专利名称：利用产碱杆菌属的微生物制造杂芳香族羧酸的微生物学方法
技术领域：
本发明涉及制备具有下列通式的杂芳香族羧酸或其生理学上可吸收的盐的新的微生物学方法。 其中R1，R2可以是相同的或者不同并且是氢或者卤原子以及X代表氮或者-CH-。
杂芳族香羧酸例如6-羟基甲基吡啶酸是制备药物的重要的中间产物，例如用于制造2-羟基嘧啶(德国化学公司报告1912，45，2456-2467页)或者用于制造除草剂(EP-A 0447004)。
通常含有腈水化酶和酰胺酶或腈水解酶的微生物使腈转化为相应的酸是众所周知的。例如EP-A0187 680描述了借助于棒状杆菌属，诺卡氏菌属，芽孢杆菌属；Bacteridium，微球菌属以及短杆菌属的微生物制造有机酸例如烟酸的微生物学方法。该反应需要有光能存在才能完成.EP-A0444 640公开了利用红球菌属微生物制造有机酸如烟酸的微生物学方法.所述反应要求有内酰胺存在才能实现。
此外还已知例如玫瑰色红球菌J1菌株的微生物可将2-氰吡嗪转变为吡嗪羧酸(Kobayashi et al.，J.of Antibiotics，Vol.43，NO.10，1990，1316-1320页)但该微生物不能将2-氰吡啶转变为甲基吡啶酸(Mathew et al.，Appl.Environmental Microbiology，Vol.54，NO.4,1988,1030-1032页)。可由利用2-氰吡啶的微生物产碱杆菌属将2-氰吡啶转变为6-羟基甲其吡啶酸也是已知的(EP-A0504818)。但该方法具有缺点，即仅获得了中等产率的6-羟基甲基吡啶酸。
本发明的任务是提供一种利用产碱杆菌属微生物制造杂芳香族羧酸或者其生理学可接受盐如吡嗪羧酸，甲基吡啶酸或甲基吡啶酸铬的经济的微生物学方法，利用该方法获得较大产率的所制造的羧酸或生理学上可接受盐。
利用权利要求1所述方法可完成这一任务。
本发明的方法按下述方法进行，即借助于产碱杆菌属的能利用2-氰吡啶的微生物以具有下列通式的杂芳香族腈作为底物，将转化为通式I或II所述的杂芳香族羧酸，其中所述微生物在进行生物转化之前在一种二羧酸，三羧酸或一种碳水化合物存在下培养过， 其中X、R1和R2的含义如前所述。然后在所需情况下将该杂芳香族羧酸转化为生理学上可吸收的盐。作为该羧酸的生理学上可吸收的盐可理解为下列例举的铬、钙或铵盐。
在进行真正的生物转化之前需将该方法所用的产碱杆菌属微生物按常规方法进行培养并用2-氰吡啶诱导其有效酶。为了进行培养和诱导可以使用浓度为0.01-20W/W％，优选的是浓度为0.1-1W/W％的2-氰吡啶。
二羧酸指下列富马酸，琥白酸，苹果酸，戊二酸，丙二酸或其盐和衍生物如酯。
三羧酸，指下列柠檬酸，异柠檬酸或其盐和衍生物如酯。作为所述二羧酸和三羧酸的盐和衍生物，可以利用富马酸盐。苹果酸盐，丙二酸盐，草乙酸盐，柠檬酸盐，乌头酸盐，异柠檬酸盐，2-氧代戊二酸盐，琥珀酸盐或琥珀酰-CoA。优先使用富马酸盐，丙二酸盐或琥珀酸盐。
作为碳水化合物可利用下列单糖如葡萄糖，二糖如蔗糖，海藻糖或麦芽糖，三糖如棉子糖，糖醇如甘油。优先利用甘油作为碳水化合物。
二羧酸，三羧酸或者碳水化合物的适宜浓度是0.1-20W/W％，优先的使用浓度是0.5-5W/W％。
