抗人白介素－5受体α链的抗体的制作方法

专利名称：抗人白介素－5受体α链的抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及单克隆抗体和人属性抗体，它们与一个人白介素-5受体α链特异性地结合并且因此能用于象慢性支气管哮喘的疾病的诊断和治疗。本发明还涉及生产该抗体的杂交瘤和转化体，借助于单克隆抗体和人属性抗体免疫检测白介素-5受体α链的方法，以及借助于单克隆抗体和人属性抗体诊断和治疗象慢性支气管哮喘的疾病的方法。
背景技术：
白介素-5(下文中称为“IL-5”)是一类由T细胞，肥大细胞和其他细胞分泌的淋巴因子。已知鼠IL-5作用是作为B细胞和嗜曙红细胞的一个分化和生长因子。已知人IL-5主要作用是作为嗜曙红细胞的分化和生长因子(Advances in Immunology，57，145(1994)；Blood，79，3101(1992))。IL-5通过一个特异性受体(IL-5受体)显示它的作用，该受体在象嗜曙红细胞的一个细胞表面表达。已经证明人和鼠IL-5受体(下文中称为“IL-5Rs”)都由两种不同种类的蛋白质，一个α链(下文中称为“IL-5Rα”)和一个β链(下文中称为“IL-5Rβ”组成。此外，已知IL-5与IL-5R的结合是借助于IL-5Rα的，IL-5Rβ单独不能与IL-5结合(EMBOJ.，9，4367(1990)；ibid.，10，2833(1991)；J.Exp.Med.177，1523(1993)；ibid.，175，341(1992)；细胞，66，1175(1991)，Proc.Natl.Acad.Sci.，89，7041(1992))。此外，已知IL-5Rβ是白介素-3(下文中称为“IL-3”)粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(下文中称为“GM-CSF”)和其它(Proc.Natl.Acad.Sci.，87，9655(1990)；Cell，66，1165(1991))的受体的一个组分。
已知在以慢性支气管哮喘为代表的变态反应性疾病中嗜曙红细胞增加。在有慢性支气管哮喘的病人的气管中明显观察到了嗜曙红细胞的渗入。嗜曙红细胞含有一个具细胞毒素的颗粒蛋白质，在有慢性支气管哮喘的病人的气管组织中或在有特异性皮炎的病人的损伤位置观察到该蛋白质的沉积。这些事实暗示了嗜曙红细胞在象慢性支气管哮喘，特异性皮炎，诸如此类的变态反应性疾病发病机制中起了一个重要作用(Adv.Immunol.39，377(1986)；Immunol.Today，13，501(1992))。所以，对于临床诊断研究嗜曙红细胞的动力学是有用的。另一方面，人IL-5特异性地作用于嗜曙红细胞，所以，据信IL-5R在嗜曙红细胞中特异性地表达，所以能用作特异于人嗜曙红细胞的一个标记。此外，IL-5Rβ是象IL-3，GM-CSF和其它细胞因子的一个受体，所以据认为I-5Rα是特异于嗜曙红细胞的一个标记。所以，利用一个抗人IL-5Rα链抗体(下文中称为“抗-hIL-5Rα抗体”)通过免疫细胞染色可以特异性地检测嗜曙红细胞。但是，目前知道还没有抗-hIL-5Rα抗体能特异性地检测嗜曙红细胞。
在IL-5转基因鼠中明显观察到嗜曙红细胞增多(J.Exp.Med.172，1425(1990)；ibid.173，429(1991)；Int.Immunol.2，965(1990))。在哮喘的动物模型中以抗IL-5抗体给药可抑制组织中嗜曙红细胞的渗入(Am.Rev.Resir.147，548(1993)；ibid.，148，1623(1993))。这些现象表明在体内嗜曙细胞的增多和嗜曙红细胞的渗入中IL-5确定起了一个重要作用。另有报道，IL-5在一个有慢性支气管哮喘的人患者的气管粘膜组织和有特异性皮炎的病人的损伤位置表达(J.Clin.Invest.87，1541(1991)；J.Exp.Med.，173，775(1991))。进一步的研究证明IL-5在体外显示增强作用于人嗜曙红细胞的生存力(免疫学杂志，143，2311(1989)IL-5是一个哮曙红细胞选择性活化剂(J.Exp.Med.，167，219(1988))。
所以，结合于IL-5R并且能抑制IL-5的生物学活性的抗体可期望抑制嗜曙红细胞的活性，因而在治疗象慢性支气管哮喘的变态反应性疾病中有用。通过把那些依赖于IL-5的细胞用作抗原，(这些细胞在他们表面表达大量的鼠IL-5R)，生产抗鼠IL-5Rα抗体，该抗体能抑制IL-5的生物学活性(Kokai(日本公开的未审查专利申请)No.108497/91；Int.Immunol.，2，181(1990))。但是，对于人的情况，没有细胞已知能表达大量的IL-5R且据报道嗜曙红细胞中IL-5R的表达很低(Cell.Immunol，133，484(1991))。所以，通过相同于生产抗鼠IL-5Rα抗体的方法生产具有与抗鼠IL-5Rα抗体相当的功能的抗人IL-5Rα抗体是困难的。在EMBO J.，14，3395(1995)中公开了作为抗人IL-5Rα抗体的命名为“α16”的抗体，但该抗体不具有对IL-5Rα的任何抑制活性。
通过从人嗜曙红细胞(J.Exp.Med，175，341(1992))或人早幼粒细胞HL-60(细胞66，1175(1991)；Kokai No.78772/94)制备一个cDNA文库并利用一个低聚DNA作为一个探针(它已经在鼠IL-5Rα的cDNA式鼠IL-5Rα的一个部分氨基酸序列的基础上合成)筛选文库(Kokai No.54690/94；EMBO J.9，4367(1990))得到人IL-5Rα基团。转移该cDNA进入一个寄主细胞，导致一个具有在其表面表达的hIL-5Rα的细胞的产生，但h IL-5R在这个细胞中的表达水平很低(≤104分子)(J.Exp.Med.177，1523(1993))。所以，如果有人试图通过利用该细胞作为一个免疫原生产抗-h IL-5Rα抗体，他将发现与来自一个寄主细胞的蛋白质相比，h IL-5Rα的相对量很小，h IL-5Rα的绝对蛋白质量也非常小。另外，在鼠IL-5Rα和人IL-5Rα之间观察到氨基酸水平上有大约80％的同源性并且鼠IL-5能以高亲和力结合到人IL-5R上(J.Exp.Med.，175，341(1992))。这些事实暗示了人IL-5Rα具有对小鼠或大鼠的一个较低的负疫原性，这两种动物一般被用作被免疫接种的动物。事实上，差不多我们所有的利用表达h IL-5Rα的细胞作为一个免疫原制备抗-h IL-5Rα抗体的计划都归于失败。
在从人嗜曙红细胞的一个cDNA文库中克隆IL-5RcDNA时，已经得到编码可溶性人IL-5Rα(下文中称为“sh IL-5Rα”)的cDNA，该cDNA对应于IL-5Rα的N-末端氨基酸序列(1-313)，该IL-5Rα在转膜区和前面有缺陷(J.Exp.Med.，175.341(1992))。当sh IL-5Rα被用作一个免疫原生产一个抗-h IL-5Rα抗体时，为了获得一个能抑制IL-5的生物学活性的抗-h IL-5Rα抗体，sh IL-5Rα应该具有相同于在细胞表面表达的IL-5Rα的三维构象并且应该由一个真核寄主细胞分泌和生产。此外，已经发现一个蛋白质的生产效率明显地依赖于信号肽而变化(蛋白质，核酸和酶，35，2584(1990))，所以必须选择一个合适的用于分泌和生产该蛋白质的信号肽。
正如上面提到的、已经发现在嗜曙红细胞中表达据信是仅编码sh IL-5Rα的mRNA。已经证明鼠IL-5R不仅在嗜曙红细胞中而且在B细胞中表达并且据认为是仅编码IL-5Rα的一个细胞外区的mRNA(下文中称为“sm IL-5Rα”)也在这些细胞中表达，对于人而言情况也同样。另外，有人报道在移植了表达IL-5R的鼠慢性B细胞白血病细胞系(BcL1)的鼠或人自动免疫疾病的模型鼠的血液中检测到smIL-5Rα(J.Immunol.Method，167，289(1994))。这些暗示了血液中分泌的sm IL-5Rα的量可以反映出表达IL-5R细胞的数目增加和他们的活化的可能性。据信在嗜曙红细胞中人IL-5R以一个有限量被表达并且血液中sh IL-5Rα的量可以潜在地反映嗜曙红细胞数目的增加和他们的活化。所以，预期sh IL-5Rα的定量测定可用于临床诊断。
任何与人IL-5Rα特异性结合的分离的单克隆抗体被确信在变态反应性疾病的诊断和治疗上是有用的。但是，应该注意的是如果给一个人施用一种非人的动物来源的单克隆抗体，它一般被认为是一个外源物质以致在人体中产生一个抗非人的动物来源的单克隆抗体的抗体，与施用的非人的动物来源的单克隆抗体的反应引起一个副作用(J.Clin.Oncol.，2，881(1984)；血液学；65，1349(1985)；J.Natl.CancerInst.，80，932(1988)；Proc.Natl.Acad.Sci.，82，1242(1985))，出现了过早清除非人的动物来源的单克隆抗体(J.Nucl.Med.，26，1011(1985)；血液学，65，1349(1985)；J.Natl.Cancer Inst.，80，937(1988))，或减弱单克隆抗体的治疗作用(免疫学杂志，135，1530(1985)；癌症研究，46，6489(1986))。
为了解决这些问题，已经进行尝试以便通过基因重组技术将非人动物来源单克隆抗体转变为人嵌合抗体式人CDR-移值抗体(重新构建的人抗体)。人嵌合抗体是它的可变区(下文中称为“V区”)起源于一个非人动物抗体和不变区(下文中称为“C区”)起源于一个人抗体的抗体(Proc.Natl.Acad.Sci.，81，6851(1984))。已经有人报道当给一个人施用一个人嵌合抗体时，难于产生抗非人动物起源单克隆抗体的抗体并且血液中的半生命期以一个6的系数增加(Proc.Natl.Acad.Sci.，86，4220(1989))。一个人CDR-移植抗体是一个它的CDR(互补决定区)被一个非人动物来源抗体的CDR代替的人抗体(自然学321，522(1986))。对猴子的实验已经报道了与一个鼠抗体相比，人CDR-移值抗体有一个较低的免疫原性，血液中的半生命期以一个4-5的系数增加(免疫学杂志147，1352(1991))。但是还没有关于一个抗h IL-5Rα的人属性抗体的报道。
当给一个人施用一种与人IL-5Rα特异性结合的人属性抗体时，可预望不会导致产生抗非人动物来源单克隆抗体的抗体，从而减少副作用和延长血液中的半生命期，这最终导致对象慢性支气管哮喘，特异性皮炎和诸如此类的变态反应性疾病的高治疗效果。
由于蛋白质和基因工程的最新进展，正在制备象单链抗体(科学，242，423(1988))和二硫化物稳定抗体(分子免疫学32 249(1995)的较小的抗体分子。由于单链抗体和二硫化物稳定抗体有比单克隆抗体和人属性抗体更小的分子量，他们在转移进入组织和从血液中清除时是有效的并且正在进行将他们用于成像技术和具有毒素的复合物的制备中以提供保证治疗效力(癌症研究，55，318(1995))。如果产生与一个人IL-5Rα特异性结合的一个单链抗体或一个二硫化物稳定抗体，可以预期对变态反应性疾病和诸如此类的高诊断和治疗效果。但是，还没有关于抗人IL-5Rα链的一个单链抗体和一个二硫化物稳定抗体的报道。
发明的公开发明者发现采用免疫细胞染色方法，识别人IL-5Rα链的N-末端氨基酸序列1-313位置的一个抗原决定基(该抗原决定基对应于一个在转膜区和前面有缺陷的细胞外区)的抗h IL-5Rα链抗体，与人白介素-5受体α链特异性地反应，并且抑制白介素-5的生物学活性。这些抗体可以用于前面提到的变态反应性疾病的诊断和治疗。
所以，本发明提供与人IL-5Rα链特异性地反应的抗体。本发明的抗体包括单克隆抗体，人属性抗体，单链抗体，二硫化物稳定抗体和诸如此类。本发明的抗体可以是任何种类，只要他的与h IL-5Rα链特异性地反应。用下面解释的方法生产的那些是优选的。简要地说，制备h IL-5Rα蛋白质作为抗原并用于免疫象小鼠，大鼠，仓鼠，兔子和诸如此类用于制备杂交瘤的动物，从而诱导具有抗原特异性的血浆细胞。血浆细胞与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤，杂交瘤可以生产单克隆抗体，培养杂交瘤得到所需要的抗-IL-5Rα单克隆抗体。只要识别来自人IL-5Rα链的N-末端氨基酸的1-313位置的一个抗原决定区并且在免疫细胞染色时与人IL-5Rα链特异性地反应的任何单克隆抗体都可以被利用。可选择地只要能识别来自人IL-5Rα链的N-末端氨基酸的1-313位置的抗原决定基并且抑制人IL-5的生物学活性的任何单克隆抗体都可以被利用。前面的单克隆抗体的例子是杂交瘤KM1257(FERM BP-5133)生产的单克隆抗体KM1257。后面的单克隆抗体的例子是杂交瘤KM1259(FERM BP-51347)生产的KM1259和杂交瘤KM1486(FERM BP-5651)生产的KM1486。
本发明的单克隆抗体与一个人IL-5Rα链，一个具有在表面表达人IL-5Rα链的细胞，人嗜曙红细胞和诸如此类发生免疫学反应。本发明的单克隆抗体与一个可溶性的人IL-5Rα链发生免疫反应。所以，本发明还提供一个免疫检测和测定人IL-5Rα链，具有在表面表达人IL-5Rα链的细胞，人嗜曙红细胞和一个可溶的人IL-5Rα链的方法。检测和测定的结果可以用于象慢性支气管哮喘，特异性皮炎和诸如此类的变态反应性疾病的诊断和治疗。
