专利名称：肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及甲状旁腺激素(PTH)和甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)化合物，它们的制备方法，含有它们的药物制剂以及将其作为药物的应用。
具体而言，本发明提供了在PTH/PTHrP受体处具有有效的拮抗活性的PTH或PTHrP化合物，其中天然存在于第2位和第10位上的至少一个氨基酸残基被色氨酸或被在其侧链上带有芳基或杂芳基的另一个氨基酸残基取代，并且任意地天然存在于第3位和第6位上的至少一个氨基酸残基被色氨酸或被在其侧链上带有芳基或杂芳基的另一个氨基酸残基进一步取代，这些化合物均为本发明化合物。
在本发明的具体实施方案中提供了PTH或PTHrP化合物，其中天然存在于第10位上的氨基酸残基被色氨酸或被在其侧链上带有芳基或杂芳基的另一个氨基酸残基取代，并且任意地天然存在于第3位和第6位上的至少一个氨基酸残基被色氨酸或被在其侧链上带有芳基或杂芳基的另一个氨基酸残基进一步取代。
术语“PTHrP”指任一天然存在形式的PTHrP，例如人、牛、鸡、鼠或小鼠PTHrP。为保持一致性并遵照常规方式，下述说明书中，对PTHrP序列中的氨基酸残基使用同一编号体系，而不考虑本发明PTHrP序列中任一α-氨基酸残基是否被取代或缺失。
术语“PTH”指任一天然存在形式的PTH，例如人、牛、鸡、鼠或小鼠PTH。为保持一致性并遵照常规方式，下述说明书中，对PTH序列中的氨基酸残基使用同一编号体系，而不考虑本发明PTH序列中的任一α-氨基酸残基是否被取代或缺失。
“PTHrP化合物”或“PTH化合物”分别指包含基于PTHrP或PTHN-末端片段的氨基酸序列的肽，优选所基于的PTHrP或PTH片段始于第1-7位的任一残基，终止于第27-38位的任一残基，例如其为包含达31、34、35、36、37或38位氨基酸残基的PTHrP或PTHN-末端片段。由此认为术语“PTHrP或PTH”包括这样的肽，其中所述N-末端片段的一个或多个氨基酸残基缺失，优选在N末端缺失。根据本发明，我们认为这些术语还包括这样的肽，其中除了第2位和/或第10位上的取代以及任意地在第3和/或第6位上的取代外，天然存在序列的一个或多个氨基酸残基被一个或多个其它氨基酸残基(天然或非天然的)取代。人PTHrP1-38、1-34和1-31N-末端片段序列分别示于SEQ IDNo1、2或3。
人PTH1-38、1-34和1-31N-末端片段序列分别示于SEQID No4、5或6。
PTHrP或PTH化合物的N-末端可以是游离的或被保护的氨基，例如具有《有机合成中的保护基团》，T.W.Greene，J.Wiley&Sons，NY(1981)，219-287中公开的N-保护基，该文在这里引为参考文献，优选以R″-CO-、R″-O-CO、R″-O-CH2-CO-或R″-SO2保护，或N-末端带有如下定义的R″、R-NH-CO-或R-NH-CS-的氨基。
本发明化合物C-末端可以是COOH、CONH2或单一取代或双取代的酰胺，如-CONRcRd，其中Rc和Rd之一为H，另一个为脂族残基，如C1-6烷基，或两者均为脂族残基，或Rc和Rd与其相连的氮原子一起形成杂环基，如吡咯烷基或哌啶基。
根据本发明，PTHrP或PTH化合物在PTH/PTHrP受体处具有有效的拮抗活性，如与PTH/PTHrP受体结合，其在功能生物测定中具有的使PTH/PTHrP受体活化的固有活性(i.a)远远小于1，如i.a最大为0.3，在功能生物测定中拮抗PTHrP或PTH或其片断如PTHrP(1-34)或PTH(1-34)，具有pA2值至少为6.5。本发明优选化合物i.a为0.03或更低甚至在某些测定中不可测出。功能生物测定的例子是现有技术常用的基于骨肉瘤的腺苷酸环化酶测定。这一分析结果提供了体外测定的范围，根据下文所述的Marcus和Aurbach在内分泌学，85，801-810(1969)中公开的方法，该范围内的被测化合物在UMR细胞系如UMR-106-06的鼠骨肉瘤细胞中能刺激腺苷酸环化酶活性或拮抗PTHrP、PTH或其片段的作用。
氨基酸指天然存在的或可购买的或非天然的氨基酸或者其光学异构体。非天然氨基酸是指未在mRNA指导下插入蛋白质的氨基酸，如β-Nal，氟代-α-氨基酸如氟丙氨酸，环己基丙氨酸或三甲硅烷基丙氨酸。
“天然氨基酸”指本领域熟知的那些氨基酸。U.S.P.T.O出版的1990年5月15日公开的商标公报第33页46行列出这些氨基酸及其标准缩写。此处将这些氨基酸和缩写符号具体列出。
