专利名称：肺表面蛋白sp-c的合成多肽类似物的制作方法
技术范围本发明是关于肺表面活性物质活性多肽，其制备方法和含有该多肽的治疗组合物。
先有技术所有脊椎动物的肺都含有一种混合物质，被称之为“肺表面活性物质”。它显示出表面活性，并且降低肺的肺泡区中的表面张力。因而避免了呼出时呼吸道区域末端的膨胀不全。这些混合物质以一种动力学方式调节表面张力，根据Laplele规则，预期小肺泡的膨胀不全将通过其表面张力的相应调适而有利于肺泡变大，避免了膨胀不全。作为其结果，是产生一个平衡良好和组织和生理稳定肺的结构。
肺表面活性物质是由II型肺泡肺细胞(片型体)分泌的。这些是由高含量的二棕榈酰胆碱(BPPC)和磷酸甘油酯(PG)紧密结合的磷脂双分子层。作为在肺表面活性蛋白中的主要成份，被证明是为SP-A，SP-B和SP-C。SP-A是一种高分子糖蛋白，它在分泌的调节上起决定性的作用。
在较小规模上蛋白SP-C和SP-B在构成单分子表面膜时起到热动力学催化剂的作用(狭义活性物)。由于这些蛋白质存在，使其展开动力学(Spreitungskinetik)被大为加速。这样一来，首先是表面活性物的组合物的不加迟延的调节使各种表面张力要求成为可能。这种性质反映在蛋白质的高度疏水性上，特别是对SP-C而言。
通过提取动物的肺组织或肺灌洗液能得到表面活性物制备物，它既可用物理化学仪器测定，也可在动物模型或在治疗应用上显示出补偿。表面活性物缺乏能力，因而适用于例如小儿呼吸困难综合症(IRDS)。这些动物制备物自身具有严重的缺陷磷脂的组成强烈依赖于动物物种、健康、营养状况，仅在有限程度上可能由混合一定的成分来补偿。表面活性蛋白的含量及SP-B/SP-C的比例则受支配于用同样的不确定性。另外，用于治疗的混合物亦含有这些蛋白的蛋白水解物或经修饰的衍生物(例如通过对蛋氨酸氧化)。就表面活性物质的长期使用和大量地施用而言，例如对成人的呼吸困难综合症(肺膨胀不全、ARPS)的应用或其它方面，如表面活性剂作为其它物质的载体用于肺部施用，不可回避的，物质的供给仍是尚未解决的问题。
因此提出，该问题应通过遗传工程方式生产蛋白来解决，重组蛋白质特别是应用细菌表达体系的蛋白质，实际上是无限量的生产，并可能采用现代化的分析方法和质量控制。可能通过应用合成磷脂来制造一种具有精确确定组成的表面活性物。这也能被理想地适应于治疗上的需要。
人蛋白SP-C(见通式II，A＝H或Phe，B＝Cys和C＝Met)，对于展开动力学是特别重要的，在其中心部分是只由脂肪族的非常疏水的氨基酸构成，如缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。这个中心部分(氨基酸12-34)的长度允许肽整合至单分子磷脂膜。在序列Pro-Cys-Cys-Pr0(3-6位)中，两个Cys-残基通过棕榈酸在SH-基上的硫酯化。棕榈酸进一步提高了整个蛋白质的疏水性，同时也锁住了半胱氨酸的两个SH基，保护其不被氧化和构成二硫桥键。这个中心区(氨基酸13-34)构成一个跨膜螺旋。这个区在N-末端翼侧是一个极性序列，有带正电荷的氨基酸(Lys，10；Arg，11)。
在WO91/18015中曾描述了由重组SP-C和由突变体SP-C的制造方法。在此建议，将4位和5位的两个半胱氨酸以两个丝氨酸替代。这样制造有其优点，即避免了在分离后两个半胱氨酸的技术繁琐的棕榈酸酯化。
发明详述人们惊奇地发现，SP-C突变体，即人的SP-C在4-位和5-位上的两个半胱氨酸分别用苯丙氨酸和色氨酸替代，32-位的蛋氨酸分别用异亮氨酸、亮氨酸或丝氨酸替代，跟天然的SP-C相比没有丝毫的功能丧失，并且在其稳定性方面甚至于更优越。基因工程法生产相当简单并有很高的产量。这种新的具有肺表面活性物质活性的多肽可以很高的纯度生产。
