端的氨基酸)被连接到树脂上。通常用于制备多肽的树脂最好是以0.5-3.0％的苯二乙烯与聚苯乙烯交联，并供以一些活性残基如氯亚甲基或羟亚甲基，使得第一个氨基酸以共价键连接到树脂上。选用合适的树脂就可使羧酸、酰胺或醇等C-末端功能团连接到树脂上。
氨基酸在控制仪的控制下一个一个按顺序接入。每接一个氨基酸需要一个合成循环，每个循环要经过以下步骤去保护(最好是肽链的N-末端去保护)，连续洗涤(为除试剂或溶胀树脂)，氨基酸活化与缩合以及重新洗涤。每个循环之后紧接着一次过滤，过滤由装在合成反应器中的烧结多孔玻璃来完成。肽合成所用的缩合剂通常是二环己基碳二亚胺(DCC)、羟基苯并三唑(HOBT)、苯并三唑-1-基-氧基三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)或二苯基磷酰基叠氮化物(DPPA)。
另外还可使用形成混合酸酐的活化方法。
每次放入反应器的氨基酸大约是树脂取代度的四倍，与缩合剂的量大致相当。缩合反应可在其合成的每一阶段用E.KAISER等人报导的茚三酮反应试验来检测(Analyt.Biochem.，34，595，1970)。
在树脂上组装肽链后，在苯甲醚、乙二硫醇或2-甲基吲哚存在下用强酸如三氟乙酸或氢氟酸处理，使肽与树脂脱离，同时肽链的一些保护基也可能被切除。所得产物用常规提纯技术纯化，一般使用色谱技术。
本发明肽也可用液相法制备先在固相或溶液相中制备肽段，再选择性地保护肽段，最后在溶液中缩合肽段。除了不必将肽链接到树脂上之外，液相法与固相法基本相似，也要使用保护基并利用它们不同的稳定性。例如C-末端的羧基可用甲酯或酰胺功能团保护。缩合肽段的活化方法也与固相法类似。
式(I)化合物具有非常优越的药理特性。它们具有抗凝血和抗血栓形成的性能，能够溶解血块从而防止血栓栓塞后并发症的发生它们也可直接用作速效抗凝血剂，防止血栓形成的扩张。药理学试验结果表明本发明化合物具有比参比化合物hirulog-1(J.M.MARAGANORE et al.，Biochem.，29，7095-7101，1990)更高的抗血栓形成活性，活性更高是因为它对凝血酶催化位点的抑制作用更强。
本发明的主题还有以本发明化合物作为活性成分的药物组合物。这些药物组合物至少要包含一种具有通式(I)结构的化合物或其与药学上可接受的酸或碱的加合盐，它们可单独使用或者与一种或多种的非毒性惰性赋形剂或载剂结合使用。
在本发明的药物组合物中，要特别提到的是那些适于口服、肠胃外投药、鼻内投药及可制成普通药片、糖衣片、舌下片、贴剂、急救包、胶囊、glossettes、锭剂、栓剂、乳膏、软膏、皮凝胶、气雾剂、供口服和注射的安瓿剂等药物组合物。
剂量大小要根据患者的年龄、体重、病种、病情轻重以及投药方式而定。
可以口服、鼻内投药、直肠投药或肠胃外投药。通常一次治疗的剂量在0.05-0.3mg之间，可以每24小时一次投药或均分几次投药。
下面举例说明本发明，但不限制本发明。
在下面的实例中，氨基酸的缩写以大写字母开头的是L构型，以小写字母开头的是D构型。
称做Abo的氨基酸是3S构型。
称做Oic的氨基酸是2S、3aS、7aS构型。
Phe(pPO3H2)代表残基 Phe(m PO3H2)代表残基
在制备A中所描述的化合物是合成式(I)化合物的中间体。制备AN-Fmoc-4-(二甲氧磷酰基)-L-苯丙氨酸(或Fmoc-Phe(p PO3(Me)2)步骤AN-Boc-4〔((三氟甲基)磺酰基)氧基〕-L-苯丙氨酸苄酯向冰浴冷却下的含有6.8mmol的N-Boc-L-酪氨酸苄酯和7.4mmol的苯基二((三氟甲基)磺酰基)胺和10ml二氯甲烷的溶液中，逐滴加入7.4mmol的三乙胺，于0℃搅拌混合物1小时，室温下搅拌2小时。加入60ml乙醚后，依次用水、1N氢氧化钠、水、饱和氯化钠溶液洗涤有机相，然后干燥并蒸发。最后以80/20的戊烷/乙酸乙酯作洗脱剂，在硅胶柱上层析纯化，即得到所要的油状产物。