天然氨基酸如下所示A Ala 丙氨酸D Asp 天冬氨酸E Glu 谷氨酸F Phe 苯丙氨酸G Gly 甘氨酸H His 组氨酸I Ile 异亮氨酸K Lys 赖氨酸L Leu 亮氨酸M Met 蛋氨酸N Asn 天冬酰胺Q Gln 谷氨酰胺R Arg 精氨酸S Ser 丝氨酸T Thr 苏氨酸V Val 缬氨酸W Trp 色氨酸Y Tyr 酪氨酸侧链带有芳基或杂芳基的氨基酸残基是指氨基酸残基侧链为任意进行环取代的苯基甲基、1-或2-萘基甲基、1-或2-萘基乙基、3-或4-吡啶基甲基、3-吲哚基甲基或3-吲唑基甲基；优选定义如下的式-NH-CHR′-CO-的氨基酸残基。
本发明优选的实施方案提供了式I所示的化合物R-[(X2)p′(X3)q′(X6)s′R10]-D-(y-x)RaI其中x是选自31、34、35、36、37或38的残基编号，y是选自1、2、3、4、5、6或7的残基编号，X2为Val或独立地具有X10的含义之一，X3是Ser或独立地具有X10的含义之一，X6是Gln或独立地具有X10含义之一，
R10是Asp或X10，X10为Trp或-NH-CHR′-CO-，其中R′为式(a)、(b)、(c)或(d)基团
其中n是1或2，m是1或2，o是0或1，环A被一个或多个选自氟、氯、硝基、C1-4烷基和C1-4烷氧基的取代基任意取代，其中两个烷基或两个烷氧基取代基也可一起形成一个与环A稠合的环结构，每个环B和C可独立地被取代，与上述环A所示的取代情况相同，Ya是一个键、-CH2-、O、NH或N-C1-6烷基，D是由PTHrP或PTHN-末端片段衍生的氨基酸序列，每个p、q和s为1，条件是当y＞2时，p是0，当y＞3时，q是0，且当y＞6时，s是0，R是H、R″-CO-、R″-O-CO-、R″-O-CH2-CO-、R″-SO2-、R、R-NH-CO-、R-NH-CS-或NH2-C1 -6亚烷基-CO-，其中R″是C1-8烷基；ω-羧基-C1-6烷基；ω-[(C1-4烷氧基)羰基]C1 -6烷基；C2-8链烯基；C5-7环烷基；C5-7环烷基C1-4烷基；或苯基、苯基C1-4烷基、1-萘基、2-萘基、1-萘基C1-2烷基或2-萘基C1-2烷基，每个基团中的环被一个或多个选自氟、氯、硝基、C1-4烷基和C1-4烷氧基的取代基任意取代；杂芳基；
R独立地具有所给出的R″含义之一，但除去ω-羧基C1-6烷基和ω-[(C1-4烷氧基)羰基]C1-6烷基的含义；和Ra是OH或NH2，条件为X2和R10中至少一个具有X10的含义。
当环A、B或C的取代基一起形成环结构时，它可以是如-O-CH2-CH2-O-。多环环烷基的例子是如金刚烷基。
作为R″的杂芳基为5、6或7元不饱和杂环基，环中含有至少一个氮原子，并可任意地再含如N、O或S杂原子，且任意地与苯环稠合。优选的杂芳基为吲哚基、喹啉基或异喹啉基。
本发明化合物可以例如游离形式、盐或其配合物形式存在，如可与有机酸、聚合酸和无机酸形成酸加成盐。这种酸加成盐形式包括盐酸盐和乙酸盐。例如通过加入无机物如Ca和Zn盐这种无机盐或氢氧化物，和/或加入聚合有机物，由本发明PTHrP或PTH化合物形成配合物。
式I化合物中，优选使用下列含义，无论是单独使用或任意结合或再结合使用1.D是hPTHrP的N-末端片段。
2.D是hPTH的N-末端片段。
3.X10是Trp。
4.X10是-NH-CHR′-CO-，其中R′是式(a)、(b)或(c)基团，优选(a)或(c)，更优选(a)。
5.X2是Trp或-NH-CHR′-CO-，其中R′是式(a)、(b)或(c)基团。
6.每个X2和X10为Trp或-NH-CHR′-CO-，其中R′是式(a)、(b)或(c)基团。
7.每个X3和X10为Trp或-NH-CHR′-CO-，其中R′是式(a)、(b)或(c)基团。
8.每个X6和X10为Trp或-NH-CHR′-CO-，其中R′是式(a)、(b)或(c)基团。
9.每个X2、X6和X10为Trp或-NH-CHR′-CO-，其中R′是式(a)、(b)或(c)基团。
10.n是1。
11.y是选自3、4、5、6或7的残基编号，优选为3或5。
12.x选自31或34的残基编号。
13.R是R″CO-、R″-SO2、R或H2N-C1-6亚烷基-CO-。
14.R″是C1-8烷基、苯基C1-4烷基、1-或2-萘基、1-或2-萘基C1-2烷基。
15.R是ω-羧基C1-6烷基。