作为培养用的培养基可以是本领域内使用的任何普通培养基，例如Kulla等人描述的无机盐培养基(Arch.Microbiol.，135，1-7，1983)，低克分子浓度的磷酸盐缓冲液或者表1所述培养基。优先使用表1描述的培养基。
在培养阶段结束之后或者在加入底物之前，或者采用常规分离方法收集微生物或者直接将底物供给微生物。
对于生物转化使用的底物，通或III和IV的杂芳香族腈如2-氰吡啶是可购买的商品化合物。
在通式I-IV中X代表氮原子或者-CH-，优先的是-CH-。残基R1和R2相同或者不同，代表氢或者卤原子如氟，氯，溴或碘。
因此，可以使用的底物是2-氰吡啶，6-氯-2-氰吡啶，5，6一二氯-2-氰吡啶，2-氰吡嗪，6-氯-2-氰吡嗪，5-溴-6-氯-2-氰吡嗪。合适的底物是氰吡啶，2-氰吡嗪或者6-氯-2-氰吡啶。
用于生物转化的底物可以是一次性供给或者连续添加，合适的情况是底物添加后使底物浓度在培养基中不超过20％(W/W)，优选的是不超过10％(W/W)。
通常利用静止细胞完成的生物转化过程，适当的是用EP-A0504818公开的利用2-氰吡啶的保藏号为DSM6335的粪产碱杆种微生物或者功能等同的变异体和突变体来完成。该微生物于1991年1月3日按照布达佩斯条约规定寄存于德国微生物和细胞培养物收集有限公司，Mascheroder weg 16，D-38124 Braunschweig。
对于″功能等同的变异体和突变体″，指该微生物基本上具有与原始微生物相同的特性和功能.如此所述的变异体和突变体可以例如采用紫外线照射偶然获得。
用于生物转化的培养基可以与用于微生物培养的培养基相同，所述生物转化可在前面所述二羧酸，三羧酸或者碳水化合物存在或不存在的条件下实现。
合适的PH值在4-10范围内，优先的是在5-9范围内，实现生物转化的温度是10-50℃，优选的是20-40℃温度。
通常在经过6-100小时转化时间之后，采用常规的处理方法例如通过酸性化即得到通式I或II相应的羧酸。也可以分离出相应羧酸的盐形式如铵或者铬盐。
在好氧条件下完成生物转化时产生在第6位上羟基取代的杂芳香族羧酸(通式II)。在厌氧条件下实施生物转化时产生非羟基化的杂芳香族羧例如甲基吡啶酸。
实施例16-羟基甲基吡啶酸的制备选择下列条件用粪产碱杆菌DSM6335制备6-羟基甲基吡啶酸。使用工作体积为5升的一个7.5升发酵罐。在以富马酸钠作为唯一碳源和能源的无机盐培养基(表1)并以2-氰吡啶作为诱导剂，于30℃，PH7.0，600rpm条件下培养粪产碱杆菌DSM6335。其中通气量共计约3升/分钟。加入富马酸钠时应使pO2控制在大于30％。使用混合了0.5％2-氰吡啶的20％富马酸钠原液。将细胞在23小时内培养至在650nm处检测的光密度值(OD650)为16，然后开始进行真正的生物转化。在生长阶段需要消耗约160克的20％富马酸钠溶液(800ml)。
如在好氧生物转化条件下将2-氰吡啶转化为6-羟基甲基吡啶时不必添加碳源和能源。使用静止期细胞实现生物转化。
利用一个泵来限制2-氰吡啶的添加，利用HPLC″联机″自动检测来监督泵的工作。中间产物甲基吡啶酸的形成速率约比甲基吡啶酸转化为6-羟基甲基吡啶酸的转化速率高约2.5倍(10克/升.小时比千克/升.小时)应将该中间产物的浓度限制在＜2克/升的值，否则将抑制甲基吡啶酸向6-羟基甲基吡啶酸的转化。在室温下2-氰吡啶是一种固体材料，必须将含有2-氰吡啶的贮存容器加热到50℃，从而可以液体形式添加2-氰吡啶。利用该方法可在31小时内制造75克/升6-羟基甲基吡啶酸。在生物转化结束后不能再证实存在中间产物甲基吡啶酸。