步骤BN-Boc-4-(二甲氧磷酰基)-L-苯丙氨酸苄酯取1.1mmol上步所得的化合物、1.4mmol甲基吗啉、1.32mmol的(EtO)2POH和0.032mmol的Pd(O)(p PH3)4悬浮于3ml无水乙腈中，于70℃，N2气下搅拌15个小时。冷却后，加入40ml乙酸乙酯，分别用5％柠檬酸和10％的碳酸氢钠溶液洗涤有机相，然后干燥、蒸发。用3/7的乙酸乙酯/戊烷作洗脱剂，在硅胶柱上层析纯化后，得到所要的油状产物。步骤CN-Boc-4-(二甲氧磷酰基)-L-苯丙氨酸将含有14.4mmol上步所得的化合物在60ml甲醇和40ml水中的溶液在氢气压下，用10％的钯/碳作催化剂还原。过滤并蒸干溶剂后，得到油状产物。步骤DFmoc-Phe(p PO3(Me)2)
上步所得的化合物用B.Gutte等人(J.Biol.Chem.，246，1922-1941，1971)报导的方法脱除保护基，用Carpino等人(J.Org.Chem.，37，3404-3409，1972)报导的方法接上Fmoc基团。实施例1H-Phe-Pro-Arg-Pro-(Gly)4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-(Glu)2-Phe(pPO3H2)-Leu-glu-OH实例1化合物的合成是在0.33mmol/g的Fmoc-glu(OtBu)-OH取代的2g树脂上，按照下列重复过程进行
合成反应在事先已装入多孔玻璃的玻璃槽(即反应器)中进行，每一步操作都在30ml的溶剂中于室温搅拌下完成，并紧接着经多孔玻璃过滤。树脂保留在过滤器上，逐步延长的肽链就连在树脂上。
按以下顺序连接所选的被保护氨基酸Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Phe(pPO3Me2)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Abo-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Asn-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Arg(Pmc)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-phe-OH.
在30ml DMF中溶解2.64mmol(4当量)的被360mg HOBT保护的氨基酸，再于室温下30分钟后加入618mg DCC，活化每一循环中待缩合(操作6)的氨基酸。然后随即将溶液转到含10ml二氯甲烷的反应槽中。
一般用95％三氟乙酸(TFA)，在苯甲醚或乙二硫醇的存在下处理树脂，再用含90％TFA、5％(CH3)3SiBr和5％茴香硫醚的溶液选择性去除磷酸酯基的甲基而脱保护，便得到所要的产物。经制备性高效液相色谱(HPLC)纯化后，冷冻干燥此肽。
用6N盐酸于110℃水解所得产物(肽)18个小时，使其分解为氨基酸，再用HPLC对氨基酸进行定量分析。
Arg Gly Asp+Asn Phe Glu Aso+Ile Pro Leu计算值 15 2 24 2 31实测值 1.04 4.9 2.01 1.89 4.27 1.82 3.02 1.03质谱(FAB)MH+，m/2＝2381以下各实例中化合物的制备方法同实施例1所述。