正如已经述及的，除第2和/或10位之外的位置上的一个或多个氨基酸可以进一步被上述的天然或非天然氨基酸残基取代，或者这些位置上的氨基酸缺失。当本发明化合物为hPTHrP衍生物时，它们可能包含其它的氨基酸取代，比如第3位为Ala，第4位为Trp，第5位为任意地环被取代的Phe，第11和/或13位为Leu，或第34位为D-Ala，还可在N-末端缺失1-7个氨基酸残基而成为任意被截短的氨基酸序列。当本发明化合物是hPTH衍生物时，例如在选自8、16、18、33和34的至少一个位置上氨基酸残基如Leu8、Ala16、Gln18、Thr33、Ala34或其D-型异构体可进一步被取代。
本发明还提供了用于制备PTHrP或PTH化合物的方法。可逐步进行液相合成或固相合成，或使用基因工程手段或将这些方法结合使用，来制备这些化合物。
例如，可按下述方法制备本发明化合物a)将存在于本发明PTHrP或PTH化合物上的至少一个保护基除去，例如呈被保护形式的式I化合物；或b)通过酰胺键将两个肽片段连接起来，这两个肽片段可以是被保护的、部分被保护的或未被保护的形式，由此获得式I所需的PTHrP或PTH化合物氨基酸序列的肽片段，然后可任意地进行该方法的步骤a)，或者c)在所需序列的N-末端残基或其N-末端片段的氨基上用选择法以被保护的形式或未被保护的形式加入保护基或取代基，然后任意进行步骤a)，并回收由此得到的呈游离形式、盐形式或配合物形式的PTHrP或PTH化合物。
可使用与已知方法相似的方法进行步骤a)、b)和c)，如本领域所知的肽化学方法或下面实施例中所述的方法。在这些反应中，当需要时，适用于肽的保护基可用来保护不参加反应的官能团。术语保护基还包括具有官能团的聚合物树脂。
当本发明化合物中包含非天然或天然残基时，可将化学逐步合成法与基因工程方法相结合来制备这些化合物；可使用重组技术制备由可基因编码的氨基酸残基组成的肽序列(无论是全序列或片段)，并且可使用化学合成法来引入所需非天然氨基酸或末端氨基取代基，当需要时，可将这些片段连结并除去存在的保护基。
下述实施例中，温度均以℃表示。采用下面的缩写符号DMF＝二甲基甲酰胺，DMA＝N，N-二甲基乙酰胺-6-磺酰基，Pmc＝2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃，tBu＝叔丁基，PyBOP＝苯并三唑-1-基-氧-三吡咯烷基磷六氟磷酸盐，Nal(2)＝L-3-(2-萘基)丙氨酸，DIEA＝N，N-二异丙基-N-乙胺，Fmoc＝9-芴甲氧基羰基，RT＝室温，MS＝电喷射谱测定的M+。实施例1[Trp4，10]hPTHrP(1-34)OH在基于树脂支持物的聚苯乙烯上，逐步合成此肽，通过Fmoc保护α-氨基，侧链官能团保护情况如下Asp(OtBu)、Glu(OtBu)、His(Trt)、Lys(Boc)、Asn(Trt)、Gln(Trt)、Arg(Pmc)、Ser(tBu)、Trp(Boc)和Thr(tBu)。
约0.5mmol/g的Fmoc-Ala-氧甲基-4-苯氧甲基-共聚(聚苯乙烯-1％-二乙烯基苯)用作肽逐步固相合成中的起始原料，固相肽合成包括反复进行α-氨基脱保护、洗涤、偶联(即将下一个氨基酸残基接到生长的肽链上)和洗涤。使用在DMA中的20％哌啶，将N-αFmoc基团切下。偶联反应中每个氨基使用4当量的Fmoc-氨基酸和PyBOP-试剂以及DMA中的8当量的DIEA。肽链的组合完成后，按前述相同方法使用DMA中的哌啶除去末端Fmoc-保护基。在RT下使用TFA中由5％十二烷基甲基硫和5％水组成的试剂将肽从树脂支持物上切下，并同时除去所有侧链保护基，反应时间为2小时。滤去树脂颗粒，用一些TFA洗涤，向合并的滤液中加入10至20体积的乙醚，使产物沉淀，并用乙醚洗涤，并干燥。将产物在C-18大孔硅胶柱上使用2％磷酸水溶液的乙腈梯度洗脱进行色谱提纯。收集含纯化合物的级分，通过离子交换树脂(Biorad，AG4-X4乙酸盐形式)过滤，冷冻干燥得标题化合物。MS4146用与实施例1相似的方法，使用适当的氨基酸可制备下列化合物实施例2[Trp10，Leu11，Leu13]hPTHrP(1-34)OH MS4059实施例3[Trp10，Leu11]hPTHrP(1-34)OH MS4073实施例4[Trp3，10]hPTHrP(1-34)OH MS4188实施例5[Trp2，10]hPTHrP(1-34)OH MS4176实施例6[Trp10]hPTHrP(2-34)OH MS4018.3实施例7[Trp10]hPTHrP(3-34)OH MS3919.2实施例8[Trp2]hPTHrP(1-34)OH MS4104.9实施例9[Trp10]hPTH(1-34)OH