本发明的目的是具有肺表面活性物质活性的多肽，它有下列通式I的氨基酸序列，0 123456789 10(A) Gly Ile ProBB Pro Val His Leu Lys11 12 13 14 15 16 17 18 19 20Arg Leu Leu Ile Val Val Val Val Val Val(1)，21 22 23 24 25 26 27 28 29 30Leu Ile Val Val Val Ile Val Gly Ala Leu31 32 33 34LeuC Gly Leu其中A代表H或PheB代表Phe或TrpC代表Ile，Leu或Ser。
本发明的一种更优选的目的是一种通式I的多肽，其中A代表H或Phe，B为Phe和C为Ile，而A＝H，B＝Phe和C＝Ile更特别优选。
本发明的进一步目的是药物组合物，它以含有一个含一种或多种本发明相关多肽为特征，假如需要的话，另外含有选自SP-A，SP-B，特别是SP-B的一个或多个肺表面活性物活性多肽。
本发明相关多肽能以已知方法经固相肽合成或借助相应重组体载体在宿主细胞中制造。此项技术，包括载体构建，转化细胞、在转化细胞中蛋白的表达及表达蛋白的分离和纯化都是专业人员所熟知的。(例如，(WO86/03408，WO87/06588和WO91/18015)。
在细菌体系中表达SP-C的载体制造，采用重组技术DNA的传统方法。
可能在细菌中大量地和对宿主细胞无损地表达疏水的SP-C蛋白，只是以适当融合蛋白的形式，例如和氯霉素乙酰转移酶(CAT)一起表达如载体PTrAmpCAT152编码CAT的N末端区，并提供DNA片段的“框架内”克隆，该片断编码SP-C，是一个(5′-)-EcoR1和(3′)-Pst-1片段。CAT和SP-C在蛋白水平上在一个羟胺敏感的结合点(AsN↓GlY)互相连接。这个载体，即pTrpAmpCAT152∷SPC，允许相应的融合蛋白有控制的表达由此达到生产规模(发酵)。融合蛋白的表达引起宿主细胞中包涵体的形成。而且融合蛋白的CAT部分的长度可以改变，以在高的SP-C含量的情况下获得高产量的包涵体。
在细菌中的表达也能在多种宿主体系中，例如，哺乳动物、酵母和昆虫细胞中完成。对于不同的宿主细胞，按已知方法合成适当的DNA构建物和以通常的方式在宿主细胞基因组中嵌入相应调控顺序。
两个DNA寡核苷酸能由MiliGen/BioSearch Cyclone DNA-合成仪按方便的Phosphoamidit法合成出来。
第一个DNA寡核苷酸以118个核苷酸的长度构成有义链DNA结构。它编码(5′-3′方向)EcoRI特异的5′-末端以用于以后的亚克隆。Asn/Gly羟胺裂解位点和从SP-C先导序列的Gly-25起始以Leu-58结束，在通式I中对应于Gly-1及Leu-34的人SP-C。这样人SP-C蛋白的已知氨基酸序列就按照DNA中的遗传密码的原则被翻译出来。但是这个序列是以经修饰的方式，SP-C先导序列的28和29位两个半胱氨酸为苯丙氨酸或酪氨酸所替代，而先导蛋白序列的56位蛋氨酸被异亮氨酸、亮氨酸或丝氨酸替代。另外，还应考虑到宿主细胞的密码子利用频率。一个经修饰的SP-C序列，在4位和5位含苯丙氨酸，32位是异亮氨酸(编码为式I所示)，相应于通常用于这两个氨基酸的单字母密码子，被称为SPC34(FI/I)。此外，有义DNA链含一个TAA终止密码子以终止糖蛋白翻译，且有一Pst1-特异性3′末端。第二条寡核苷酸DNA链是互补的，非编码(反义链)链，由110个核苷酸构成合成得到的SP-C DNA片段被克隆在一个适当的表达载体中，如pTrpAmpCAT152。这个载体和Pkk233(Pharmacia)组装在一起，后者含有氨苄青霉素抗性基因，并是pBR322的一种衍生物。在pTrpAmp CAT152中，trc-启动子为Trp启动子替代。亦可用其他可诱导的启动子替代。