本发明还提供了具有比单克隆抗体更少副作用并具有延长的半生命期而且以一个更如人愿的方法在治疗中抑制IL-5的生物学活性的人属性抗体。本发明的术语“人属性抗体”是人嵌合抗体和人CDR-移植抗体的通用术语。
术语“人嵌合抗体”指一个含有一个非人动物抗体的一个重链的可变区(下文中称为“VH”)和一个轻链的可变区(下文中称为“VL”)，以及一种人抗体的一个重链的不变区(下文中称为“CH”)和一种轻链的不变区(下文中称为“CL”)的抗体。术语“人CDR-移植抗体”是指一种抗体，其中一种人抗体的VH和VL的CDR序列分别被一种非人动物抗体的VH和VL的CDR序列代替。一种抑制IL-5的生物学活性的抗-h IL-5Rα链人嵌合抗体可以通过一个过程表达和产生，该过程包括生产抑制IL-5的生物学活性的抗体的一个杂交瘤得到编码VH和VL的cDNA，为了在动物细胞中表达把各自的cDNA插入一个载体，它含有编码人抗体CH和人抗体CL的一个基因，从而构建一个人嵌合抗体表达载体和把该表达载体转染进一步动物细胞的步骤。本发明的人嵌合抗体和人CDR-移植抗体可以是任何免疫球蛋白(Ig)类并优选的是一个IgG类。另外，可以使用任何免疫球蛋白的IgG亚类象IgG1，IgG2，IgG3和IgG4的C区。
本发明的人嵌合抗体的例子包括一个抗体，它的VH含有SEQID NO24的氨基酸序列，CH是人抗体IgG1，VL含有SEQ IDNO25的氨基酸序列和CL和人抗体K。一个具体的例子是一种命名为“KM1399”的抗体。人嵌合抗体的具体例子，其中的CH是人抗体IgG4，是一个命名为“KM7399”的抗体。KM1399可以例如由转化体KM1399(FERM BP-5650)生产。KM7399可以例如由转化体KM7399(FERM BP-5649)生产。
抗-h IL-5Rα链人CDR-移值抗体(它抑制IL-5的生物学活性)可以用下列方法表达和生产，该方法包括构建编码V区的cDNA，所述V区中任何人抗体的VH和VL的CDR序列分别被一个能抑制IL-5的生物学活性的非人动物抗体的VH和VL的CDR序列代替，为了在动物细胞中表达把各自的cDNA插入一个载体，它含有一个编码人抗体CH和人抗体CL的基因，从而构建一个人CDR-移植的抗体表达载体，和把表达载体转染进入一个动物细胞的步骤。本发明的人CDR-移植抗体的例子包括一个抗体，它的VH含有SEQ ID NO72的氨基酸序列，和CH是人抗体IgG1，VL含有SEQ ID NO63的氨基酸序列，和CL是人抗体K。一个具体的例子是一个命名为“KM8399”的抗体。人CDR-移植抗体的一个具体的例子(它的CH是人抗体IgG4)是一个命名为“KM9399”的抗体。KM8399可以例如由转化体KM8399(FERM BP-5648)生产。KM9399可以例如由转化体KM9399(FERM BP-5647)生产。
本发明的人属性抗体与一个人IL-5Rα链，一个具有在其表面表达人IL-5Rα链的细胞，人嗜曙红细胞和诸如此类发生免疫反应。所以，本发明的人属性抗体可以用于象慢性支气管哮喘，特异性皮炎和诸如此类的变态反应性疾病的诊断和治疗。
另外，本发明提供了单链抗体(单链FV；下文中称为“scFv”)和二硫化物稳定抗体(二硫化物稳定FV；下文中称为“dsFv”)，它们显示了与人IL-5Rα链结合的能力。
术语“单链抗体(scFv)”指由通式VH-L-VL或VL-L-VH代表的多肽，其中一个VH的单链和一个VL的单链由一个适当的肽接头(下文中称为“L”)连接。任何抗人IL-5Rα链单克隆抗体或人CDR-移值抗体可以用作本发明的scFv中的VH和VL。
术语“二硫化物稳定抗体(dsFv)”是指一个通过一个二硫键结合两个多肽制备的抗体，其中VH和VL的各一个氨基酸残基被半胱氨酸残基替代。被半胱氨酸残基替代的氨基酸残基可以根据Reiter et al.叙述的方法(蛋白质工程技术，7，697(1994))在假定的一个抗体空间结构基础上选择。鼠抗人IL-5Rα链单克隆抗体或人CDR-移值抗体可以在本发明的二硫化物稳定抗体中用作VH或VL。
它具有一个与一个人IL-5Rα链结合的能力的单链抗体，可以由下列方法表达和生产，该方法包括从它生产与人IL一5Rα链反应的抗体的杂交瘤得到编码VH和VL的cDNA，构建一个单链抗体表达载体和把表达载体转染进大肠杆菌，酵母或动物细胞的步骤。本发明的来源于单克隆抗体的单链抗体的例子包括一个抗体，它的VH含有SEQ ID NO24的氨基酸序列和VL含有SEQID NO25的氨基酸序列。本发明的来源于人CDR-移植抗体的半链抗体的例子包括一个抗体，它的VH含有SEQ ID NO72的氨基酸序列和VL含有SEQ ID NO63的氨基酸序列。
具有与人IL-5Rα链结合的能力的二硫化物稳定抗体可以由下面方法生产和表达，该方法包括从生产与人IL-5Rα链反应的抗体的杂交瘤得到编码VH和VL的cDNA，把cDNA插入一个适当的表达载体，和把该表达载体转染进大肠杆菌，酵母或动物细胞的步骤。本发明的单克隆抗体起源的二硫化物稳定抗体的例子包括一个抗体，它的VH含有SEQ IN NO24的氨基酸序列和VL含有SEQ ID NO25的氨基酸序列。本发明的人CDR-移植抗体起源的二硫化物稳定抗体的例子包括一个抗体，它的VH含有SEQID NO72的氨基酸序列和VL含有SEQ ID NO63的氨基酸序列。
现在将详细解释生产抗人IL-5Rα链单克隆抗体的方法，所述抗体与人IL-5Rα链特异性地反应或者抑制人IL-5的生物学活性，和生产抗人IL-5Rα链人属性抗体，抗人IL-5Rα链单链抗体和抗人IL-5Rα链二硫化物稳定抗体的方法，所有这些抗体抑制人IL-5的生物学活性，以及一个借助所说的抗体检测和测定人白介素-5受体α链的方法。
1.生产抗-h IL-5Rα单克隆抗体(1)制备抗原具有在其细胞表面表达的h IL-5Rα的细胞或其细胞膜部分，或表达h IL-5Rα的细胞CTLL-2(h5R)或其细胞膜部分可以用作生产抗-h IL-5α单克隆抗体的抗原。CTLL-2(h5R)是一个表达h IL-5Rα的细胞，它是通过把编码全长序列的预克隆的hIL-5Rα的cDNA(J.Exp.Med.175，341(1992))插入一个象pCAGGS的动物细胞表达载体(基因，108，193(1991))并把该表达载体转染进鼠T细胞系CTLL-2得到的。
为了在象大肠杆菌的原核寄主细胞中表达，可以把编码h IL-5Rα的cDNA的一个全长或部分片段插入一个象有待下面实施例1的部分(11)中叙述的可买到的pGEX(Pharmacia)，pET系统(NO Vagen)，pMKexl或诸如此类的表达载体并且全长h IL-5Rα序列或其一个部分片段可以其本身或作为一个融合蛋白表达。在裂解细胞后，可以根据融合蛋白的特性或诸如此类通过SDS-聚丙烯酰胺电泳，亲和层析来纯化大肠杆菌表达的蛋白质。
在就这样或以融合蛋白形式表达全长度IL-5Rα序列或一个其部分片段的方法中，可以用到象昆虫细胞，哺乳动物细胞和诸如此类的真核生物寄主细胞。
对于利用哺乳动物的细胞的情况下，把编码h IL-5Rα的cDNA的全长度或一个部分片断插入象有待于实施例1部分(1)中叙述的pAGE107(细胞技术学，3，133(1990))，pAGE103(J.Biochem.，101，1307(1987))，pAGE210或诸如此类的一个载体中，从而构建一个蛋白质的表达载体。为了有效地表达其本身或以融合蛋白形式的cDNA编码全长度h IL-5Rα序列或一个其部分片段，在cDNA中编码一个信号肽的核苷酸序列优选地被编码在真核寄主细胞中可以高水平表达的蛋白质的信号肽的核苷酸序列替代。优选用到的已知蛋白质信号肽包括人生长激素，抗神经节苷脂GD3嵌合抗KM871(Kokai No.304 989/93)的那些和诸如此类。
通过已知的象电穿孔(Kokai No.257891/90；细胞工程技术，3，133(1990))，脂质转染方法(Proc.Natl.Acad.Sci.，84，7413(1987))或者诸如此类的方法可以把上面构建的表达载体转染进寄主细胞。在一个适当的在培养基中培养细胞可以导致在细胞中或培养上清液中产生以其本身或以融合蛋白形式的全长h IL-5Rα序列或一个其部分片段。优选用到的是无血清培养基，因为它有助于培养上清液中产生的h IL-5Rα的部分片段或融合蛋白的纯化。
对于利用昆虫细胞的情况，利用Baculo Gold Starter试剂盒(Pharmingen)将编码h IL-5Rα的cDNA的全长度或部分片段插入以制备一个重组杆状病毒并且用重组病毒感染sf9，sf21的昆虫细胞(Pharmingen)或诸如此类以致在细胞或培养上清液中以其本身或以融合蛋白形式产生全长度h IL-5Rα序列或其部分片段(Bio/Technology，6，47(1988))。
通过象盐析，亲和层析，离子交换层析或诸如此类的已知的蛋白质纯化方法可以从培养上清液或诸如此类中纯化动物或昆虫细胞产生的全长度h IL-5Rα序列或其一个部分片段或融合蛋白并能用作一个抗原。特别是在h IL-5Rα作为带有免疫球蛋白不变区的一个融合蛋白形式产生的情况中，优选地纯化是利用一个具有固定其上的蛋白质A的亲和柱进行的，该蛋白质具有与免疫球蛋白的不变区具特异性亲和力。
(2)免疫接种动物和制备生产抗体的细胞假如他们能用来制备杂交瘤，任何动物，象小鼠，大鼠，仓鼠，免子和诸如此类都可以用作被免疫的动物。本文将解释一个利用小鼠或大鼠的实施方案。把sh IL-5Rα或CTLL-2(它们具有在其表面表达的h IL-5Rα(J.Exp.Med.，177，1523(1993))作为抗原免疫接种3-20个星期大的小鼠和大鼠并从动物的脾，淋巴结，和外周血液中收集产生抗体的细胞。免疫接种是通过以皮下注射，静脉注射或腹腔注射方式将抗原和一种象完全佛氏佐剂或氢氧化铝胶和百日咳疫苗的结合物的适当的佐剂一起施用到动物而完成的。在第一次给药后以1-2星期的间隔施用抗原5-10次。在每次给药3-7天后从眼球静脉从收集血液，用酶免疫测定检测血清中与抗原的反应性(“酶免疫测定(ELISA)”，Igakushoin公开，1976)。
用于免疫接种时其血清显示对sh IL-5Rα具良好的抗体效价的小鼠或大鼠或具有在其表面上表达的h IL-5Rα的细胞可以用作产生抗体的细胞源。
为了进行脾细胞与骨髓瘤细胞的融合，从最后施用抗原物质3-7天后的免疫接种鼠中取出脾并收集脾细胞。在MEM培养基(Nissui Pharmaceuticals)中把脾切成薄片并用一对镊子分散。在离心(1，200rpm，5分钟)后，除去上清液。用Tris-NH4Cl缓冲液(pH7.65)处理沉淀1-2分钟除去红细胞并用MEM培养基洗3次制备用于细胞融合的脾细胞。
(3)制备骨髓瘤细胞利用一个来源于小鼠或大鼠的已建立的细胞系作为骨髓瘤细胞。例子包括起源于耐8-氮杂鸟嘌呤的小鼠(BALB/C)的骨髓瘤细胞系P3-X63Ag8-U1(P3-U1)(Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.81，1(1978)；Europ.J.Immunol.，6，511(1976))，SP2/0-Ag14(SP-2)(自然学，276，269(1978))，P3-X63-Ag8653(653)(免疫学杂志，123，1548(1979))和P3-X63-Ag8(X63)，(自然学，256，495(1975))。将这些细胞系在8-氮杂鸟嘌呤培养基中次代培养，所述培养基是进一步补充了8-氮杂鸟嘌呤(15μg/ml)的补充了谷氨酰胺(1.5mM)，2-巯基乙醇(5×10-5M)，庆大霉素(10μg/ml)和胎牛血清(FCS)(CSL，10％)的RPM2-1640培养基(下文中称为“正规培养基”)。它们在细胞融合之前应该在正规培养基中次代培养3-4天保证在细胞融合的当天有至少2×107细胞的细胞量。
(4)细胞融合用MEM介质或PBS(1.83g磷酸二钠，0.21g磷酸单钾，7.65g NaCl，1升蒸馏水，pH7.2)彻底洗涤1(2)中叙述的生产抗体的细胞和1(3)中叙述的骨髓瘤细胞。以生产抗体细胞对骨髓细胞的细胞量比例为5-10∶1，混合这些细胞。离心(1，200rpm，5分钟)后，除去上清液。分散沉淀细胞，然后边搅拌边向0.2-1ml/108产生抗体的细胞的量的细胞中加入含有乙二醇-1000(PEG-1000)(2g)，MEM(2ml)，和二甲亚砜(DMSO)(0.7ml)的混合溶液。以1-2分钟的间隔加几次MEM培养基(1-2ml)并再加MEM介质使总量为50ml。离心(900rpm，5分钟)后除去上清液。用一个吸管抽吸和喷出，温和地分散细胞，然后温和地悬浮于100ml的一种HAT培养基(补充了10-4M次黄嘌呤，1.5×10-5M胸苷和4×10-7M氨基嘌呤的正规培养基)中。
把细胞悬浮液以100μl/孔的量分配到一个96-孔培养平板并在5％CO2的培养箱，在37℃培养7-14天。
培养后，用将在1(5)中叙述的酶免疫测定法检查培养上清液的一个等分试样来选择与象1(1)中叙述的带有sh IL-5Rα和h IL-5Rα的融合蛋白的重组蛋白特异性反应的孔。随后，有限稀释而无性增殖重复2次，在第一次无性增殖中用一个无氨基嘌呤的HAT培养基，第二次无性增殖用一种正规培养基。选择稳定显示高抗体效价的细胞作为杂交瘤细胞，它产生小鼠或大鼠抗-h IL-5Rα单克隆抗体。