MS4189实施例10[Leu8，Trp10，Ala16，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OHMS4036实施例11[Leu8，Trp10，Ala16，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH(2-34)OHMS3949实施例12[Leu8，Trp10，DLeu11，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OHMS4079实施例13[Phe2，Trp10]hPTHrP(1-34)-OHMS4137.1实施例14[Trp2，Trp10]hPTHrP(2-34)-OHMS4105.1实施例15[Trp6，Trp10]hPTHrP(1-34)-OHMS4146.8实施例16[Trp6，Trp10]hPTHrP(6-34)-OHMS3623.3实施例17[Trp10]hPTHrP(7-34)-OH MS3437.6实施例18[Trp3，Trp10]hPTHrP(3-34)-OHMS4018.0实施例19[Trp10]hPTHrP(1-34)OHMS4088.7实施例20[Trp6，Trp10]hPTHrP(3-34)NH2MS3976.8实施例21[Phe6，Trp10]hPTHrP(1-34)OH MS3546.1实施例22[Phe2，Phe6，Trp10]hPTHrP(1-34)OH MS4155.1实施例23N-3-氨基丙酰基-[Phe6，Nal(2)10]hPTHrP(4-34)NH2MS3932.0实施例24Nα-苄氧羰基[Nal(2)10]hPTHrP(3-34)-NH2
用与实施例1相似的方法制备这些肽，但所用的起始原料是约0.4mmol/g的4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基-甲基)-苯氧基共聚(聚苯乙烯-1％-二乙烯基苯)，其可根据如Tetrah.Letters，283787-3790(1987)中所述的方法来制备。在合成后期，将Z-Ser-OH加到肽链上，按实施例1的方法将肽切下并提纯。MS3975.3实施例25Nα-乙酰基-[Trp10]hPTHrP(3-34)OH用与实施例1相似的方法合成该肽，在Fmoc-脱保护后期结束时，使用1∶1的乙酸酐和DMF的混合物进行乙酰化。根据前述方法将肽从树脂上切下并提纯。MS3961.1用与实施例1、24或25相似的方法制备下列化合物。实施例26Nα-乙酰基-[Trp10]hPTHrP(2-34)OHMS4060.4实施例271-异己酰-[Leu8，Trp10，Gln18，Thr33，Ala34]-hPTH(1-34)OHMS4091实施例28Nα-2-萘基乙酰基-[Nal(2)10]hPTHrP(3-34)NH2MS4097.1实施例29Nα-2-萘基乙酰基-[Nal(2)10]hPTHrP(4-34)NH2MS4009.7实施例30Nα-2-萘基磺酰基-[Nal(2)10]hPTHrP(3-34)NH2MS4119.2实施例31Nα-2-萘氧基乙酰基-[Nal(2)10]hPTHrP(3-34)NH2MS4111.5实施例32Nα-2-萘乙酰基-[Ala3，Nal(2)10]hPTHrP(3-34)NH2MS4080.8实施例33Nα-苄氧羰基-[Trp2，Nal(2)10]hPTHrP(2-34)NH2MS4248.3实施例343-萘-2-基丙酰基-[Nal(2)10]hPTHrP(3-34)NH2MS4110.8实施例353-萘-2-基丙酰基-[Nal(2)10]hPTHrP(3-34)NH2MS4110.9实施例36Nα-2-萘基乙酰基-[Nal(2)10，DAla34]hPTHrP(3-34)NH2MS4095.9实施例37Nα-2-萘基乙酰基-[Nal(2)10]hPTHrP(3-31)NH2MS3788.0实施例38Nα-3-萘-2-基丙酰基1-[Nal(2)10]hPTHrP(7-34)NH2MS3630.0实施例E39Nα-乙酰基-[Phe6，Nal(2)10]hPTHrP(6-34)NH2MS3637.0实施例40Nα-乙酰基-[Phe6，Nal(2)10]hPTHrP(4-34)NH2MS3903.1实施例411-(1-氨基-1-环戊基羰基)-[Leu8，Trp10，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OHMS4104例如，根据G.Valle等人在Can.J.Chem.662575-2582(1988)中所述的方法可制备在制备肽树脂中间体中所用的Fmoc-1-氨基环戊烷-1-羧酸。