为了亚克隆SP-C片段，首先将互补的DNA-寡核苷酸相互杂交，由此产生的DNA-双链展示出凸出的单链末端(Eco R1/Psti)。
载体DNA的构建按常规方法完成，经Eco R1/Pst1消化后，所希望的载体DNA片段经琼脂糖胶电泳纯化，并经SP-C-DNA和载体片段借助于粘性末端而杂交。随后将两个片段按已知方法用共价键联在一起。
为了扩增DNA和分离质粒，按照常规方案转化氯化钙感受态E.alMM294细胞，再接种到氨苄青霉素的LB-琼胶板，选出荷有质粒载体细胞。由这些得到的Amp抗性的克隆分离质粒DNA，再用合适的限制性内切酶组合物进行分析。具有预期的DNA限制性裂解片段模式的克隆被选出。通过质粒序列的完全测序，SPC34(FF/1)顺序的正确插入得以肯定。
如此获得的质粒载体允许融合蛋白CAT∷SPC在Trp-启动子(或其它启动子)的控制下表达。诱导之后再结合的融合蛋白在宿主细胞中以包涵体形式得到。
融合蛋白CAT152∷SPC34(FF/1)氨基酸序列如下所示，以常规的单字母密码描述10 20 30 40 50MEKKI TGYTT VDISO WHRKE HFEAF CSVAO CTYNO TVOLD ITAFL KTVKK60 70 80 90 100NKHKF YPAFI HILAR LMNAH PEFRM AMKDG ELVIW DSVHP CYTVF HEOTE110 120 130 140 150TFSSL WSEYH DDFRO FLHIY SODVA CYGEN LAYFP KGFIE NMFFV SANPE160 170 180 186FNGIP FFPVH LKRLL IVVVV VVLIV VVIVG ALLIG L1 10 20 30 34在融合蛋白153至186位的SP-C(FF/I)的34个氨基酸通过下划线和1至34位标志而表明。
随后用羟胺实现Asm-152和Gly-153裂解(相当于SP-C肽的第一个氨基酸)以分开CAT和SP-C。SP-C肽的分离和纯化用常规的蛋白质化学方法进行。
本发明的多肽可单独使用或与其他适应于呼吸道调节的需要的药物组合物共同使用。该成份不仅能用于治疗新生儿和成人的呼吸困难综合症，也能用于治疗肺炎和支气管炎。此外，本发明的多肽也作为可吸入给药药物的载体。
除多肽外，该组合物还含有磷脂，特别是那些在天然的肺表面活性成份中也含有的磷脂即二棕榈酸酰磷酰胆碱(DPPC)，棕榈酰油酰磷脂酰甘油脂(POPG)以及磷脂酰甘油(PC)。为了构成一个适当的粘度，该组合物中含有钙、镁或钠的氯化物。本领域技术人员一方面基于已知的天然肺表面活性剂组合物，另一方面基于先有技术的多种建议，如EP-AO119055和EP-A0406732，确定组合物中多种组成成份的性质和数量。
本发明的优化组成中含80-95％重量比的磷脂，0.5-3.0％重量比的多肽，4-7％重量比的脂肪酸，优选是棕榈酸和1-3％重量比的氯化钙。
制备实施例1.生产菌株可使用的生产菌株E.coli199是由E.colK12菌株MM192衍生的，可以德国微生物和细胞培养物保藏中心GmbH(DSM，Braunschweig)以5208号购得。