(5)选择小鼠或大鼠抗人IL-5Rα单克隆抗体通过下面叙述的测量方法，根据在抗体，实验手册，冷泉港实验室14章(1988)中叙述的方法选择产生大鼠或小鼠抗-h IL-5Rα单克隆抗体的杂交瘤。通过该方法，可以测定将在下面叙述的生产一种抗-h IL-5Rα人属性抗体，一种单链抗体或一种二硫化物稳定抗体的转化体的培养上清液中的抗-h IL-5Rα抗体的活性或者有纯化的抗-h IL-5Rα抗体的活性。
用sh IL-5Rα或象1(1)中叙述的带有h IL-5Rα的融合蛋白的重组蛋白包被一个适当的平板。平板与一个一级抗体反应，该抗体是杂交瘤培养上清液或将在1(6)中得到的纯化抗体，及与一个二级抗体反应，该抗体是用生物素，酶，化学荧光物质或放射性化合物标记的一种抗小鼠免疫球蛋白抗体或一种抗大鼠免疫球蛋白抗体。随后，依据根据标记的特殊种类进行一个反应，从而选择一个与h IL-5Rα特异性反应的杂交瘤作为生产鼠抗-hIL-5R单克隆抗体的杂交瘤。
如果生产一个抗h IL-5Rα属性抗体，一个单链抗体或一个二硫化物稳定抗体，或一个从中纯化的抗体的转化体的培养上清液作为一个一级抗体进行反应，那么一个用生物素，酶，化学荧光物质或放射性化合物标记的抗人免疫球蛋白抗体被用作一个二级抗体并且为了检测根据标记的特殊类型实施一个反应。
用sh IL-5Rα或一个象1(1)中叙述的带有一个重组蛋白h IL-5Rα的融合蛋白的重组蛋白包被一个适当的平板。将一个杂交瘤培养上清液，生产一个抗-h IL-5Rα人属性抗体，一个单链抗体或一个二硫化物稳定抗体，或一个从中纯化的抗体的转化体的培养上清液之任何一种与用生物素，酶，化学荧光物质或放射性化合物标记的人IL-5混和反应。随后，为了确定抑制人IL-5与人IL-5Rα结合的活性，根据标记的特殊种类进行一个反应。这个方法用来筛选杂交瘤以选择一个具有抗人IL-5的高抑制活性的。
(6)生产大鼠或小鼠单克隆抗体。
用异十八烷处理8-10周龄的小鼠或裸鼠，更具体地说，给鼠腹腔注射异十八烷(2，6，10，14-四甲基十五烷，0.5ml)并喂养2星期。以2×107-5×106细胞/鼠的量给鼠腹腔注射产生小鼠或大鼠抗-h IL-5Rα单克隆抗体的杂交瘤细胞系(如1(3)中得到)。在用药后10-21天杂交瘤引起产生腹水肿瘤。从鼠中收集腹水并离心(3,000rpm，5分钟)以便移走固体部分。盐析沉淀并上样到用于辛酸沉淀的柱，或上样到DEAE-琼脂糖凝胶柱，或加到蛋白质A-柱或一个Cellulofine GSL2000柱(Biochemical Industry)来收集IgG或IgM组分。将这些组分用作一个纯化的单克隆抗体。
用一个测定小鼠或大鼠单克隆抗体类型的试剂盒测定抗体的亚类。用Lowry方法或根据280nm处的吸光值计算蛋白质的总量。
2.生产抗人IL-5Rα人属性抗体(1)构建人属性抗体表达载体为了从一个非人动物抗体生产一个人属性抗体，制备了一个人属性化抗体表达载体。人属性化抗体表达载体是一个在动物细胞中表达的载体，其中已经转染了一个编码CH和CL，一个人属性化抗体的C区的基因。这样一种表达载体是通过把两个基因，一个编码人属性化抗体的CH和另一个编码人属性化抗体的CL，插入一个动物细胞的表达载体而构建的。可以使用一个人抗体的任何C区，象一个人抗体H链的Cv1和Cv4，一个人抗体L链的Ck和诸如此类。可以把含有一个外显子和一个内含子或cDNA的染色体DNA用作编码一个人抗体C区的基因。假如它们掺入和表达一个编码一个人抗体的一个C区的基因，任何表达载体可以用作动物细胞表达载体。例子有pAGE(0)(细胞工程技术，3，133(1990))，pAGE103(生物化学杂志，101，1307(1987))，pHSG274(基因，27，223(1984))，pKCR(Proc.Natl.Acad.Sci.，78，1527(1981)和pSG1βd2-4(细胞工程技术，4.173(1990))。用于制备一个动物细胞表达载体的启动子和增强子的例子是一个SV40早期启动子和增强子(生物化学杂志101，1307(1987))，一个莫洛尼氏鼠白血病毒LTR启动子和增强子(Biochem.Biophys.Res.Commun.149，960(1987))，一个免疫球蛋白H链启动子(细胞，41，479(1985))和增强子(细胞，33 717(1983))和诸如此类。
人属性化抗体表达载体可以是其中一个编码抗体H链的基因和一个编码抗体体L链的基因存在于单独分开的载体上的类型或者其中两个基因存在于同一载体(串联型)上的类型。从容易构建一个人属性化抗体表达载体，容易导入动物细胞，平衡抗体H和L链之间的表达量出发和为了其他原因，一个串联型人属性化抗体表达载体更为优选(免疫学方法杂志，167，271(1994))。
(2)制备编码非人动物抗体VH和VL的cDNA例如按如下所述获得编码一个非人动物抗体象一个鼠抗人IL-5Rα链单克隆抗体的VH和VL的cDNA从象生产鼠抗人IL-5Rα链抗体的杂交瘤的一个生产抗人IL-5Rα链单克隆抗体的细胞提取mRNA并用来合成cDNA。将合成的cDNA插入象一个噬菌体或一个质粒的载体而制备一个cDNA文库。从该文库中，把象一个鼠抗体的非人动物抗体的V或C区中的一部分作为一个探针，分开分离了含有编码VH的cDNA一个重组噬菌体或质粒和含有编码VL的cDNA的一个重组噬菌体或质粒。确定了存在于重组噬菌体或质粒中的所关心的抗体的VH和VL的整个核苷酸序列并从核苷酸序列推断VH和VL的整个氨基酸序列。
(3)构建人嵌合抗体表达载体通过在2(1)中构建的人属性化抗体表达载体的编码人抗体CH和CL的基因上游的一个区中插入编码一个非人动物抗体的VH和VL的cDNA可以构建一个人嵌合抗体表达载体。例如，在一个嵌合抗体表达载体的编码人抗体CH和CL的一个基因的上游的一个区中预先创制了一个用于克隆编码非人动物抗体的VH和VL的cDNA的限制酶识别位点。在该克隆位点，通过一个合成DNA(看下面)将编码一个非人动物抗体的V区的cDNA插入来制备一个人嵌合抗体表达载体。该合成DNA含有非人动物抗体的一个V区的3’末端的一个核苷酸序列和人抗体的一个C区的5’末端的一个核苷酸序列并由一个DNA合成仪来制备使之在两末端都有适当的限制酶位点。
(4)鉴定非人动物抗体的CDR序列形成一个抗体的抗原结合位点的VH和VL含有3个具有各个序列种类的互补决定区(CDRS)，它们把VH和VL与4个具有相当保守序列(免疫学有甲蛋白质序列，US健康与人服务部，1991)的主架组织区(下文中称为“FR区”)。通过与已知抗体的V区的氨基酸序列(免疫学有用的蛋白质的序列，US健康与人服务部，1991)比较可以鉴定各个CDR(CDR序列)的氨基酸序列。
(5)构建编码人CDR-移植抗体的V区的cDNA编码一个人CDR-移植抗体的VH和VL的cDNA可以如下获得在第一步中，对于每个VH和VL，选择一个人抗体的一个V区中的FR的氨基酸序列，该抗体移植了一个非人动物抗体的V区的CDR。任何起源于人抗体的V区中的FRS的氨基酸序列都可以用作人抗体V区中的FRs的氨基酸序列。例如，可以利用记录在蛋白质数据库的人抗体的V区中的FRS的氨基酸序列和相同于人抗体的V区中的FRs的的亚类的氨基酸序列(免疫学有用的蛋白质的序列，US健康与人服务部，1991)。为了生产一个具有良好活性的人CDR-移植抗体，与有用的非人动物抗体的一个V区的氨基酸序列具有高度同源性的氨基酸序列是令人满意的。在第二步中，将编码所选择的人抗体的V区的FR的氨基酸序列的DNA序列连接到编码非人动物抗体的V区的CDR的氨基酸序列的DNA序列上并且设计3’编码VH和VL氨基酸序列的DNA序列。为了得到所设计的DNA序列以用于构建CDR-移值抗体可变区基因，对每条链设计了几个合成DNAs以致覆盖了全长DNA序列。利用合成的DNA进行聚合酶链反应(下文中称为“PCR”)。对于每条链，考虑到PCR的反应效率和可以合成的DNA的长度优先设计了6个合成DNA。反应后，把扩增的片段亚克隆到适当的载体并测定他们的核苷酸序列，从而得到一个质粒，该质粒含有编码有用的人CDR-移植抗体的每条链的V区的氨基酸序列的cDNA。另一种可选择的方法，可以通过利用含有约100个碱基的合成DNA合成有意义和反义链的全序列并进行退火和连接来构建编码所需人CDR-移植抗体的每条链的V区的氨基酸序列的cDNA。
(6)修饰人CDR-移植抗体的V区的氨基酸序列已知，如果通过简单地在一个人抗体的V区的FR之间只简单地移植有用的非人动物抗体的V区中的CDR制备一个人CDR-移植抗体，它的活性低于原始非人动物抗体的活性(BIO/TECHNOLOGY，9，266(1991))。所以，在人抗体的一个V区中的FR的氨基酸序列之间，一个参与直接结合一个抗原的氨基酸残基，一个与CDR的一个氨基酸残基相互作用的氨基酸残基，或一个参与维持抗体的空间结构的氨基酸残基被修饰成在原始非人动物抗体中发现的一个氨基酸残基以致人CDR-移植抗体的活性增加。为了有效地鉴定该氨基酸残基，通过X-射线晶体衍射，计算机-模型设计或诸如此类构建和分析了一个抗体的空间结构。但是，还没有建立适用于任何抗体的生产一个人CDR-移植抗体的方法，所以，在各种情况的基础上目前必须做各种尝试。
通过2(5)中叙述的PCR，利用各种突变引物可以完成对所选择的人抗体的一个V区中的FR的氨基酸序列进行修饰。把PCR得到的扩增片段亚克隆到适当的载体并确定它们的核苷酸序列，从而得到一个含有其中导入了所需要的一个突变的cDNA的载体(下文中称为“氨基酸序列-替代载体”)。
可选择地，利用含有20-35碱基的用于突变的引物通过PCR诱变可以完成在一个狭窄区域的氨基酸序列的修饰。更具体地说，利用一个含有编码待修饰的一个V区的氨基酸序列的cDNA的质粒作为模板合成含有20-35碱基并含有编码待修饰的氨基酸残基的DNA序列的一个有意义突变引物和一个反义突变引物并用于进行2-步骤PCR。把最后的扩增片段亚克隆进适当的载体并测定它们的核苷酸序列，从而获得一个含有其中已经导入了一个需要的突变的cDNA的氨基酸序列修饰载体。
(7)构建人CDR-移植抗体表达载体通过在2(1)中叙述的人属性化抗体表达载体中的编码人抗体的CH和CL的基因上游的一个区中插入编码2(5)和2(6)中得到的人CDR-移植抗体的VH和VL的cDNA可以构建一个人CDR-移植抗体表达载体。例如，为了构建编码人CDR-移植抗体的VH和VL的氨基酸序列的cDNA，在PCR过程中在5’和3’末端合成DNA的末端导入适当酶的识别位点，那么可将该cDNA插入一个编码所需要的人抗体的C区的基因的上游的一个区中。
(8)瞬时表达人属性化抗体和估计它们的活性为了有效地估计各个种类的人属性化抗体的活性，可以把2(3)中叙述的人嵌合抗体表达载体，和2(7)中叙述的人CDR-移植抗体表达载体或它们的修饰载体转染进COS-7细胞(ATCC CRL1651)并且瞬时地表达人属性化抗体(核酸研究中的方法CRC Press，P.283，1991)，接着确定它们的活性。
转染表达载体进入一个COS-7细胞的方法的例子包括一种DEAE-葡聚糖方法(核酸研究中的方法，CRCPress，P.283，1991)，一种脂质转染法(Proc.Natl.Acad.Sci.，84，7413(1987))和诸如此类。
在转染载体之后，通过1(5)中叙述的酶免疫测定(ELISA)和诸如此类方法可以测定培养上清液中人属性化抗体的活性。
(9)稳定表达人属性化抗体和估计他们的活性通过把2(3)中叙述的人嵌合抗体表达载体和2(7)中叙述的人CDR-移值抗体表达载体转染进适当的寄主细胞可以得到稳定生产人属性化抗体的转化体。
把表达载体转染进寄主细胞的方法的例子包括电穿孔(Kokai No.257891/90，细胞工程技术，3，133(1990))和诸如此类。
假如能表达人属性化抗体，任何细胞可以用作将转染进人属性化抗体表达载体的寄主细胞。例子有鼠SP2/0-Ag14细胞(ATCCCRL 1581)，鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCC CRL 1580)，可检测到二氢叶酸还原酶基因(下文中称为“DHFR基因”)的CHO细胞(Proc.Natl.Acad.Sci.，77，4216(1980))和大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(ATCC CRL 1662，下文中称为“YB2/0细胞”)。
在载体转染之后，利用-个含有G418和FCS的RPMI1640培养基根据在Kokai No.257891/90中公开的方法选择稳定表达人属性化抗体的转化体。通过在培养基中培养所选择的转化体可在培养物中生产和积累人属性化抗体。通过1(5)中叙述的方法或诸如此类确定培养基中人属性化抗体的活性。利用一个DHFR基因-护增系统或诸如此类由Kokai NO.257891/90中叙述的方法可以提高转化体生产人属性化抗体。