为了分离6-羟基甲基吡啶酸，通过过滤将细胞分开。此后将无细胞溶液升温到60℃，并用浓缩的硫酸将PH调至2-2.5。在该PH值时6-羟基甲基吡啶酸从该溶液中沉淀。此后在搅拌条件下慢慢地冷至4℃，过滤，残留物用去离子水洗涤并干燥(100mbar，55℃)。该母液中约残留2克/升的6-羟其甲基吡啶酸，产量共计为起始的2-氰吡啶的87％。
表1成分 浓度(克/升)富马酸二钠 10酵母提取物 1MgCl2*6H2O 0.8Na2SO40.25(NH4)2SO41.0NH4Cl 2.33NaCl0.2CaCl2*2H2O 0.16MnSO41.8*10-2H3BO33*10-2NiCl22*10-3NaMoO43*10-3FeSO4*7H2O 0.3Na2EDTA*2H2O 0.752-氰吡啶1KH2PO40.4Na2HPO40.96实施例2甲基吡啶酸的制备按照实施例1描述的方法培养生物质。然后在严格厌氧条件下制备甲基吡啶酸。用一个500ml带橡胶塞的玻璃瓶进行生物转化，瓶中装有OD650＝20的400ml生物质，培养在30℃进行。在开始生物转化之前，通入纯氮提供厌氧条件。一边搅拌一边通过插管向容器中通入约30分钟氮气(500mbar超压)，以便定量地挤掉氧气。为了防止在生物转化和添加2-氰吡啶时氯气进入，在转化期间应维持通气(约10mbar超压)。以一小时期间添加12次每次直到10克/升的方案添加2-氰吡啶。该添加步骤当然也可连续进行。利用HPLC法检测在添加另一份以前是否已将其他的2-氰吡啶全部转化为甲基吡啶酸。在生物转化时，没有证实存在甲基吡啶酸酰胺。利用该方法可在26小时内制备约150克/升的甲基吡啶酸。该方法没有形成6-羟基甲基吡啶酸。
用CaCL2/H2SO4使无细胞甲基吡啶溶液沉淀以便分离。为此将实施例2的无细胞的甲基吡啶酸溶液稀释3倍，将该无细胞发酵液预热到90℃后，边搅拌边以0.5克当量CaCL2/每当量甲基吡啶酸的浓度掺入CaCL2。形成的Ca-甲基吡啶酸复合物立即沉淀。边搅拌将形成的复合物冷至4℃，用半熔的玻璃原料(孔隙度3)过滤并用蒸馏水洗涤。
过滤残留物悬浮于蒸馏水中并用浓硫酸酸化至PH为2.5。由此甲基吡啶酸从复合物中浸提出，同时形成了不溶性有硫酸钙。该游离的甲基吡啶酸有很好的水溶性，通过过滤可分离出硫酸钙。将甲基吡啶羧酸溶液蒸发至干，并进行分析，在滴定之后粗产率为大约70％，纯度为86％。根据Karl-Fischer方法测出含水量为0.7％。
实施例3甲基吡啶酸铬(III)的制备向放在一个500ml烧瓶中的PH7.1的甲基吡啶铵溶液(271.4克，0.325mol；16.8％)，在3.5小时时间内于73℃下滴加入六水合三氯酸铬水溶液(23.95克，溶于63ml水中的0.09mol Cr)。继续搅动该紫色溶液1小时，然后使其慢慢冷却到3℃。等产生的红色固体沉淀之后滗去其上的蓝色相。在30分钟内，将固体悬浮在100ml水中之后重新滗去液体。接下来将其再悬浮于50ml水(30分钟)之后，将该固体抽吸过滤并于50℃真空干燥。得到33.64克暗红色晶体(90％产率)。