表达载体pTrpAmp CAT 152∷SPC 34(FF/1)含有编码融合蛋白CAT 152∷SPC34(FF/1)的基因将由DNA序列pB322衍生，pBR322是一个ColEl衍生物[E.Weber(ed.)(1988)，生物可靠性，联邦研究和技术部，波恩]。从Pharmacia公司买到的质粒体pKK233-2用EcoR1/Hind3切掉Trc-启动子并用合成的Trp启动子替代(pTrp233)。后者由激动区(RNA聚合酶结合位点)，操纵基因区(Trp阻遏物结合位点)，一个Shine/Dalgamo序列(SD)及用于克隆的限制位点构成。将编码细菌的氯霉素乙酰转移酶基因(CAT152)5′-部分的152个氨基酸插入Trp启动子之后，编码人的SP-C(FF/1)中34个氨基酸的合成的基因片段融合到CAT 152 DNA的部分序列上。功能性CAT∷SPC(FF/1)转译单元通过细菌的rrnB转译终止子序列T1T2关闭，得到的结构物称为pTrpAmp-CAT 152∷CAT 34(FF/1)。
pTrpAmpCAT 152∷SPC 34(FF/1)因子具有下述功能性元件，CAT 152∷SPC 34(FF/1)基因，由Trp启动子和转译终止子控制；Ori区和邻近区域，通过该区控制质粒体拷贝数；AmP基因；在宿主细胞中引入质粒后，宿主细胞中有高拷贝数的Trp启动子控制的CAT∷SPC(FF/1)基因，Trp阻遏物由宿主细胞提供。
培养基中的色氨酸浓度或β-IAA(β-吲哚丙烯酸)的补加由rCAT∷SPC的发酵获得物控制。
2.批量发酵在振摇杯中的培养介质上(组成见后)用工作细胞库(甘油培养物)样本管接种(培养前或开始培养1升)，在强烈的氨苄青霉素选择条件下于37℃振摇孵化。以578mm光下的光密度跟踪生长情况。E.col199出发培养物的光密度多于3时，用该培养物接种10升的发酵罐，细菌在连续降低的氨苄青霉素浓度中增长，一旦光密度达到5-6之间，则将10升转移到100升发酵罐中并在同样条件下进一步孵化。增长充分之后，通过补加诸如400mg/升的β-IAA，诱导Trp启动子控制的CAT∷SPC(FF/1)转录单元，诱导后的这些细胞再培养4-5个小时直至收获。
在发酵期间发酵液的氧分压(pO2)，pH值和温度均由联机控制和调节。pH值用碱液保持恒定，氧分压(pO2)用调节氧气进口和搅拌转数控制。脱机则用来确定578nm的光密度和介质中的C(碳)源浓度。用一个泡沫传感器来确定泡沫形成，一旦有此情况为了消除泡沫，则配加一些抗泡沫物。
发酵液在不同的时限上取样。细菌分解后，为了检测表达将E.coli蛋白在聚丙烯酰胺凝胶上分离并染色。E.coli总蛋白的主要蛋白百分比是由密度测量而确定。诱导后不久再结合的基因则倾向于产生一个新的主蛋白带(rCAT∷SPC)。
培养基的组成如下豆蛋白胨27.0g/l，酵母自溶物KVA14.0g/l，NaC 15.0g/l，K2HPO4·3H2O6.0g/l，KHPO43.0g/l，MgSO4·FH2O0.5g/l，甘油(99.5％)30.0g/l，抗泡沫剂J 673(stuktol comp.产)0.2ml/l，L-色氨酸80mg/l，和每100立升1号培养液加20mg/l，2号培养液加5mg/l的氨苄青霉素。
在高压灭菌和无菌处理之前，发酵罐中的复合营养液用2N NaOH调节至pH6.8，对于10升前期发酵罐用750转/分搅拌并在37℃通入10升/分空气，而对100升的后期发酵罐用400转/分搅拌和在37℃通入70升/分空气。抗泡沫剂则在需要时用一次性注射器穿过隔板加入。