实施例E421-金刚烷基羰基-[Leue，Trp10，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OHMS4155实施例43 1-(3-吲哚基羰基)-[Leu8，Trp10，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OHMS4150实施例44 1-(3-喹啉基羰基)-，[Leu8，Trp10，Ala16，Gln18，Thr33，Ala34]hPTH(1-34)OHMS4104实施例451-(2-萘酰基)-[Leu8，Trp10，Gln18，Thr33，Ala34]-hPTH(1-34)OHMS4147实施例46Nα-(2-萘基)甲基-[Trp10]hPTHrP(2-34)-OH使用S-O.Lawesson等人在Tetrahedron 373635(1981)中所述的Lawesson试剂处理N-萘酰基(2)缬氨酸甲酯，并采用F.S.Guziec等人在Tetrah.Letters 23-26(1990)中所述用于内硫肽(endothiopeptides)的方法来还原得到的N-硫萘酰基(2)缬氨酸甲酯。使用LiOH使该甲酯水解，得到N-α-(萘基(2)甲基)缬氨酸盐酸盐，呈结晶固体，mp＝205-210°(dec.)。使用PyBOP试剂将其与预先制备出的被保护的[Trp10]hPTHrP-(3-34)-O-肽树脂偶联，该肽树脂的N-αFmoc基已被除去。按实施例1的方法将肽从树脂上切下并提纯。MS4158.2实施例47Nα-2-萘-2-基乙基-[Trp10]hPTHrP(2-34)OHMS4171.9实施例48Nα-2-萘-2-基乙基-[Ala3，Nal(2)10]hPTHrP(3-34)NH2MS4066.7实施例49Nα-琥珀酰基-[Phe6，Nal(2)10]hPTHrP(5-34)NH2用与实施例1相似的方法制备该肽，但使用0.63g4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基共聚(聚苯乙烯-1％-二乙烯基苯)(装载量约0.4mmol/g)作为起始原料，其可按Tetrah.Letters，283787-3790(1987)中所述的方法制备。偶联最后一个氨基酸Fmoc-His(Trt)OH后，根据常规方法选择性除去Fmoc-基，并将肽树脂与DMF中的琥珀酐(0.5g)和DIPEA(0.86ml)反应。按实施例1的方法以乙酸酯形式从树脂上切下肽、提纯并冻干，得到标题化合物。MS3832.0根据实施例49的方法，可制备下列化合物实施例50Nα-琥珀酰基-[Phe6，Nal(2)10]hPTHrP(5-31)NH2MS3522.1实施例51Nα-琥珀酰基-[Nal(2)6，Nal(2)10]hPTHrP(5-34)NH2MS3881.7实施例52Nα-戊二酰基-[Phe6，Nal(2)10]hPTHrP(5-34)NH2MS3845.6实施例53Nα-琥珀酰基-[Phe6，Nal(2)10，DAla34]hPTHrP(5-34)NH2MS3832.0实施例54Nα-琥珀酰基-[4-Cl-Phe6，Nal(2)10]hPTHrP(5-34)NH2MS3866.5实施例55Nα-琥珀酰基-[4-Cl-Phe5，4-Cl-Phe6，Nal(2)10]-hPTHrP(5-34)NH2MS3910.2正如动物试验所表明的，呈游离形式或可药用盐形式及配合物形式的本发明化合物显示出有价值的药理活性，由此其可用于治疗疾病。
根据Marcus和Aurbach在内分泌学，85，801-810(1969)中所述方法，体外评估本发明化合物的生物活性，通过测试它们在UMR106-06鼠骨肉瘤细胞中刺激(促效作用)或抑制(拮抗作用)刺激PTH的环AMP合成的能力。在12孔板上在DMEM-HAM′s F12培养基(1∶1)-10％FCS中，鼠骨肉瘤UMR106细胞生长至汇合。然后将该培养基转移至含有2％FCS的培养基中，并向每孔加入1-5μCi[3H]-腺嘌呤。两小时后，用无血清培养基洗涤细胞两次，并将细胞在DMEM-0.1％BSA中温育，其中含1mm3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，以排除磷酸二酯酶的作用。20分钟后，单独加入测试物质或与PTH一起加入(拮抗作用实验)。15分钟后，除去培养基，终止反应，加入0.5ml冰冷的5％三氯乙酸萃取cAMP。加入载体溶液(0.5ml/孔)，其含有0.2mm的未标记腺嘌呤、腺苷、AMP、ADP、ATP和cAMP以及用于测定回收率的0.4μCi[14C]-腺苷。使用系列Dowex AG 50W-X4(200-400目)和氧化铝色谱来分离[3H]-cAMP，并根据Salomon Y.在Advances in Cyclic NucleotideResearch，Vol.10，Raven Press，35-55，1979中所述方法计数。计算结果，以对照溶剂的％表示，由DRC曲线测定EC50值。根据PTHrP或PTH的DRC曲线的右移值计算拮抗效力并以pA2值表示。本发明化合物在浓度为10-9至10-5M时具有拮抗活性。实施例36、37和49的化合物在UMR 106-06细胞中的pA2值分别为10.3、9.7和9.3。