实施例2H-phe-Oic-Arg-Pro-(Gly)4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-(Glu)2-Phe(pPO3H2)-Leu-glu-OHArg Asp+Asn Glu Gly Pro Phe Abo+Ile Leu Oic计算值1 2 4522 2 l 1实测值 0.87 2.08 4.31 5.07 2.13 1.82 1.89 1.08 1.03质谱(FAB)MH+，m/z＝2435实施例3H-phe-Abh-Arg-Pro-(Gly)4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-(Glu)2-Phe(pPO3H2)-Leu-glu-OH实施例4H-phe-Abo-Arg-Pro-(Gly)4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-(Glu)2-Phe(pPO3H2)-Leu-glu-OH实施例5H-phe-Pro-Arg-Pro-(Gly)4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-(Glu)2-Phe(mPO3H2)-Leu-glu-OH
本发明化合物的药理学研究实施例6抗血栓形成活性结扎雄性OFA鼠的下腔脉诱发导致的静脉血栓形成可作为本实验的血栓形成模型，(Millet et al.，Thrombosis Res.，45123-133，1987)。用戊巴比妥钠(50mg/kg i.p.)麻醉试验动物。结扎前15分钟，用本发明物质静脉内处理动物。结扎后25分钟，从下腔取出血块，于60℃干燥24小时，称重。本发明化合物的试验剂量为0.05到1mg/kg，hirulog-1的试验剂量为0.1到1 mg/kg。试验结果表明，本发明物质的血块重减轻量明显大于hirulog-1的减轻量。就此实验模型来说，实施例1化合物的活性是hirulog-1的20倍，实施例2化合物是它的10倍。血块重减轻量％
实施例7抗凝血活性，凝血酶时间和活化脑磷脂时间的测量在标准量凝血酶或活化脑磷脂存在下，正常血浆分别在一定的时间内即凝血酶时间(TT)和活化脑磷脂时间(ACT)内凝固。由药物延长凝血时间反映出抗凝效果。
产物的离体抗凝效果用人血浆检测。穿刺静脉，收集血液到含柠檬酸盐的试管中，经过倾析(1200g，10min)，倾出血小板含量低的血浆，然后进行凝血试验。本发明化合物明显延长了TT和ACT。实施例1化合物在浓度为0.05M时延长TT一倍，在浓度为0.14M时延长ACT一倍。抗凝活性分别高于浓度相应为0.07M和0.2M的hirulog-1。
本发明产物的体外抗凝效果由戊巴比妥钠(60mg/kg i.p.)麻醉的OFA鼠来测试。鼠的颈动脉和颈静脉都插入导管之后，收集1.5cm3的动脉血到0.109M的柠檬酸盐溶液中。30分钟后，将1ml待测物静脉注入。分别在1.5min、3min、5min、15min、30min和60min后收集1.5cm3的动脉血样。每收集一次血样，就重新注射1.5cm3的含柠檬酸盐的生理盐水到鼠体内(颈动脉注射)。本发明化合物显著延长了鼠离体的TT和ACT。所延长时间(倍增因数)明显大于hirulog-1的倍增因数，而且作用期也更长。TT的延长量
ACT的延长量
实施例8对凝血酶和丝氨酸蛋白酶的抑制为测定本发明产物对人凝血蛋白酶(Sigma，比活力3230 NI-HU/mg)的体外抑制活性，分别在有和无试验抑制剂的条件下，于20℃温浴一定量的凝血酶(0.7或0.2nM)10分钟，然后加入人纤维蛋白原(Fg)(纯化的或血浆的)或生色底物H-D-Phe-Pip-Arg-pNA(0.66nM，S2238，Kabi)。
为测定这些物质对不同的凝血丝氨酸蛋白酶的选择性(在体外)，分别对纯人纤维蛋白溶酶(2nM，Stago)、纯人活化因子X(2nM，Stago)、激肽释放酶(2nM，Sigma)、尿激酶(2nM，Sigma)、纤维蛋白溶酶原组织激活因子(t-PA；2nM，Stago)和纯人活化蛋白C(2nM，Stago)进行同样的操作过程，但要用不同的含对硝基苯酰胺肽作底物。抑制剂、酶和底物在同一缓冲液(0.01nM磷酸缓冲液，pH7.4，含0.12M的氯化钠和0.05％牛血清白蛋白)中稀释，然后分配到体积为50ml的聚苯乙烯微孔板中。