诱导经约4小时后，细胞用过滤或离心法从培养液中分离。这些湿细胞被收集在不锈钢容器中，加10升水解缓冲液在冷室中搅拌过夜(16小时，4℃)。搅拌过的细胞悬浮液在高压匀浆器(≥700巴)中破碎(温室)，并重新收集到一个消毒的不锈钢容器中。立即于4℃用过滤或离心法(Sorvalzentrifuqe RC2-B离心机，27000g)获得包涵体，再悬浮于缓冲液(约1升)中。然后将每350ml左右的此悬浮液转移入1升园底烧瓶中冻干约96小时。由100升发酵液能得到约200克干燥的包涵体，其中含20％重量的融合蛋白。冻干的包涵体可在-20℃贮存数月。
3.融合蛋白的裂解和亲脂肽SP-C(FF/1)的纯化
100克干燥的包涵体温热溶于1.6升8克分子浓度的盐酸胍溶液中(917.1克)。不溶残渣用折叠滤纸除去。加167克盐酸羟胺到溶液中以裂开融合蛋白的Asn-Gly结合点，用ZN NaoH调节溶液中至pH9.6。然后此裂解液于室温搅拌3-4天。在反应结束时加入6.4升Tris-缓冲液(三羟甲基氨基甲烷，pH8.0)以沉淀SP-C(FF/1)，并离心(Sorvallzentrifuge RC2-B，20000g)沉降物。倾出上层清液，SP-C沉淀重悬于400-500ml Tris缓冲液中，并在同样条件下离心30分钟。
所述SP-C沉淀溶在3.5升盐酸化的氯仿/甲醇混合液中(1.75升CHCl3+1.75升CHOH+约30毫升ZNHCl)。此SP-C溶液用C8反相柱的制备HPLC(高压液相色谱)纯化。由制备HPLC柱收集液的氯仿/甲醇提取液用90％甲醇按1∶2稀释。用直径5cm制备柱可以承载约400mg SP-C(FF/1)含量的这种溶液(约2升稀释粗提液)。SP-C(FF/1)在酸性条件下(pH2-3)用水/1-丙醇梯度洗脱(见分离条件)。色谱分离大约30分钟后，在SP-C洗脱区(220nm紫外检测)，收集4-6份200ml洗脱液。每份洗脱液用分析HPLC检查并适当合并。如果样品需要保存，则以液氮冷冻并在低温冰箱中于-80℃储存。精制物中SP-C(FF/1)含98.5-99.5％。
分离条件1柱 Kromasil C8 100A 16μm，300nm X 50nm I.D.
洗脱液A微孔聚合板(Millipore system)过滤的HPLC用水B异丙醇，线性梯度C60mmol/l Hcl(由浓Hcl稀释)梯度 时间 ％A ％B ％C 流量(ml/min)0 45505 10010 45505 10055 0955 10065 0955 10075 45505 10085 45505 10090 45505 0,24.SP-C(FF/1)参入磷脂基质中亲脂肽SP-C(FF-1)和磷脂基质成分的异丙醇溶液中混合，再于亲脂肽SP-C(FF-1)和磷脂基质成分的异丙醇溶液中混合，再于室温注入稀食盐溶液(0.065％w/wNaCl)，它和磷脂基质成分的均相混合物沉淀下来。由肺表面活性物悬浮液中LSF被离心分离，再悬浮在电解质(NaCl，CaCl2)溶液中，其pH值用0.1N NaOH调至pH6.5。这种水性悬浮液灌装于20ml小瓶中被冻干。下述的制法实例中，所给的重量和体积均按10克肺表面活性物制备。
7.00克二棕榈酰磷酰胆碱(DPPC)，3.08克棕榈酰油酰磷酸甘油酯铵盐(POPG x NH4)和0.25克棕榈酸于40℃溶于200ml90％异丙醇，然后冷却至室温。以1升该磷脂溶液经HPLC精制分离，得到含200mg纯化的SP-C(FF/1)溶液。此得到的喷射液在搅拌下用酸式碳酸盐溶液(ml5％NaHCO3溶液)调节pH4.5。