本发明化合物对PTH受体还具有结合亲和性，举例如下使用乳过氧化物酶法(Anawa Lab.AG，Wangen)来碘化鸡[Tyr36]PTHrP(1-36)酰胺，特异活性为2200Ci/mmol。用200μlDMEM和含1％BSA的HAM′sF12(1∶1)洗涤单层负鼠肾细胞(OK1)，并在1μM[Tyr36]chPTHrP(1-36)酰胺存在或不存在时，与每孔50.000cpm[125I-Tyr36]chPTHrP(1-36)酰胺一起在16℃下温育。温育后，用0.5ml培养基(4℃)洗涤细胞，用0.5ml1NNaOH溶解并测定放射性。特异性结合为全部结合量减去非特异结合量。使用SCTFIT一种非线性回归计算机程序(Feyen等人，1992，生物化学和生物物理研究通讯1878-13)分析竞争曲线，数据以平均pKD值(n＝2至3)表示。实施例36、37和49的化合物的pKD值分别为8.3、7.9和8.4。
此外，正如由甲状腺甲状旁腺切除的鼠所测定的，静脉注射本发明化合物后，其具有拮抗PTH的效果。甲状腺甲状旁腺切除后24小时，用PTH(1-34)注射被麻醉的鼠，通过离体的颈静脉测试该化合物。由腹侧插入套管，从尿膀胱中收集尿。使用标准方法测定尿中磷酸盐和cAMP含量及血清中钙和磷酸盐含量。这些参数用于定量体内抗PTH效果的拮抗物的效力。在此试验中，当通过静脉注射以1μg/kg/h至1mg/kg/h剂量施用本发明化合物时，其拮抗PTH效果。当静脉注射190g/kg/h实施例49的化合物，且PTH(1-34)静脉注射量为4μg/kg/h时，其能完全抑制PTH诱导的磷酸盐尿达90分钟。
因此，本发明化合物能用来预防或治疗下述的所有疾病与由PTH或PTHrP过量释放引起的血钙增多相关的疾病，如甲状旁腺机能亢进、血钙过多，与恶性肿瘤相关的疾病，如乳-腺癌，肺、食管、头、颈部的鳞状细胞癌，以及转移至骨或未转移至骨的血癌。此外，本发明化合物还可用于预防或治疗PTHrP促发的肿瘤生长、肿瘤穿透以及向骨内生长，用于治疗皮肤病，如组织修复治疗，如治疗烧伤、溃疡、创伤以及促进毛发生长。
对于这些适应症，当然将使用不同的合适剂量，例如其依赖于所治疗的对象、给药方式以及疾病的严重程度。但通常来说，对于动物日剂量约为0.1至约100mg/kg动物体重会得到满意的结果。对于较大的哺乳动物，例如人，日剂量范围约为0.1至500mg本发明化合物。
本发明化合物可以游离形式或可药用盐形式或配合物形式给药。可使用常规方法制备这类盐及配合物，并且其具有与游离化合物同样级别的活性。本发明还提供了药物组合物，其包括呈游离碱形式的或可药用盐形式的或配合物形式的本发明化合物以及药用稀释剂或载体。该组合物可按常规方式配制。适宜的单位剂量形式包含约0.025至250mg的本发明化合物及其药用稀释剂或载体。
本发明化合物可按任一常规途径给药，例如可以注射溶液形式或悬浮液形式，或以鼻内或栓剂形式非肠道给药。另外的方法是，本发明化合物还可以膏体、胶状物等形式局部给药，例如如前所述的用于治疗皮肤病或使毛发生长。
根据前述内容，本发明还提供了a)用作药物的本发明化合物或其药用盐或配合物；b)对需要治疗的受治疗者预防或治疗上述疾病的方法，该方法包括对所述受治疗者施用有效量的本发明化合物或其药用盐或配合物；c)本发明化合物或其药用盐或配合物，它被用于制备上述方法b)中应用的药物组合物。
根据本发明的另一实施方案，本发明化合物可用作其它治疗中的助剂或佐剂，例如用于使用骨吸收抑制剂治疗血钙过多，特别是使用降钙素或其类似物或衍生物，如鲑、鳗或人降钙素，膦酸氢盐，利尿剂或将其结合使用，或用于使用细胞生长抑制剂或其任一组合的肿瘤治疗中。
根据前述内容，本发明还包括下述方面d)预防或治疗血钙过多的方法，例如针对需要这种治疗的受治疗者预防或治疗前述的特定的疾病，该方法包括对所述受治疗者施用有效量的a)本发明化合物及b)另一种药物，所述的另一种药物为上述的治疗剂。
实施例36、37和49的化合物为优选化合物，用于治疗或预防与由PTH或PTHrP过量释放引起的血钙增高有关的所有疾病。
序列表(1)一般信息(i)申请人(A)姓名SANDOZ LTD.