实施例4用各种各样的碳源培养粪产碱杆菌DSM6335在300ml爱伦迈耳烧瓶中加入100ml A+N-培养基(表1中除去富马酸二钠盐)用于培养粪产碱杆菌(DSM 6335)。该培养基补加了2克/升2-氰吡啶和10克/升下列碳源富马酸二钠盐甘油丙二酸二钠盐琥白酸二钠盐培养是用摇床于30℃完成的。在生长16小时之后将细胞离心并重悬浮于含10克/升2-氰吡啶的新鲜A+N-培养基(无碳源)。在650nm(OD650)处测出该细胞悬浮液的光学密度为10。此后将细胞悬浮液(总体积10-20ml)于30℃重新培养。在308nm处用分光光度法检测无细胞溶液的吸收值跟踪6-羟基甲基吡啶酸的产生。下表给出了的产生的6-羟甲基吡啶酸的平均产生量碳源 产生量(以克/升.小时表示)富马酸二钠2.4甘油 2.0丙二酸二钠4.2琥珀酸二钠0.14实施例56-羟其吡嗪羧酸如实施例4的方法以富马酸作为碳源培养粪产碱杆菌(DSM6335)。将洗净的细胞重悬浮于含有10克/升2-氰吡啶嗪的A+N-培养基(OD650＝10)并于30℃进行培养.用分光光度计检测无细胞溶液于320nm处吸收值来跟踪6-羟基吡嗪羧酸的产生。通过在270nm处检测吸收值可确定减少的2-氰吡嗪(底物)的浓度。7小时之后所加入数量的2-氰吡嗪被转化为6-羟基吡嗪羧酸。
实施例66-氯甲基吡啶酸和吡嗪羧酸的制备。如实施例方法4的方法以富马酸作为碳源培养粪产碱杆菌(DSM6335)。将生长的细胞重悬浮于玻璃瓶中的A+N-培养基(OD650＝10)，该玻璃瓶可用橡胶塞封闭，并借助于插管通入氮气，以便去除溶解的氧气。此后向该细胞悬浮液中加入2-氰吡嗪或6-氯-2-氰吡啶作为底物，于30℃培养，3小时之后原料物质定量地转化为相应的酸[用薄层色谱层分析证明，带有荧光检测器的硅胶60，流动相氯仿30/乙醇55/NH4OH(25％)10/H2O5]。
权利要求
1.制备具有下列通式的杂芳香族羧酸或其生理学上可吸收盐的微生物学方法。 其中R1，R2相同或不同并且是H原子或卤原子而X代表氮原子或-CH-其特征在于，借助于能利用2-氰吡啶的产碱杆菌属微生物将具有下列通式的杂芳香族腈。 其中R1，R2和X的含义如上所述，转化为相应的羧酸，并在必要时再转化为生理学上可吸收的盐，其中在进行生物转化前将微生物在二羧酸，三羧酸或者碳水化合物存在下进行培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用保藏号为DSM6335的粪产碱杆菌种微生物或其功能等同的变异体和突变体来完成生物转化。
3.根据权利要求1或2所述的的方法，其特征在于，生物转化是在PH为4-10，温度为10-50℃条件下完成。
4.制造甲基吡啶酸或其生理学上可吸收盐的方法，其特征在于，在无氧条件下利用2-氰吡啶作为底物，借助于利用2-氰吡啶的产碱杆菌属微生物将2-氰吡啶转化为甲基吡啶酸并在必要时再转化为生理学上可吸收的盐，所述微生物在进行生物转化之前在有二羧酸存在下是进过培养。
全文摘要
描述了一种制造具有下列通式的杂芳香族羧酸或其生理学上可吸收盐的微生物方法其中R
文档编号C07D213/00GK1145956SQ9611047
公开日1997年3月26日 申请日期1996年6月7日 优先权日1995年6月7日
发明者A·基纳尔, J·P·罗杜因特, R·格洛克勒 申请人:瑞士隆萨股份公司