此喷射液于室温下以25ml/min流速经粗喷嘴注入强烈搅拌的9.6升稀NaCl溶液(0.065％w/w)。这样形成的半透明溶液在4°-8℃存放两小时后， 向其中注入一种电解质溶液(3.0gCaCl2·2H2O和61.3gNaCl溶入300mlH2O)，肺表面活性物质就沉淀下来。肺表面活性物的悬浮液(总体积10.8-11.0升)于4℃放置过液，再用Sorvall bonl离心机(RC2-B)以16000g每次离心30分钟。每次以其一半体积的0.65％强度NaCl溶液再悬浮并重新离心以从离心沉积物上除去异丙醇这个操作被重复3-4次。最后，离心的沉淀物被转移到400ml 0.65％强度NaCl水溶液中，用0.1N NaOH调节pH6.5，再以每6.2g一份分装于20ml小瓶中。小瓶中的内容物随之被冻干常压下-45℃冷冻约6小时，在0.16毫巴(mbar)-20℃真空冻干需54小时，在0.02mbar，-20℃高真空冻干需5小时。
这样共得65-66瓶，每批含0.150g肺表面活性物(不含NaCl)。
干燥的肺表面活性物质样品存放于4℃冰箱中，使用前必须和水或生理盐水再混悬(悬浮液浓度25mg/ml)。
每瓶含量95.6mg 二棕榈酰磷酰胆碱42.1mg 棕榈酰油酰磷酸甘油酯(铵盐)2.7mg SP-C(ff/1)6.8mg 棕榈酸2.9mg 氯化钙(无水物)
权利要求
1.具有肺表面活性物活性，通式为I的多肽0 1 23456789 10(A) GlyIle ProBB Pro Val His Leu Lys11 12 13 14 15 16 17 18 19 20ArgLeu Leu Ile Val Val Val Val Val Val(1)，21 22 23 24 25 26 27 28 29 30LeuIle Val Val Val Ile Val Gly Ala Leu31 32 33 34Leu C Gly Leu其中A代表H或PheB代表Phe或Trp和C代表Ile，Leu或Ser.
2.如权利要求1所述之多肽，其特征在于A为H或PheB为Phe和C为Ile
3.如权利要求1所述之多肽，其特征在于A为PheB为Phe和C为Ile
4.为治疗呼吸膨胀不全综合症(RDS)的吸入药物组合物，其特征在于其含有如权利要求1-3中之一的肺表面活性物活性多肽；
5.权利要求4中所述之药物组合物，其特征在于至少含有另一种选自SPA和SPB肺表面活性物活性多肽；
6.权利要求5中所述之药物组合物，其特征在于其含有SP-B；
7.权利要求4、5中所述之药物组合物，其特征在于含磷脂者；
8.权利要求7中所述之药物组合物，其特征在于含有二棕榈酰磷酰胆碱(DPPC)，棕榈酰油酰磷酸甘油脂(POPG)以及(或)磷酸甘油酯；
9.权利要求7中所述之药物组合物其特征在于，其含棕榈酸或电解质；
10.权利要求7中所述之药物组合物，其特征在于含有作为电解质的钙和/或钠盐。
全文摘要
本发明描述于一类通式为(I)的具有肺活性的多肽。其中A代表H或Phe，B代表Phc或Trp，C代表Ile，Leu或Ser。这些多肽能以高纯度的形式大量生产，并和天然的肺活性物质一样有效。它们可用于制备治疗新生儿和成人的呼吸窘迫综合症的药物组合物。
文档编号C07K14/785GK1154117SQ95194374
公开日1997年7月9日 申请日期1995年5月27日 优先权日1994年5月31日
发明者K·P·谢弗, K·梅尔歇尔斯, R·纳韦, W·R·乌尔里希, E·施图姆, U·克吕格尔, D·黑夫纳 申请人:比克·古尔顿·劳姆贝尔格化学公司