通过利用一个蛋白质A柱可以从转化体的培养上清液中纯化人属性化抗体(抗体，实验室手册，冷泉港，第8章，1988)。也可以用任何其他传统方法用于纯化蛋白质。例如，可以通过凝胶过滤，离子交换层析，超滤和诸如此类的方法联合可纯化人属性化抗体。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(自然学，227，680(1970))，Western印迹(抗体，实验室手册，冷泉港实验室，12章，1988)和诸如此类方法可确定纯化人属性抗体的H链或L链式作为整个的抗体分子的分子量。
通过1(5)中叙述的方法可以确定纯化人属性抗体的反应性和人属性化抗体对IL-5的抑制活性。
(10)利用人属性化抗体的方法本发明的人属性化抗体可以与一个人IL-5Rα链特异性结合，从而抑制IL-5的生物学活性。所以，本发明的人属性化抗体可期望抑制嗜曙红细胞的功能，该细胞的分化和生长受IL-5的控制。因此，本发明的人属性化抗体将用于发病机制与嗜曙红细胞关联的疾病的治疗。由于几乎本发明的人属性化抗体的所有部分起源于一个人抗体氨基酸序列，可以预料它不仅在人体中显示免疫原性而且长时期维持它的效果。本发明的人属性化抗体可以单独或与至少一种药学可接受佐剂联合使用。例如，人属性化抗体溶解于生理盐水或蔗糖，乳糖，甘露糖或诸如此类的一种水溶液中制备药物组合物。可选择地，用传统的方法冷冻干燥人属性化抗体并加入氯化钠制成粉末形式注射液。如果必须，本药物组合物可以含有任何是药学制备领域已知的如一种药学可接受盐和诸如此类的添加物。
本发明的药物组合物可以以0.1-20mg/kg/天的人属性化抗体的剂量给哺乳动物包括人用药。该剂量依据病人的年龄和症状和诸如此类而变化。通过静脉注射一天一次(单个剂量或连续给药)一星期1-3次或每2-3星期一次给药。
3.生产抗人IL-5Rα单链抗体(1)构建单链抗体表达载体通过在一个单链抗体表达载体中插入编码2(2)，2(5)和2(6)中叙述的一个非人动物-抗体或一个人CDR-移植抗体的VH和VL的cDNA可以构建一个表达非人动物抗体的单链抗体或一个人CDR-移植抗体的单链抗体的表达载体。假如它们能掺入和表达编码一个非人动物抗体或一个人CDR-移植抗体的VH和VL的cDNA，任何表达载体都可以用作单链抗体的表达载体。例子有pAGE107(细胞工程技术，3，133(1990))，pAGE103(生物化学杂志，101，1307(1987))，pHSG274(基因27，223(1984))，pKCR(Proc.Natl.Acad.Sci.，78，1527(1981))和pSG1βd2-4(细胞工程技术，4，173(1990))。可以在大肠杆菌，酵母和动物细胞和诸如此类中选择用于表达一个单链抗体的寄主。在这种情况下，应该选择一个与特异性寄主相容的表达载体。通过在表达载体中插入一个编码适当的信号肽的cDNA可以把单链抗体从细胞分泌出来和运输至周质区或保留在细胞内。
把编码含有VH-L-VL或VL-L-VH(这里L是一个肽衔接物)的一个单链抗体的cDNA插入所选择的表达载体的一个适当的启动子和一个信号肽下游的区中可以构建一个单链抗体表达载体，其中已经插入了编码所需要的一个单链抗体的cDNA。
通过编码在两末端都有适当的限制酶识别位点的一个肽接头的合成DNA把编码VH cDNA和编码VL的cDNA连接在一起得到编码一个单链抗体的cDNA。重要的是选择最佳接头肽以致它的加入不影响VH和VL与抗原的结合。例如，可以利用Pantoliano等人叙述的接头(生物化学，30，10117(1991))和它的修饰类型。
(2)表达单链抗体和估计它的活性通过电穿孔(Kokai No.257891/90；细胞工程技术，3，133(1990))或诸如此类方法把3(1)中构建的单链抗体表达载体转染进一个适当的寄主细胞可以得到产生所需要的单链抗体的转化体。在表达载体转染之后，由1(5)中叙述的方法或诸如此类方法可以确定培养上清液中单链抗体的活性。
将已知技术联合使用可以完成本发明单链抗体的收集和纯化。例如，如果单链抗体被分泌到培养基中，可以用超滤方法浓缩它，然后用抗原亲和层析或离子交换层析或凝胶过滤进行收集和纯化。如果单链抗体被运输到寄主细胞的周质区，可以用超滤方法，接着应用一个渗透压休克进行浓缩，然后用抗原亲和层析或离子交换层析或凝胶过滤进行收集和纯化。如果单链抗体是不溶的并以一个颗粒(即，内含体)存在，可以通过溶解细胞，重复离心和洗涤分离颗粒，用盐酸胍溶解，一个恢复单链抗体的结构成一个活化结构的操作和随后的一个活性分子的纯化来进行它的收集和纯化。
用1(5)中叙述的方法和诸如此类方法可以确定纯化的单链抗体的活性。
(3)利用单链抗体的方法本发明的单链抗体可以与一个人IL-5Rα链特异性地结合并抑制IL-5的生物学活性。所以，可以预料本发明的单链抗体能抑制嗜曙红细胞的功能，该细胞的分化和生长受IL-5的控制。因而，本发明的单链抗体将用于发病机制与嗜曙红细胞关联的疾病的治疗。本发明的单链抗体可以单独或与至少一个药学可接受佐剂联合使用。例如，单链抗体溶解于生理盐水或蔗糖、乳糖，甘露糖或诸如此类的一个小溶液中制备一个药物组合物。可选择地，用一个使方法冷冻干燥单链抗体并加入氯化钠制成一个粉末形成的注射剂。如果必需，本发明的药物组合物可以含有药物制备领域已知的任何附加物象一种药物可接受盐和诸如此类。
本发明的药物组合物可以以0.1-20mg/kg/天的单链抗体的剂量对哺乳动物包括人给药，剂量可以依据病人的年龄和症状和诸如此类而变化。通过静脉注射一天一次(单独剂量或连续给药)，一星期1-3次或每2-3星期一次给药。
4.生产抗人IL-5Rα二硫化物稳定抗体(1)生产二硫化物稳定抗体通过下列方法可以生产二硫化物稳定抗体，该方法包括提供编码非人动物抗体的VH和VL的cDNA或编码人CDR-移植抗体的VH和VL的cDNA，用对应于一个半胱氨酸残基的DNA序列，修饰对应于在各个cDNA的一个适当位置的一个氨基酸残基的DNA序列，表达被修饰的cDNA，纯化得到的多肽，然后形成一个二硫键。利用2(5)中叙述的PCR，通过一个诱变方法可以完成把一个氨基酸残基修饰成半胱氨酸残基。
在适当的表达载体中插入得到的编码修饰的VH和修饰的VL的cDNA可以构建一个二硫化物稳定抗体H链表达载体和一个二硫化物稳定抗体L链表达载体。假如它们能掺入和表达编码-个修饰的VH和一个修饰的VL的cDNA，任何表达载体可以用作二硫化物稳定抗体表达载体。例如，可以使用pAGE107(细胞工程技术，3，133(1990))，pAGE103(生物化学杂志，101，1307(1987))，PHSG274(基因，27，223(1984))，pKCR(Proc.Natl.Acad.Sci.，78，1527(1981))，pSG1βd2-4(细胞工程技术，4，1713(1990))和诸如此类。可以从E.Coli，酵母和动物细胞和诸如此类中选择用于表达一个二硫化物稳定抗体L链表达载体和一个二硫化物稳定抗体H链表达载体形成一个二硫化物稳定抗体的寄主。在这种情况下，应该选择一种与特定寄主相容的一个表达载体。通过在表达载体中插入一个编码一个适当的信号肽的cDNA可以把二硫化物稳定抗体从细胞中分泌和运输进周质区或保留在细胞中。
(2)表达二硫化物稳定抗体和估计它的活性通过电穿孔(Kokai No.257891/90；细胞工程技术，3，133(1990))或诸如此类把4(1)中构建的二硫化物稳定抗体H链表达载体或二硫化物稳定抗体L链表达载体转染进一个寄主细胞可以得到生产所需要的二硫化物稳定抗体H链或二硫化物稳定抗体L链的一个转化体。导入该表达载体之后，用1(5)中叙述的方法可以证实培养上清液或诸如此类中二硫化物稳定抗体H链或二硫化物稳定抗体L链的表达。
将已知技术联合使用可以完成二硫化物稳定抗体H链或二硫化物稳定抗体L链的收集和纯化。例如，如果二硫化物稳定抗体H链或二硫化物稳定抗体L链被分泌到培养基中，可以用超滤作用浓缩，然后用各种类型的层析或凝胶过滤完成收集和纯化。如果二硫化物稳定抗体H链或二硫化物稳定抗体L链被运输到寄生细胞的周质区，可以在对细胞应用一个渗透压休克之后用超滤作用浓缩，然后用各种类型的层析或凝胶过滤完成它们的收集和纯化。如果二硫化物稳定抗体H链或二硫化物稳定抗体L链是不溶的并以一个颗粒形式(即，内含体)存在，可以通过溶解细胞，重复离心和洗涤分离颗粒，用盐酸胍溶解和随后进行各种类型的层析或凝胶过滤进行其收集和纯化。
为了得到一个活化结构，混合纯化的二硫化物稳定抗体H链和二硫化物稳定抗体L链并进行再折叠过程(分子免疫学，32，249(1995))，从而形成一个二硫键。随后，可以通过抗原亲和层析或离子-交换层析或凝胶过滤纯化活化的二硫化物稳定抗体。用1(5)中叙述的方法或诸如此类方法可以确定二硫化物稳定抗体的活性。(3)利用二硫化物稳定抗体的方法本发明的二硫化物稳定抗体可以与一个人22-5Rα链特异性地结合，从而抑制IL-5的生物学活性。所以，可以期望本发明的二硫化物稳定抗体抑制嗜曙红细胞增多的作用，该细胞的分化和生长受IL-5的控制。因此，本发明的二硫化物稳定抗体将用于发病机制与嗜曙红细胞关联的疾病的治疗。本发明的二硫化物稳定抗体可以单独或与至少一个药物学可接受佐剂联合使用。例如，将单链抗体或二硫化物稳定抗体溶解于生理盐水式蔗糖，乳糖，甘露糖或诸如此类的一种水溶液中制备一种药物组合物。可选择地，用一个传统方法冷冻干燥二硫化物稳定抗体并加入氯化钠制备一种粉末形式的注射剂。如果必需，本药物组合物可以含有任何药学制备领域熟知的添加物，象一种药物可接受盐和诸如此类。
可要以0.1-20mg/kg/天的二硫化物稳定抗体的剂量对哺乳动物包括人使用本药物组合物。剂量可以依据病人的年龄和症状和诸如此类而变化。通过静脉注射一天一次(单独剂量或连续给药)，一星期1-3次或每2-3星期一次给药。5.利用抗人IL-5Rα抗体测量和检测人白介素-5受体α链的方法(1)利用抗人IL-5Rα抗体进行免疫细胞染色当免疫细胞是悬浮细胞时，在下面的处理中使用这些细胞。当免疫细胞是粘连细胞时，用EDTA中的胰蛋白酶分开它们，然后在下面的处理中使用。把免疫细胞悬浮于一个免疫细胞染色缓冲液(含有1％BAS，0.02％EDTA和0.05％迭氮化钠的PBS)或诸如此类并以1×105-2×106细胞的量分配。将1(4)中得到的产生抗人IL-5Rα单克隆抗体的杂交瘤的培养上清液，或2(9)中得到的抗人IL-5Rα人属性化抗体转化体的培养上清液式1(6)或2(9)中得到的纯化抗体，或通过已知方法(KOUSOKOUTAIHOU(酶和抗体的方法)，Ga Ku SaiKiKaKu公开，1985)用一个适当的标记物质(例如，生物素)标记纯化抗体并用一个免疫细胞染色缓冲液或含有10％动物血清的免疫细胞染色缓冲液将标记抗体稀释到一个0.1-50μg/ml的浓度得到的产物分配到20-500μl的量并在冰上反应30分钟。当1(4)中得到的生产鼠抗人IL-5Rα单克隆抗体的杂交瘤，2(9)中得到的抗人IL-5Rα人属性化抗体转化体的培养上清液或1(6)或2(9)中得到的纯化抗体已经反应时，完成反应后用免疫细胞染色缓冲液洗细胞并以将含有约0.1-50μg/ml的已经用一个象FITC或藻红蛋白的荧光色素标记的抗小鼠免疫球蛋白抗体，抗大鼠免疫球蛋白抗体或抗人免疫球蛋白抗体的一个免疫细胞染色缓冲液分配到50-500μl的量，接着在黑暗中在冰上反应30分钟。当生物素标记的单克隆抗体已经反应时，用一个象FITC或藻红蛋白的荧光色素标记的链抗生物素蛋白分配到50-500μl的量中并在黑暗中在冰上进行反应30分钟。当用一个象FITC或藻红蛋白的荧光色素标记的单克隆抗体已经反应时，将含有约0.1-50μg/ml单克隆抗体的一个免疫细胞染色缓冲液分配到50-500μl的量并在黑暗中在冰上进行反应30分钟。在每个这些情况中，反应后都用一个免疫细胞染色缓冲液彻底洗涤反应混合物并用一个细胞分类机进行分析.(3)利用抗人IL-5Rα抗体测试对依赖于人IL-5的细胞的生长的抑制为了显示所得到的抗人IL-5Rα抗体的生物学抑制活性，利用依赖人IL-5细胞检查对依赖人IL-5细胞的生长的影响。估计方法的例子包括在细胞中掺入氚标记胸苷，用细胞计数试剂盒显示颜色方法和诸如此类方法。现在将解释用于本发明的显示颜色方法。