(B)街道Lichtstrasse35，(C)城市BASLE(E)国家SWITZERLAND(F)邮政编码(ZIP)CH-4002(A)姓名SANDOZ PATENT GMBH(B)街道Humboldtstrasse 3(C)城市LOERRACH(E)国家GERMANY(F)邮政编码(ZIP)D-79539(A)姓名SANDOZ ERFINDUNGENVERWALTUNGSGESELLSCHAFT M.B.H.
(B)街道Brunner Strasse 59(C)城市VIENNA(E)国家AUSTRIA(F)邮政编码(ZIP)A-1230(ii)发明名称肽(iii)序列数6(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)长度38个氨基酸
(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构未知(ii)分子类型蛋白质(iii)假拟结构无(iii)反义无(v)片段类型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO1Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asn Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asn Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His20 25 30Thr Ala Glu Ile Arg Ala35(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)长度34氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构未知(ii)分子类型蛋白质(iii)假拟结构无(iii)反义无(v)片段类型N-末端(xi)序列特征SEQ ID NO2Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asn Lys Gly Lys Ser Ile Gln1 5 10 15Asn Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile His20 25 30Thr Ala(2)SEQ ID NO3信息(I)序列特征
(A)长度31氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构未知(ii)分子类型蛋白质(iii)假拟结构无(iii)反义无(v)片段类型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO3Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asn Lys Gly Lys Ser Ile Gln15 10 15Asn Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu Ile20 25 30(2)SEQ ID NO 4信息(i)序列特征(A)长度38氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构未知(ii)分子类型蛋白质(iii)假拟结构无(iii)反义无(v)片段类型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO 4Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Mer His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 16Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Phe Val Ala Leu Gly35(2)SEQ ID NO5信息(I)序列特征(A)长度34氨基酸(B)类型氨基酸
(C)链型单链(D)拓扑结构未知(ii)分子类型蛋白质(iii)假拟结构无(iii)反义无(v)片段类型N-末端(xi)序列描述 SEQ ID NO 5Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Phe(2)SEQ ID NO6信息(I)序列特征(A)长度31氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构未知(ii)分子类型蛋白质(iii)假拟结构无(iii)反义无(v)片段类型N-末端(xi)序列描述SEQ ID NO6Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val20 25 30
权利要求
1.一种PTH或PTHrP化合物，其中天然存在于第2位和第10位上的至少一个氨基酸残基被色氨酸或被在其侧链上带有芳基或杂芳基的另一个氨基酸残基取代，并且任意地天然存在于第3位和第6位上的至少一个氨基酸残基被色氨酸或被在其侧链上带有芳基或杂芳基的另一个氨基酸残基进一步取代，该化合物呈游离形式或盐形式或配合物形式。