于20℃反应15到30min后，在凝血酶作用下形成的纤维蛋白或在丝氨酸蛋白酶作用下释放出来的对硝基苯胺可用分光光度法在450nM处测定。
下列结果表明本发明化合物和hirulog-1分别在纤维蛋白原和生色底物存在下对凝血酶的抑制作用。结果以IG50值表示，即抑制酶活力达50％时所需浓度(nM)。本发明化合物的抑制活性高于hirulog-1，尤其是在生色底物的情况下，这说明了本发明化合物对凝血酶的催化部位的抑制作用更强。
同hirulog-1一样，本发明化合物对凝血酶具有高度选择性，因为它对其它的纤维蛋白溶解和凝血丝氨酸蛋白酶的IC50值都要大于33M。实施例9药物组合物注射溶液注射溶液实施例1化合物5mg注射用蒸馏水适量至25ml药剂1000片的配方实施例1化合物………………………………………………………5g小麦淀粉……………………………………………………………10g玉米淀粉……………………………………………………………10g乳糖…………………………………………………………………60g硬脂酸镁……………………………………………………………2g硅石，羟丙基纤维素………………………………………………2g还需一个额外的包囊以保证盖仑制剂的胃耐受性。
权利要求
1.式(I)化合物H-phe-A1-Arg-Pro-(Gly)4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-Glu-Glu-A2-Leu-glu-OH(I)其中A1代表一个脯氨酸残基(Pro)、八氢吲哚-2-羰基(Oic)、2-氮杂双环[2.2.1]庚烷-3-羰基(Abh)或2-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-羰基(Abo)，A2代表一个对位或间位被PO3H2基团取代的苯丙氨酸残基(Phe(pPO3H2)，Phe(mPO3H2))，它们与药学上可接受酸或碱的加合盐，肽序列上的每一个氨基酸均为光学纯，每一个氨基酸的碳原子都具有D或L构型。
2.如权利要求1所述的式(I)化合物，其中A1代表一个脯氨酸残基(Pro)。
3.如权利要求1所述的式(I)化合物，其中A2代表一个(pPO3H2)苯丙氨酸残基。
4.如权利要求1所述的式(I)化合物，它是H-phe-Pro-Arg-Pro-(Gly)4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-(Glu)2-Phe(pPO3H2)-Leu-glu-OH。
5.如权利要求1所述的式(I)化合物，它是H-phe-Oic-Arg-Pro-(Gly)4-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Abo-Ile-Pro-(Glu)2-Phe(pPO3H2)-Leu-glu-OH。
6.制备权利要求1所述的式(I)化合物的方法，可从被保护氨基酸顺序固相合成，从肽段液相合成或者以上两种方法的结合来获得该化合物，如必要，式(I)衍生物可转变成其与药学上可接受的酸或碱的加合盐。
7.一种药物组合物，它至少包含一种权利要求1到5任一项所述的化合物作为活性成分，它们可以单独使用或与一种或多种的药学上可接受的非毒性惰性赋形剂或载剂结合使用。
8.权利要求1所述的药物组合物，其至少含有一种权利要求1到5任一项所述的活性成分，它可用作抗凝血剂，治疗急性静脉血栓形成、肺栓塞、四肢动脉栓塞、心肌梗塞、动脉粥样硬化和其它血栓栓塞病症；也可用于维持血液内环境稳定，尤其是在体外循环中。
全文摘要
本发明涉及如下式(I)的化合物H-phe-A其中A
文档编号C07K7/08GK1134706SQ9419405
公开日1996年10月30日 申请日期1994年10月6日 优先权日1993年10月7日
发明者J·L·费切尔, C·瑟伊, T·韦伯恩, A·鲁宾, S·西蒙特 申请人:阿迪尔公司