在一个正规培养基(50μl)中悬浮CTLL-2(h5R)细胞(1×104)并分配到一个96孔培养平板中。向平板中加入25μl1(6)或2(9)中得到的纯化抗体的溶液(0.01-50μg/ml)和含有0.4-40μg/ml的人IL-5的正规培养基，在5％CO2的温育箱中在37℃培养混合物24-72小时。随后，以10ml/孔的量加入一个细胞计数试剂盒溶液，在一个5％CO2的温育箱中在37℃继续培养4小时。完成培养后，用一个微孔平板读数器Emax(Molecular Device)确定450nm处吸光值并估计各个抗体对CTLL-2(h5R)细胞生长的抑制活性。(3)抗人IL-5Rα抗体对嗜曙红细胞的存活的抑制作用用一个商业可得的象一个多形制剂(Nikomed)或一个percoll(Pharmacia)的细胞分离介质从人外。周血液中制备含有嗜曙红细胞的人多形核白细胞组分。把这些组分悬浮于一个正规培养基中，把得到的细胞以一个1×106-1×107细胞/孔的量分配在一个96，48或24孔培养板中，接着加入人IL-5到最后浓度为0.001-10ng/ml。加入1(4)中得到的生产抗人IL-5Rα单克隆抗体的杂交瘤的培养上清液或者2(9)中得到的抗人IL-5Rα人属性化抗体转化体的培养上清液或1(6)或2(9)中得到的纯化抗体并在一个5％CO2温育箱中在37℃培养混合物2-5天。在完成培养后，从每个孔中制备一个细胞样品并用May-Grunwald-Giemsa染色方法(SENSHOKUHOU NOSUBETE(染色技术，Ishiyaku Shuppan Cor.，Ltd.公开，1988))或诸如此类方法进行染色并且确定嗜曙红细胞的百分数。通过将缺乏抗人IL-5Rα抗体和存在抗人IL-5Rα抗体时嗜曙红细胞的百分数进行比较证实缺乏或存在该单克隆抗体时依赖IL-5的人嗜曙红细胞的生存力增强作用的活性的抑制。(4)利用单克隆抗体测定ShIL-5Rα把0.1-50μg/ml1(6)或2(9)中得到的纯化抗体作为一级抗体包被平板。把它被的平板与0.1-10,000mg/ml的1(1)中得到的纯化ShIL-5Rα或象人血清的一个样品反应。彻底洗涤平板，然后与二级抗体反应，该抗体是识别一个表位的抗人IL-5Rα抗体，该表位不是被从1(6)或2(9)中得到的纯化抗体中选择用作一级抗体的抗人IL-5Rα抗体识别的。在反应之前用生物素，酶，一种化学荧光物质，放射性化合物或诸如此类标记二级抗体。随后，根据标记进行一个反应。根据与纯化ShIL-5R的反应性构建一个校准曲线并计算样品中shIL-5R的浓度。(5)用Western印迹检测ShIL-5Rα对1(1)中得到的纯化ShIL-5Rα进行SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后吸印到一个聚偏(二)氟乙烯(下文中称为“PVDF膜”，Millipore)。把PVDF膜浸在补充了1-10％牛血清白蛋白(BSA)的PBS中并在4℃保留静止过夜以便封阻，接着用含有0.05％吐温的PBS彻底洗涤。在室温下把PVDF膜在1(5)中得到的杂交瘤的上清液或1(6)中得到的纯化抗体的一个溶液中浸2小时并用含有0.05％吐温的PBS彻底洗涤。在室温下把PVDF膜在作为一个二级抗体的抗小鼠免疫球蛋白抗体或抗大鼠免疫球蛋白抗体的一个溶液中浸1小时并用含有0.05％吐温的PBS彻底洗涤。预先用生物素，酶，一种化学荧光物质，一种放射性化合物或诸如此类标记二级抗体。在完全除去洗涤溶液后，根据二级抗体的标记进行一个反应并对与纯化ShIL-5Rα分子量一致的蛋白质的反应性进行检查。(6)ShIL-5Rα的免疫沉淀用PBS或其它缓冲液将抗小鼠免疫球蛋白或抗大鼠免疫球蛋白抗体稀释10-1000溶。以50-200μl/孔把稀释液分配到一个96-孔ELISA塑料单板并在4℃保留静止过夜或在室温保持至少2小时，从而吸收到平板止。用PBS洗平板。以300μl/孔把含有1-10％BSA的PBS和诸如此类分配到平板并在4℃保留静止过夜或在室温至少保留30分钟以达到封闭。用PBS洗平板。以50-200μl/孔加入1(5)中得到的杂交瘤的上清液或1(6)中得到的纯化抗体的一个溶液(0.01-50μg/ml)并在4℃保留静止过夜，从而将抗体吸附到平板上。在洗平板之后，用含有1％BSA的PBS或诸如此类稀释1(1)中得到的ShIL-5Rα到0.1-100μg/ml的浓度并以50-200μl/孔分配稀释液，接着在4℃反应过夜。在用含有0.05％吐温的PBS或诸如此类洗平板之后，以50-200μl/孔将1X-5X的用于SDS-PAGE的样品缓冲液分配并在室温振摇至少30分钟。用PBS任意稀释后，以一个5-25μl的量在每一泳道中加入溶液并进行SDS-PAGE，接着用一个传统方法吸印到一个PVDF膜式诸如此类上。如5(5)中叙述对PVDF膜进行吐温印迹，从而检测ShIL-5Rα。
附图的简要说明

图1显示了构建质粒pAGE210的步骤。
图2显示了质粒pCAGGS-h5R.25的限制图谱。
图3显示了构建质粒pAI234的步骤。
图4显示了构建质粒pAI230的步骤。
图5显示了构建质粒pAI282的步骤。
图6显示了构建质粒pAI283和pAI285的步骤。
图7显示了构建质粒pAI284和pAI289的步骤。
图8显示了构建质粒pAI294和pAI295的步骤。
图9显示了桅建质粒pAI299和pAI501的步骤。
图10显示了构建质粒pAI292的步骤。
图11显示了构建质粒pAI297的步骤。
图12显示了构建质粒pMKexl的步骤。
图13显示了构建质粒pAI263的步骤。
图14显示了在一个酶免疫测定中抗人IL-5Rα单克隆抗体KM1257和KM1259与一个人IL-5Rα一人免疫球蛋白不变区的融合蛋白的结合反应性。
图15显示了构建质粒pBSA的步骤。
图16显示了构建质粒pBSAE的步骤。
图17显示了构建质粒pBSH-S的步骤。
图18显示了构建质粒pBSK-H的步骤。
图19显示了构建质粒pBSH-SA和pBSK-HA的步骤。
图20显示了构建质粒pBSH-SAE和pBSK-HAE的步骤。
图21显示了构建质粒pBSH-SAEE和pBSK-HAEE的步骤。
图22显示了构建质粒pBSK-HAEESal的步骤。
图23显示了构建质粒pBSX-S的步骤。
图24显示了构建质粒pBSX-SA的步骤。
图25显示了构建质粒pBSSC的步骤。
图26显示了构建质粒pBSMO的步骤。
图27显示了构建质粒pBSMOS的步骤。
图28显示了构建质粒pChiIgLAS的步骤。
图29显示了构建质粒pMohCk的步骤。
图30显示了构建质粒pBSMoSal的步骤。
图31显示了构建质粒pBSMoSalS的步骤。
图32显示了构建质粒pBShCrl的步骤。
图33显示了构建质粒pMohCrl的步骤。
图34显示了构建质粒pMovlSP的步骤。
图35显示了构建质粒pMokvlSP的步骤。
图36显示了构建质粒pKANTEX93的步骤。
图37显示了构建质粒pKANTEX1259H的步骤。
图38显示了构建质粒pKANTEX1259的步骤。
图39显示了抗人IL-5Rα链人嵌合抗体KM1399的SDS-PAGE(在4-15％的梯度胶)电泳图谱。图的左边显示了非还原条件下的电泳图谱和图的右边是还原条件下的电泳图谱。在左边一侧，M是高分子量标记的泳道和1是KM1399的泳道。在右边一侧，M是低分子量标记的泳道和1是KM1399的泳道。
图40显示了抗人IL-5Rα链鼠抗体KM1259和抗人IL-5Rα链人嵌合抗体KM1399对人IL-5与人IL-5α链的结合的抑制活性。图的垂直轴表示抑制活性和水平轴表示抗体浓度。指KM1259的活性和O指KM1399的活性。
图41显示了构建质粒pT1259的步骤。
图42显示了在利用质粒pT1259瞬时表达抗人IL-5Rα链人嵌合抗体的基础上估计活性的结果。图的垂直轴表示对人IL-5与一个人IL-5Rα链的结合的抑制活性和水平轴表示瞬时表达培养上清液的稀释系数。
图43显示构建质粒phKM1259HVO的步骤。
图44显示构建质粒phKM1259LVO的步骤。
图45显示构建质粒pKANTEX1259HVO的步骤。
图46显示构建质粒pKANTEX1259HVOLVO的步骤。
图47显示抗人IL-5Rα链人CDR一移植抗体KM8397的SDS-PAGE(在4-15％梯度胶上)电泳图谱。图的左边显示非还原条件下的电泳图谱和图的右边显示还原条件下的电泳图。M是分子量标记的泳道和1是KM8397的泳道。
图48显示抗人IL-5Rα链人嵌合抗体KM1399和抗人IL-5Rα链人CDR-移植抗体KM8397与人IL-5α链的结合活性。图的垂直轴表示与人IL-5α链的结合活性，水平轴表示一个抗体浓度。指KM1399的活性和O是KM8397的活性。
图49显示对瞬时表达培养上清液中抗人IL-5Rα链人CDR一移植抗体的各种修饰类型对人IL-5与一个人IL-5α链的结合的抑制活性的估计结果。图的垂直轴表示抑制活性，水平轴表示样品的名字。把嵌合抗体KM1399的活性当作100，用相对值表示抑制活性。
图50显示抗人IL-5Rα链人CDR一移植抗体的各种修饰类型与人IL-5α链的结合活性。每个图的垂直轴表示与人IL-5α链的结合活性。水平轴表示抗体浓度。在上面的图中，·指KM1399的活性；o，HV.OLU.O；■HV.2LV.O；□，HV.OLV.3；和▲，HV.3LV.3.在下面的图中，·指KM1399的活性；o，HV.OLV.O；■，HV.3LV.O；□，HV.OLV.4；▲，HV.1LV.4，△，HV.2LV.4；和X，HV.3LV.4。
图51显示构建质粒pBShCγ4的步骤。
图52显示构建质粒pKANTEX1259γ4和pKANTEX1259HV3LVOγ4的步骤。
图53显示一个人抗体IgG4亚类的抗人IL-5Rα链人嵌合抗体KM7399和一个人抗体IgG4亚类的人IL-5Rα链人CDR一移植抗体KM9399的电泳图谱。图的左边显示在非还原条件下的电泳图谱，图的右边显示在还原条件下的电泳图谱。在左侧，M是高分子量标记的泳道，1是KM9399的泳道和2是KM7399的泳道。在右侧，M是低分子量标记的泳道，1是KM9399的泳道和2是KM7399的泳道。
图54显示一个人抗体IgG1亚类的抗人IL-5Rα链人嵌合抗体KM1399，一个人抗体IgG4亚类的人IL-5Rα链人嵌合抗体KM7399，一个人抗体IgG1亚类的抗人IL-5Rα链人CDR一移植抗体KM8399和一个人IgG4亚类的抗人IL-5Rα链人CDR一移植抗体KM9399与人IL-5α链结合的活性。垂直轴表示与人IL-5α链的结合活性，水平轴表示抗体浓度。O指KM1399的活性；·，KM7399；□，KM8399；和■，KM9399。
图55显示对抗人IL-5Rα单克隆抗体KM1257，KM1259，KM1486，KM1399，KM7399，KM8399和KM9399与一个人IL-5R基团转染的CTLL-2细胞的反应性的流式细胞计量分析的结果。
图56显示了检查抗人IL-5Rα单克隆抗体KM1257，KM1259，KM1486，KM1399，KM7399，KM8399，KM9399对依赖IL-5生长的一个人IL-5R基因转染的CTLL-2细胞的抑制作用的结果。
图57显示对抗人IL-5Rα单克隆抗体KM1259与人嗜曙红细胞的反应性的流式细胞光度分析的结果。
图58显示检查抗人IL-5Rα单克隆抗体KM1257，KM1259，KM1486，KM1399，KM7399，KM8399，KM9399对人嗜曙红细胞的生存的抑制作用的结果。
图59显示利用抗人IL-5Rα单克隆抗体KM1257和生物素标记KM1259估计一个可溶性人IL-5Rα定量测定系统的结果。
图60显示利用抗人IL-5Rα单克隆抗体KM1257，KM1259和KM1486通过Western印迹测定ShIL-5Rα的结果。
图61显示利用抗人IL-5Rα单克隆抗体KM1257，KM1259和KM1486免疫沉淀ShIL-5Rα的结果。
实施本发明的最佳方式实施例11.制备抗原(1)构建动物细胞表达载体pAGE210利用动物细胞表达载体pAGE207(kokai No，46841/94)和pAGE148(kokai No.205694/94)如下所述构建动物细胞表达载体pAGE210。
把3μg质粒pAGE207或pAGE148溶解于30μl含有10mMTris-HCl(PH7.5)，10mM MgCl2，50mM NaCl和1mM二硫苏糖醇(下文中称为“DTT”)的缓冲液中。在得到的混合物中加入各10单位的ClaI和KpnI(两个都由Takara Shuzo生产，除非另有说明，下面所用的限制酶都是Takara Shuzo制造)并在37℃反应4小时。在对反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳之后，从pAGE207中回收约0.5μg的一个约4.7kb的含有SV40早期启动子和增强子(下文中称为“PSE”)，一个潮霉素抗性基因和一个氨苄青霉素抗性基因的DNA片段，从pAGE148中回收约0.5μg的一个4.3kb的含有一个二氢叶酸还原酶(下文中称为“dhfr”)基因的DNA片段。
把从pAGE207得到的ClaI-KpnI片段(50ng)和从pAGE148得到的KpnI-ClaI片段(50ng)溶解于20μl的T4DNA连接酶缓冲液〔一个含有66mM Tris-HCl(PH7.5)，6.6mM MgCl2，10mM DTT和0.1mM三磷酸腺苷(下文中称为“ATP”)的缓冲液〕。在得到的混合物中加入200单位的T4DNA连接酶(Takara Shuzo)并在12℃进行连接反应16小时。用制备得的重组质粒DNA转化大肠杆菌菌株JM109从而得到质粒pAGE201，显示如图1。(2)为了构建一个shIL-5Rα表达载体把shIL-5RαcDNA装进一个表达盒为了构建一个shIL-5Rα表达载体，根据下面叙述的过程，利用PCR方法〔Maniatis et al.(eds.)，分子克隆，14.2，冷泉港实验室，1989〕进行shIL-5RαcDNA的5′和3′非翻译区的修饰和导入一个限制酶识别序列。
如图2所示〔J.Exp.Mecl.，175，341(1992)〕在已知质粒pCAGGS〔基因，108，193(1991)〕中插入shIL-5RαcDNA得到质粒pCAGGS-h5R.25。把3μg这种pCAGGS-h5R.25加入到30μl含有50mM Tris-HCl(PH7.5)，10mM MgCl2，100mM NaCl和1mM DTT的缓冲液中，然后，在其中加入10单位的ECORI并在37℃反应4小时。在对反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳之后，回收约0.3μg的一个1.4kb的含有shIL-5RαcDNA的DNA片段。