2.一种PTH或PTHrP化合物，其中天然存在于第10位上的氨基酸残基被色氨酸或被在其侧链上带有芳基或杂芳基的另一个氨基酸残基取代，并且任意地天然存在于第3位和第6位上的至少一个氨基酸残基被色氨酸或被在其侧链上带有芳基或杂芳基的另一个氨基酸残基进一步取代，该化合物呈游离形式或盐形式或配合物形式。
3.根据权利要求1的化合物，其中其侧链上带有芳基或杂芳基的氨基酸残基是其侧链任意进行环取代的3或4-吡啶基甲基、3-吲哚基甲基或3-吲唑基甲基或式(a)、(b)、(c)或(d)基团
其中n是1或2，m是1或2，o是0或1，环A被一个或多个选自氟、氯、硝基、C1-4烷基和C1-4烷氧基的取代基任意取代，由此两个烷基或两个烷氧基取代基也可一起形成与环A稠合的环结构，每个环B和环C可独立地被取代，与上述环A的取代情况相同，并且Ya为直连键、-CH2-、O、NH或N-C1-6烷基。
4.根据权利要求1的化合物，其为式I化合物R-[(X2)p，(X3)q，(X6)s，R10]-D-(y-x)RaI其中x是选自31、34、35、36、37或38的残基编号，y是选自1、2、3、4、5、6或7的残基编号，X2是Val或独立地为X10含义之一，X3是Ser或独立地为X10含义之一，X6是Gln或独立地为X10含义之一，R10是Asp或X10，X10为Trp或-NH-CHR′-CO-，其中R′是式(a)、(b)、(c)或(d)基团
其中n是1或2，m是1或2，o是0或1，环A被一个或多个选自氟、氯、硝基、C1-4烷基和C1-4烷氧基取代基任意取代，由此两个烷基或两个烷氧基取代基也可一起形成与环A稠合的环结构，每个环B和C可独立地被取代，与上述环A的取代情况相同，Ya是直连键、-CH2-、O、NH或N-C1-6烷基，D是由PTHrP或PTH的N-末端片段衍生的氨基酸序列，每个p、q和s为1，条件是当y＞2时，p为0，当y＞3时，q是0，且当y＞6时，s是0，R是H、R″-CO-、R″-O-CO-、R″-O-CH2-CO-、R″-SO2-、R、R-NH-CO-、R-NH-CS或NH2-C1- 6亚烷基-CO-，其中R″是C1-8烷基；ω-羧基C1-6烷基；ω-[(C1 -4烷氧基)羰基]C1-6烷基；C2-8链烯基；C5-7环烷基；C5-7环烷基C1 -4烷基；或苯基、苯基C1-4烷基、1-萘基、2-萘基、1-萘基C1- 2烷基或2-萘基C1-2烷基，其中每个基团的环被一个或多个选自氟、氯、硝基、C1-4烷基和C1-4烷氧基的取代基任意进行环取代；杂芳基；R独立地具有R″的含义之一，但除去ω-羧基C1-6烷基和ω-[(C1 -4烷氧基)羰基]C1-6烷基的含义；和Ra是OH或NH2，条件是X2和R10中的至少一个具有X10的含义。
5.根据权利要求1或4的化合物，其衍生自hPTH或hPTHrP的N-末端片段。
6.根据权利要求1的化合物，其选自Nα-2-萘基乙酰基-[Nal(2)10，DAla34]hPTHrP(3-34)NH2Nα-2-萘基乙酰基-[Nal(2)10]hPTHrP(3-31)NH2Nα-琥珀酰基-[Phe6，Nal(2)10]hPTHrP(5-34)NH2。
7.用于制备权利要求1的化合物的方法，所述化合物呈游离形式或盐形式或配合物形式，该方法包括a)将存在于本发明PTHrP或PTH化合物如呈保护形式的式I化合物上的至少一个保护基脱除；或b)将呈保护形式、部分保护形式或末保护形式的两个肽片段以酰胺键连接起来，由此获得的肽片段具有所需PTHrP或PTH化合物如式I化合物的氨基酸序列，然后任意地进行该方法的步骤a)，或者c)在呈保护形式或未保护形式的所需序列的N-末端残基或其N-末端片段的氨基上用选择法加入保护基或取代基，然后任意进行步骤a)，并回收由此得到的呈游离形式、盐形式或配合物形式的PTHrP或PTH化合物。
8.一种根据权利要求1的用作药物的呈游离形式或药用盐形式的化合物。
9.一种药物组合物，其包括权利要求1的呈游离形式或药用盐形式的化合物以及药用稀释剂或载体。
10.呈游离形式或药用盐形式的用作药物的权利要求1的化合物，其进一步与选自骨再吸收抑制剂和细胞生长抑制剂的治疗剂结合。
11.一种对需要治疗的受治疗者预防或治疗与由PTH或PTHrP过量释放引起的血钙增多有关的疾病、预防或治疗由PTHrP促发的肿瘤生长、治疗皮肤病和促进毛发生长的方法，该方法包括对所述受治疗者施用有效量的呈游离形式或药用盐形式的权利要求1的化合物。
全文摘要
在PTH/PTHrP受体处具有有效拮抗活性的PTH或PTHrP化合物，其中天然存在于第2位和第10位上的至少一个氨基酸残基被色氨酸或被在其侧链上带有芳基或杂芳基的另一个氨基酸残基取代，并且任意地天然存在于第3位和第6位上的至少一个氨基酸残基被色氨酸或被在其侧链上带有芳基或杂芳基的另一个氨基酸残基进一步取代，其具有药物活性，例如预防或治疗与由PTH或PTHrP过量释放引起的血钙增多有关的疾病。
文档编号C07K14/435GK1154116SQ95194365
公开日1997年7月9日 申请日期1995年7月27日 优先权日1995年7月27日
发明者F·卡丁诺斯, J·H·M·费恩, R·甘泽, F·O·冈伯特 申请人:山道士有限公司