然后，把1ng上面得到的DNA片段溶解于50μlPCR缓冲液〔含有50mM KCl，10mM Tris-HCl(PH8.3)，1.5mM MgCl2，0.2mM三磷酸脱氧腺苷(下文中称为“dATP”)，0.2mM三磷酸脱氧鸟苷(下文中称为“dGTP”)，0.2mM三磷酸脱氧胞苷(下文中称为“dCTP”)，0.2mM三磷酸脱氧胸苷(下文中称为“dTTP”)的缓冲液〕，在反应混合物中加入各50pmol的一个具有SEQ ID NO1所示碱基序列的合成DNA和一个具有SEQ ID NO2所示碱基序列的合成DNA〔两者都由一个自动DNA合成仪；380A型(Applied Biosystems Co.，Lted.)合成〕和1.6单位的气孔DNA聚合酶(New England Biolabs，Inc.)并利用一个Perkin Elmer DNA热循环器(这也可用于其他PCR反应)在94℃反应1分钟，55℃反应2分钟，和72℃反应3分钟的系列条件下进行30个循环完成PCR。在完成反应之后，在10μl反应混合物中加2μl含有100mM Tris-HCl(PH7.5)，100mM MgCl2，500mM NaCl和10mMDTT的缓冲液，8μl蒸馏水，和10单位的HindIII的缓冲液并在37℃反应4小时。然后通过乙醇沉淀从反应混合物中回收DNA片段〔Maniatis et al.(eds.)，分子克隆，E.10，冷泉港实验室，1989〕并把DNA片段再溶解于20μl的含有20mM Tris-HCl(PH8.5)，10mMMgCl2，10mM KCl和1mMDTT的缓冲液中。在得到的混合物中加入10单位的Beum HI并在37℃反应4小时。在反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳之后，回收约0.3μg的一个1.0kb的DNA片段。
在一个独立的步骤中，把3μg质粒pUC19(Pharmacia Biotech)溶解于30μl含有10mM Tris-HCl(PH7.5)，10mM MgCl2，50mM NaCl和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的HindIII并在37℃反应4小时。然后，通过乙醇沉淀，从反应混合物中回收DNA片段，把DNA片段再溶解于30μl含有20mM Tris-HCl(PH8.5)，10mM MgCl2，10mMKCl和1mM DTT的缓冲液中，在反应混合物中加入10单位的Bam HI并在37℃反应4小时。在反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳之后，回收约0.5μg的来自pUC19的HindIII/Bam HI片段。
把100ng的pUC19的Hind III/Bam HI片段和50ng shIL-5RαcDNA片段溶解于20μl T4DNA连接酶缓冲液中，向其中加入200单位的T4DNA连接酶。然后，在12℃连接16小时。用这样制备的重组质粒DNA转化大肠杆菌菌株JM109从而得到质粒pAI234，如图3所示。(3)构建一个人可溶IL-5Rα表达载体通过把实施例1的(1)小章节中得到的来自pAGE210的HindIII-Bam HI片段与实施例1的小章节(2)中得到的来自pAI234的HindIII-Bam HI片段连接，如下所述构建一个shIL-5Rα表达载体，pAI230。
简要地说，把3μg pAGE210加入到30μl含有10mMTris-HCl(PH7.5)，10mM MgCl2，50mM NaCl和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的Hind III并在37℃反应4小时。通过乙醇沉淀，从该反应混合物中回收DNA片段并再溶解于30μl含有20mMTris-HCl(PH8.5)，10mM MgCl2，10mM KCl和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的Bam HI并在37℃反应4小时。在反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳之后，回收约0.5μg的一个9.0kb DNA片段。
把3μg pAI234加入到30μl含有10mM Tris-HCl(PH7.5)，10mMMgCl2，50mM NaCl和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的HindIII并在37℃反应4小时。通过乙醇沉淀从反应混合物中回收DNA片段并再溶解于30μl含有20mM Tris-HCl(PH8.5)，10mM MgCl2，10mM KCl和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的Bam HI并在37℃反应4小时。在反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳后，回收约0.3μg的一个1.0kb的DNA片段。
随后，把300ng来自pAGE210的Hind III-Bam HI片段和50ng来自pAI234的Hind III-Bam HI片段溶解于20μl T4DNA连接酶缓冲液，在其中加入200单位的T4DNA连接酶。然后，在12℃连接16小时。用这样制备的重组质粒DNA转化大肠杆菌菌株JM109，从而得到质粒pAI230，如图4所示。(4)修饰信号序列为了在动物细胞中有效生产shIL-5Rα，根下面叙述的过程通过在cDNA的信号序列的3′末端导入一个EcoRV识别序列并随后用合成DNA，用一个来自一个人生长激素(科学，205，602(1979))或抗神经节苷脂GD3嵌合抗体KM871(KoKai NO.Hei 5-304989)的一个信号序列代替原始信号序列而修饰编码shIL-5Rα的cDNA的信号序列。
简要地说，把3μg实施例1小章节(2)中得到的质粒pAI234加入30μl含有10mM Tris-HCl(PH7.5)，10mM MgCl2，50mM NaCl和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的Hind III并在37℃反应4小时。通过乙醇沉淀从反应混合物中回收DNA片段并再溶解于30μl含有20mM Tris-HCl(PH8.5)，10mM MgCl2，10mM KCl和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的Bam HI并在37℃反应4小时。在反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳之后，回收约0.3μg的一个1.0kb的DNA片段。
在一个独立的步骤中，把3μg质粒pUC19加入到30μl含有10mMTris-HCl(PH7.5)，10mM MgCl2，50mM NaCl和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的HincII并在37℃反应4小时。然后，通过乙醇沉淀从反应混合物中回收DNA片段，得到约0.5μg的一个来自pUC19的HincII片段。
把1ng上面得到的DNA片段溶解于50μl PCR缓冲液中，向其中加入各50pmol的一个具有SEQ ID NO2所示的碱基序列的合成DNA和一个具有SEQ ID NO3所示的碱基序列的合成DNA和1.6单位的气孔DNA聚合酶。然后在94℃反应1分钟，48℃反应2分钟和72℃反应3分钟一个系列条件通过30次循环进行PCR。然后，反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳，回收0.5μg的约0.9kb的编码一部分hIL-5Rα的cDNA片段。把15ng的这一DNA和100ng的来自pUC19的HincII片段溶解于20μl T4DNA连接酶缓冲液，向其中加入200单位的T4DNA连接酶。然后，在12℃进行连接16小时。用这样制备的重组质粒DNA转化大肠杆菌菌株JM109从而得到质粒pAI280，如图5所示。把3μg这样得到的质粒pAI280加入到30μl含有10mM Tris-HCl(PH7.5)，10mMMgCl2，50mM NaCl和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的XbaI并在37℃反应4小时。通过乙醇沉淀从反应混合物中回收DNA片段并再溶解于30μl含有20mM Tris HCl(PH8.5)，10mM MgCl2，10mMKCl和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的Bam HI并在37℃反应4小时。在反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳后，回收约0.8μg的一个2.8kb的DNA片段。
在一个独立的步骤中，把3μg质粒pAI234加入到30μl含有10mMTris-HCl(PH7.5)，10mM MgCl2，50mM NaCl和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的XbaI并在37℃反应4小时。通过乙醇沉淀从反应混合物中回收DNA片段并再溶解于30μl含有20mMTris-HCl(PH8.5)，10mM MgCl2，10mM KCl和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的Bam HI并在37℃反应4小时。在反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳后，回收约0.2μg的一个0.8kb的DNA片段。
随后，把200ng来自pAI280的XbaI-BamHI和50ng来自pAI234的XbaI-BamHI溶解于20μl T4连接酶缓冲液中，向其中加入200单位的T4DNA连接酶。然后在12℃进行连接16小时。用这样得到的重组质粒DNA转化大肠杆菌菌株JM109，从而得到质粒pAI282，如图5所示。把3μg这种质粒加入到30μl含有50mM Tris-HCl(PH7.5)，10mMMgCl2，10mM NaCl，和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的ECORV并在37℃反应4小时。通过乙醇沉淀从反应混合物中回收DNA片段并再溶解于30μl含有20mM Tris-HCl(PH8.5)，10mM MgCl2，10mM KCl和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的Bam HI并在37℃反应4小时。在反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳之后，回收约0.3μg的一个0.9kb的DNA片段。
把各1μg的一个具有SEQ ID NO4所示的碱基序列的合成DNA和一个具有SEQ ID NO5所示的碱基序列的合成DNA溶解于10μl蒸馏水中。把得到的混合物在95℃加热5分钟，然后冷至室温30分钟以上退火。把100ng实施例1的小章节(2)中得到的来自PUC19的HindIII-Bam HI片段，50ng来自pAI282的ECORV-Bam HI片段，和50ng已经如上所述退火了的具有SEQ ID NOs4和5所示的碱基序列的合成DNA溶解于20μl T4DNA连接酶缓冲液中，向其中加入200单位的T4DNA连接酶。然后，在12℃进行连接16小时。用这样制备的重组质粒DNA转化大肠杆菌菌株JM109，从而得到质粒pAI283，如图6所示。
把各1μg的一个具有SEQ ID NO6所示的碱基序列的合成DNA和一个具有SEQ ID NO9所示的碱基序列的合成DNA溶解于10μl蒸馏水中。在95℃将得到的混合物加热5分钟，然后冷却至室温30分钟以上退火。在这个混合物中加入2.5μl含有500mM Tris-HCl(PH7.6)，100mM MgCl2，50mM DTT和1mM EDTA的缓冲液，2.5μl 10mM ATP溶液，9μl蒸馏水和5单位的T4聚核苷酸激酶(Takara Shuzo)，在37℃进行磷酸化2小时。独立地，把各1μg的一个具有SEQ ID NO7所示的碱基序列的合成DNA和一个具有SEQ ID NO8所示的碱基序列的合成DNA溶解于10μl蒸馏水中，在95℃加热得到的混合物5分钟，然后冷却至室温30分钟以上退火。
把100ng的来自pUC19的HindIII-Bam HI片段，50ng来自pAI282的ECORV-Bam HI片段，和各50ng的上面制备的合成DNA溶解于20μl T4DNA连接酶缓冲液中，向其中加入200单位T4DNA连接酶。然后，在12℃时进行连接16小时。用这样制备的重组质粒DNA转化大肠杆菌菌株JM109，从而得到质粒pAI285，如图6所示。(5)构建信号序列修饰的shIL-5Rα表达载体如下所述把实施例1中小章节(1)中得到的来自pAGE210的HindIII-Bam HI片段和实施例1小章节(4)中得到的来自pAI283或pAI285的含有人可溶性IL-5RαcDNA的HindIII-Bam HI片段连接起来构建人可溶性IL-5Rα表达载体，pAI284和pAI289。
简要地说，把各3μg pAI283和pAI285分别加入30μl含有10mMTris-HCl(PH7.5)，10mM MgCl2，50mM NaCl和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的HindIII并在37℃反应4小时。用乙醇沉淀从反应混合物中回收DNA片段并再溶解于30μl含有20mMTris-HCl(PH8.5)，10mM MgCl2，10mM KCl和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的Bam HI并在37℃反应4小时。在反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳之后，对每个所用的质粒回收约0.3μg的一个1.0kb的DNA片段。
把100ng的来自pAGE210的HindIII-Bam HI片段和50ng的来自pAI283或pAI285的HindIII-Bam HI片段溶解于20μl T4DNA连接酶缓冲液中，向其中加入200单位的T4DNA连接酶。然后，在12℃进行连接16小时。用这样制备的重组质粒DNA转化大肠杆菌菌株JM109，从而得到质粒pAI284和pAI289，如图7所示。(6)制备一个含有人IL-5Rα和人免疫球蛋白不变区的融合蛋白根据下面叙述的过程制备了一个融合蛋白，在这个融合蛋白中，通过一个具有(Gly-Ser-Gly)4的氨基酸序列的接头将人IL-5Rα的细胞外区连接于一个人免疫球蛋白不变区(下文中称为“FC”)(下文中，这一融合蛋白被称为“hIL-5Rα-Fc”)。
作为编码一个人免疫球蛋白不变区的cDNA，用到了编码人IgG1不变区的部分人嵌合抗体H链表达载体pChiLgHB2(kokai NO.Hei 5-304989)。首先，把约1ng的pChILgHB2溶解于50μl的PCR缓冲液。向这溶液中加入各50pmol的一个具有SEQ ID NO10中所示的碱基序列的合成DNA和一个具有SEQ ID NO11中所示的碱基序列的合成DNA和1.6单位的气孔DNA聚合酶。然后，在94℃反应1分钟，48℃反应2分钟和72℃反应3分钟的一系列条件下经过30次循环进行PCR。在完成反应后，在20μl反应混合物中加入2.5μl含有200mMTris-HCl(PH8.5)，100mM MgCl2，1000mM KCl和10mM的缓冲液，2.5μl蒸馏水，和10单位的Bam HI并在37℃反应4小时。在完成反应后，将反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳，回收约0.5μg的一个0.7kb的含有一个编码人IgG1不变区cDNA的DNA片段。
把约1ng的实施例1小章节(4)中得到的pAI283溶解于50μl PCR缓冲液中，向其中加入各50pmol的一个具有SEQ ID NO12中所示的碱基序列的合成DNA和一个具有SEQ ID NO13中所示的碱基序列的合成DNA和1.6单位的气孔DNA聚合酶。然后，在94℃反应1分钟，48℃反应2分钟和72℃反应3分钟一个系列条件下经过30次循环进行PCR。在完成反应后，在20μl反应混合物中加入2.5μl含有100mMTris-HCl(PH7.5)，100mM MgCl2，500mM NaCl和10mM DTT的缓冲液，2.5μl蒸馏水，和10单位的HindIII并在37℃反应4小时。在完成反应后，反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳，然后，回收约0.5μg的一个1.0kb的含有一个编码hIL-5Rα的细胞外区的cDNA的DNA片段。
把15ng的0.7kb的含有编码人IgG1不变区的cDNA的DNA片段，50ng的含有编码hIL-5Rα的细胞外区的cDNA的DNA片段，和100ng的来自pUC19的Hind III-Bam HI片段溶解于20μl的T4DNA连接酶缓冲液中，向其中加入200单位的T4DNA连接酶。然后，在12℃进行连接16小时。用这样制备的重组质粒DNA转化大肠杆菌菌株JM109，从而得到质粒pAI294，如图8所示。
在一个独立的步骤中，利用实施例1小章节(4)中得到的pAI285作为模板并利用具有SEQ ID NOs13和14中所示的碱基序列的合成DNA作为引物在相同于上面叙述的条件下进行PCR反应。在完成反应后，反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳。随后，回收约0.5ng的一个1.0kb的含有编码人IL-5Rα的细胞外区的cDNA的DNA片段。把15ng这样得到的DNA片段，50ng 0.7kb的含有编码人IgG1不变区的cDNA的DNA片段和100ng来自pUC19的Hind III-Bam HI片段溶解于20μlT4DNA连接酶缓冲液中，向其中加入200单位的T4DNA连接酶。然后，在12℃进行连接16小时。用这样制备的重组质粒DNA转化大肠杆菌菌株JM109，从而得到质粒pAI295，如图8所示。(7)构建一个融合蛋白表达载体如下所述把实施例1小章节的(1)中得到的来自pAGE210的HindIII-Bam HI片段与含有编码hIL-5Rα-FC的实施例1小章节(6)中得到的来自pAI294的HInd III-Bam HI片段连接起来构建一个hIL-5Rα-FC表达载体，pAI299。
简要地说，把3μg的质粒pAI294加入到30μl含有10mMTris-HCl(PH7.5)，10mM MgCl2，50mM NaCl和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的Hind III，并在37℃反应4小时。用乙醇沉淀从反应混合物中回收DNA片段并再溶解于30μl含有20mM Tris-HCl(PH8.5)，10mM MgCl2，100mM KCl和1mM DTT的缓冲液中。在得到的混合物中加入10单位的Bam HI并在37℃反应4小时。在反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳之后，回收约0.4μg的一个1.7kb的含有一个编码由人IL-5Rα和人免疫球蛋白不变区组成的融合蛋白的cDNA的DNA片段。
把100ng的来自pAGE210的Hind III-BamHI片段和50ng来自pAI294的Hind III-Bam HI片段溶解于20μl T4DNA连接酶缓冲液中，向其中加入200单位的T4DNA连接酶。然后，在12℃进行连接16小时。用这样制备的重组质粒DNA转化大肠杆菌菌株JM109，从而得到质粒pAI299，如图9所示。
进一步，通过把来自pAGE210的Hind III-Bam HI片段和含有编码hIL-5Rα-FC的cDNA的实施例1章节(6)中得到的来自pAI 295的Hind III-Bam HI片段连接起来同样构建一个hIL-5Rα-FC表达载体，pAI301。(8)制备一个在昆虫细胞中表达shIL-5Rα的重组病毒为了在昆虫细胞中生产一种蛋白质，制备了一个插入一个所需要基因的重组病毒。这样一个病毒的制备是通过下列方法完成的，其中把一个编码所需要的一个基因的cDNA掺入到一个特殊的质粒，称为“一个转移载体”，和一个随后的方法，其中通过同源重组把一个野生型病毒和转移载体共转染进昆虫细胞得到一个重组病毒而进行的。上面叙述的过程是根据制造商的手册利用Pharmingen制造的Bacnlo Gold Starter试剂盒(Cat.No.PM-21001K)进行的。
简要地说，把3μg实施例1小章节(4)中得到的pAI285或实施例1小章节(6)中得到的pAI294加入30μl含有10mM Tris-HCl(PH7.5)，10mM MgCl2，50mM NaCl和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的Hind III并在37℃反应4小时。用乙醇沉淀从反应混合物中回收DNA片段并再溶解于20μl DNA聚合酶I缓冲液〔含有5mMTris-HCl(PH7.5)，1mM MgSO4，0.01mM DTT， 5μg/ml牛血清白蛋白，0.08mM dATP，0.08mM dGTP，0.08mM dCTP，0.08mM dTTP的缓冲液〕中，在得到的混合物中加入5单位的大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段(Takara Shuzo)并在22℃反应30分钟，这时Hind III消化产生的5′粘性末端变成平齐末端。进一步，将反应混合物进行苯酚一氯仿提取接着乙醇沉淀。在沉淀中加入30μl含有20mM Tris-HCl(PH8.5)，10mM MgCl2，100mM KCl和1mM DTT的缓冲液和10单位的Bam HI并在37℃反应4小时。反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳，回收得到约0.3μg的一个约为1.0kb的含有编码shIL-5Rα的cDNA的DNA片段和约0.3μg的一个1.7kb的含有编码由人IL-5α和人免疫球蛋白不变区组成的融合蛋白的cDNA的DNA片段。
随后，把3μg Baculo Gold Starter试剂盒(Pharmingen)中包含的质粒pVL1393加入到30μl含有10mM Tris-HCl(PH7.5)，10mM MgCl2，100mM NaCl和1mMDTT的缓冲液中，向其中加入10单位的ECORI并在37℃反应4小时。用乙醇沉淀从反应混合物中回收DNA片段并再溶解于20μl DNA聚合酶I缓冲液中，向其中加入5单位的大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段并在22℃反应30分钟，这时ECORI消化产生的5′粘性末端变成平齐末端。进一步，反应混合物进行苯酚一氯仿提取接着乙醇沉淀。在沉淀中加入30μl含有50mM Tris-HCl(PH7.5)，10mMMgCl2，100mM NaCl和1mM DTT的缓冲液，和10单位的BglII并在37℃反应4小时。反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳，并回收约0.9μg的一个约为9.6kb的DNA片段。
然后，把200ng这样得到的来自pVL1393的ECORI(平齐末端)-BgIII片段和50ng来自pAI285或pAI294的Hind III(平齐末端)-Bam HI片段溶解于20μl T4DNA连接酶缓冲液中，向其中加入200单位的T4DNA连接酶。然后，在12℃进行连接16小时。用这样制备的重组质粒DNA转化大肠杆菌菌株JM109，从而得到质粒pAI292和pAI297，分别如图10和11所示。
随后的一个重组病毒的制备是如下所述由脂质转染法把一个线状杆状病毒DNA(Baculo Gold baculovirus DNA；Pharmingen)和制备的转移载体DNA转染进培养在TMN-FH昆虫培养基(Pharmingen)中的一个昆虫细胞sf9(从Pharmingen得到)进行的〔TANPAKUSHITSU，KAKUSAN，KOHSO(蛋白质，核酸，酶)，37，2701(1992)〕。
简要地说，把1μg的pAI292或pAI297和20ng的线状杆状病毒DNA溶解于12μl蒸馏水中，向其中加入一个6μl lipofectin和6μl蒸馏水的混合物并保留在室温15分钟。在一个独立的步骤中，把1×106sf9细胞悬浮于2ml sf900-II培养基(Gibco)中并放于一个直径为35mm的塑料细胞培养盘上。在这个盘中加入一个上面叙述的质粒DNA，线状杆状病毒DNA和脂质转染的混合物的总体积，在27℃培养细胞3天。然后，得到1ml含有一个重组病毒的培养上清液。在盘中加入1ml的新鲜sf900-II培养基并在27℃再培养细胞3天。然后，又得到1.5ml含有一个重组病毒的培养上清液。
随后，根据下面叙述的过程繁殖这样得到的重组病毒，以便用于蛋白质表达。
简要地说，把2×107sf9细胞悬浮于10ml sf900-II培养基中，放入175cm2的烧瓶(Greiner)中并保留在室温1小时使细胞粘附于烧瓶。然后，除去上清液，在烧瓶中加入15ml新鲜TMN-FH昆虫培养基和1ml上面得到的含有重组病毒的培养上清液。然后，在27℃培养细胞3天。培养后，在1.500xg离心上清液10分钟除去细胞，从而得到一个用于蛋白质表达的病毒溶液。
关于这样得到的重组病毒溶液，由下面叙述的方法计算病毒的效价(Baculo Gold Starter试剂盒手册；Pharmingen)。把许多(6×106)的Sf9细胞悬浮于4ml sf900-II培养基中，放于一个直径60mm的塑料细胞培养盘上并保留在室温1小时使细胞粘附于盘上。在除去上清液后，在盘中加入400μl新鲜sf900-II培养基和上面叙述的用sf900-II培养基稀释了10,000倍的重组病毒溶液并保留在室温1小时。然后，除去培养基，在盘中倒入5ml含有1％低熔点琼脂糖的培养基(Agarplaque琼脂糖；Pharmingen) (将1ml无菌5％水状Agarplaqueplus琼脂糖溶液和4ml TMN-FH昆虫培养基混合并保留在42℃得到的培养基)。在盘子保留在室温15分钟后，为了防止干燥在盘子周围围上乙烯基胶条。然后把盘子放在密封的塑料容器中并在27℃培养细胞6天。在盘子中加入1ml含有0.01％中性红的PBS之后，再培养细胞一天。计算形成的噬菌斑数目。从上述操作中发现每个重组病毒溶液含有约1×107噬菌斑形成单位(PFU)/ml病毒。(9)在动物细胞中表达shIL-5Rα或hIL-5Rα-FC利用电穿孔〔细胞工程，3 133(1990)〕根据Miyajiet a1.的方法向动物细胞中导入质粒。
简要地说，把4μg实施例1小章节(5)中得到的pAI289或实施例1小章节(7)中得到的pAI301转染进4×106dhfr基因缺陷的CHO细胞〔Prol.Natl.Acacl.Sci.，77 4216(1980)〕，然后把该细胞悬浮于40ml RPMI1640-FCS(10)〔含有10％FCS，1/40体积7.5％NaHCO3，3％200mML-谷氨酰胺溶液(Gibco)和0.5％青霉素/链霉素溶液(Gibco；含有5000单位/ml青霉素和5000μg/ml链霉素)的RPMI1640培养基，由NiSSUi Pharmaceuticals制造〕并分配于一个96孔微滴平板(200μl/孔)。在37℃在一个CO2温育箱中培养细胞24小时后，加入潮霉素得到浓度为0.5mg/ml。然后，再培养细胞1-2星期。从这些孔中回收细胞，这些细胞随着转化体菌落的出现而融合，然后悬浮于含有0.5mg/ml潮霉素和50nM氨甲喋呤(下文中称为“MTX”)的RPMI1640-FCS(10)培养基中得到细胞密度为1-2×105细胞/ml。把细胞悬浮液分配到一个24-孔平板(2ml/孔)并在37℃在一个CO2温育箱中培养细胞1-2星期，从而诱导50nMMTX抗性克隆。
把这样得到的50nM MTX抗性克隆悬浮于含有0.5mg/ml潮霉素和200nM MTX的RPMI1640-FCS(10)培养基中得到细胞密度为1-2×105细胞/ml。把细胞悬浮液分配于一个24-孔平板(2ml/孔)并在37℃在一个CO2温育箱中培养细胞1-2星期，从而诱导200nMMTX抗性克隆。
进一步，把这样得到的200nM MTX抗性克隆悬浮于含有0.5mg/ml潮霉素和500nM MTX的RPMI1640-FCS(10)培养基中得到细胞密度为1-2×105细胞/ml。把细胞悬浮液分配于一个24-孔平板(2ml/孔)并在37℃在一个CO2温育箱中培养细胞1-2星期，从而诱导500nM MTX抗性克隆。
把上面的转化体悬浮于培养CHO细胞的无血清培养基，CHO-S-SFMII培养基(Gibco)，得到细胞密度为1-2×105细胞/ml，并以一个100ml/烧瓶的量把细胞悬浮液分配于225cm2的烧瓶(Greiner)中。在37℃在一个CO2温育箱中培养细胞5-7天，当达到融合时回收培养基。
按如下如下从培养上清液中纯化hIL-5Rα。向1升起源于pAI289的转化体的培养基中加入29.2g NaCl和20ml 1M Tris-HCl(PH7.4)。然后，用1N的NaOH溶液把得到的混合物的PH调至7.4。用约10ml的伴刀豆球蛋白A-琼脂糖(Pharmacia)凝胶填充一个柱，然后用50ml含有20mM Tris-HCl(PH7.4)和0.5M NaCl的缓冲液以0.5ml/分钟流速洗柱。在洗之后，把如上所述制备的含有shIL-5Rα的混合物加到伴刀豆球蛋白A-琼脂糖柱，流速为0.5ml/分钟。然后，用80ml含有20mMTris-HCl(PH7.4)和0.5M NaCl的缓冲液以0.5ml/分钟的流速洗柱。然后，通过从0到0.5M线性变化α-甲基甘露糖苷浓度用15ml含有20mMTris-HCl(PH7.4)和0.5M NaCl的缓冲液和15ml含有0.5Mα-甲基甘露糖苷，20mM Tris-HCl(PH7.4)和0.5M NaCl的缓冲液洗脱吸附于伴刀豆球蛋白A-琼脂糖的蛋白质并同时以每组分1ml分部收集洗脱物(组分1-30)。进一步，在柱上加20ml含有1Mα-甲基甘露糖苷，20mMTris-HCl(PH7.4)和0.5M NaCl的缓冲液并以每组分2ml分部收集洗脱物(组分31-40)。用一个蛋白质浓度测量试剂盒(Bio-rad)测量每个组分的蛋白质浓度并回收具有高蛋白质浓度的组分10-40。用Centricon-30(Amicon)，浓缩得到的蛋白质约10倍，把蛋白质放于一个透析管中并对PBS透析，这样得到了一个纯化的shIL-5Rα(蛋白质浓度4mg/ml；3.5ml)。
在一个独立的步骤中，按如下所述得到hIL-5Rα-FC。用约5ml蛋白质A-琼脂糖凝胶填充一个柱并用50ml PBS洗柱.在洗涤之后，以一个0.5ml/分钟的流速将1升上述起源于pAI301的转化体的培养基，加到蛋白质A-琼脂糖柱上。然后，用50ml PBS洗柱。然后，在柱上加20ml 0.1M柠檬酸缓冲液(PH3.0)从而洗脱吸附于蛋白质A-琼脂糖的蛋白质并同时以每组分1ml分部收集洗脱物。在每个组分中加入0.15ml 2M Tris-HCl(PH9.0)调节PH。用一个蛋白质浓度测量试剂盒(Bio-racl)测量每一组分的蛋白质浓度并回收那些具有高蛋白质浓度的组分。把得到的蛋白质溶液放于一个透析管中并对PBS透析。这样得到一个纯化的hIL-5Rα-FC(蛋白质浓度1.8mg/ml；5.5ml)。(10)在昆虫细胞中表达shIL-5Rα或hIL-5Rα-FC根据Baculo Gold Starter试剂盒(Pharmingen)附带的手册通过下面所述的程序进行shIL-5Rα和hIL-5Rα-FC的表达。
利用伴刀豆球蛋白A-琼脂糖和二乙氨乙基(DEAE)-琼脂糖，或蛋白质A-琼脂糖(都由Pharmacia Biotech制造)分别进行从培养基中回收shIL-5Rα和hIL-5Ra-FC。
按如下所述得到shIL-5Rα。简要地说，把6×106sf9细胞悬浮于一个225cm2烧瓶(Greiner)中的45ml含有10％FCS的Grace′s昆虫培养基(Gibco)中并在27℃培养3-4天。在除去培养上清液后，加入30ml含有10％FCS的新鲜Grace′s昆虫培养基和1ml含有约1×107pFU/ml浓度的起源于实施例1的1(8)中得到的转移载体pAI292的重组病毒的溶液。在27℃再培养细胞1天。然后，在除去培养上清液后，加入45ml新鲜sf900-II培养基并培养细胞2-3天。在完成培养后，回收培养上清液并在1,500xg离心10分钟，从而得到一个上清液。在得到的培养基中加入NaCl得到最后浓度为0.5M。然后加入1/50体积的1M Tris-HCl(PH7.4)并用1N NaOH溶液调节得到的混合物的PH至7.4。
用约10ml伴刀豆球蛋白A-琼脂糖凝胶填充一个柱并用50ml含有20mM Tris-HCl(PH7.4)和0.5mM NaCl的缓冲液以一个0.5ml/分钟的流速洗柱。在洗涤之后，把500ml含有如上述制备的培养基的shIL-5Rα加到伴刀豆球蛋白A-琼脂糖柱，流速为0.5ml/分钟。然后，用80ml含有20mM Tris-HCl(PH7.4)，和0.5mM NaCl的缓冲液以一个0.5ml/分钟的流速洗柱。然后，在柱上加60ml含有1Mα-甲基甘露糖苷，20mMTris-HCl(PH7.4)和0.5M NaCl的缓冲液，从而洗脱吸附于伴刀豆球蛋白A-琼脂糖的蛋白质并同时以每组分2ml分部收集洗脱物。用一个蛋白质浓度测量试剂盒(Bio-Rad)测量每组分的蛋白质浓度。回收总量44ml的高蛋白质浓度的组分并对20mM Tris-HCl(PH7.4)透析。进一步，为了回收总量40ml的高蛋白质浓度组分，对900ml含有如上所述制备的培养基的hIL-5Rα同样的操作，回收组分对20mM Tris-HCl(PH7.4)透析。
在透析之后，合并两部分蛋白质溶液并加到一个用10ml二乙氨乙基(DEAE)-琼脂糖凝胶填充的柱上使蛋白质被吸收。由从0到0.5M线性变化NaCl浓度从柱中洗脱shIL-5Rα。这样回收总量4ml的具有高浓度shIL-5Rα的组分。把这一蛋白质溶液放于一个透析管中并对PBS透析。这样得到一个纯化的shIL-5Rα(蛋白质浓度400μg/ml；4.5ml)。
在一个独立的步骤中，按如下所述得到hIL-5Rα-FC。简要地说，把6×106sf9细胞悬浮于一个225cm2烧瓶(Greiner)中的45ml含有10％FCS的Grace′s昆虫培养基(Gibco)中并在27℃培养3-4天。在除去培养上清液后，加入30ml含有10％FCS的新鲜Grace′s昆虫培养基和1ml含有约1×107PFU/ml的起源于实施例1的1(8)中得到的转移载体pAI297的重组病毒的溶液。在27℃再培养细胞1天。然后，在除去培养上清液后，加入45ml新鲜sf900II培养基并培养细胞2-3天。在完成培养后，回收培养上清液并在1.500xg离心10分钟，从而得到一个上清液。
用约5ml蛋白质A-琼脂糖凝胶填充一个柱并用50mlPBS洗柱。在洗柱之后，在蛋白质A-琼脂糖柱上加450ml含shIL-5Rα-FC上述培养基，加样流速为0.5ml/分钟。然后，用50ml PBS洗柱。然后，在柱上加20ml 0.1M柠檬酸缓冲液(PH3.0)，从而洗脱吸附于蛋白质A-琼脂糖上的蛋白质并同时以每组分1ml分部收集洗脱物。在每一组分中加入0.15ml 2M Tris-HCl(PH9.0)调节PH。用一个蛋白质浓度测量试剂盒(Bio-rad)测量每一组分的蛋白质浓度并回收那些高蛋白质浓度的组分。用Centricon-30(Amicon)浓缩将这样得到的蛋白质溶液约浓缩3倍，放置于一个透析管中并对PBS透析。这样得到一个纯化的shIL-5Rα-FC(蛋白质浓度0.4mg/ml；1.8ml)。(11)在大肠杆菌中表达一个shIL-5Rα部分片段在大肠杆菌中表达一个shIL-5Rα部分片段是通过在下面将要叙述的E.Coli表达载体pMkex1中插入一个含有编码shIL-5Rα部分片段的cDNA的DNA片段以便构建pAI263并用pAI263转化E.Coli进行的。
简要地说，把3μg质粒pGHA2(Kokai No.Sho60-221091)加入到30μl含有50mM Tris-HCl(PH7.5)，10mM MgCl2，100mM NaCl和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的ECORI并在37℃反应4小时。用乙醇沉淀从反应混合物中回收DNA片段，在这些片段中加入30μl含有10mM Tris-HCl(PH7.5)，10mM MgCl2，50mM NaCl和1mMDTT的缓冲液；10单位的ClaI并在37℃反应4小时，反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳，并回收约0.3μg的来自pGHA2含有的启动子区的ECoRI-ClaI片段。
把3μg质粒pTerm2加入到30μl含有50mM Tris-HCl(PH7.5)，10mM MgCl2，100mM NaCl和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的ECORI并在37℃反应4小时。用乙醇沉淀从反应混合物中回收DNA片段。在这些片段中加入30μl含有10mM Tris-HCl(PH8.4)，10mMMgCl2，100mM NaCl和1mM DTT的缓冲液和10单位的NsiI并在37℃反应4小时。反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳，回收约0.8μg的来自pTerm2的ECoRI-NSiI片段。
把15ng的来自pGHA2的ECoRII/ClaI片段，100ng的来自pTerm2的ECoRI/NSiI片段和100ng的一个SEQ ID NO15所示的合成DNA溶解于20μl T4DNA连接酶溶液中，向其中加入200单位的T4DNA连接酶。然后，在12℃进行连接16小时。用这样制备的重组质粒DNA转化大肠杆菌菌株JM109，从而得到质粒pMdex1，如图12所示。
在一个独立的步骤中，把图3中得到3μg pAI234加入到30μl含有50mM Tris-HCl(PH7.5)，10mM MgCl2，100mM NaCl和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的PstI并在37℃反应4小时。用乙醇沉淀从反应混合物中回收DNA片段并溶解于20μlT4DNA聚合酶I缓冲液〔一种含有33mM Tris-HCl(PH8.0)，66mM KAC，10mM MgAC2，0.5mMDTT和0.01％BSA的缓冲液〕。在得到的混合物中加入5单位的T4DNA聚合酶I(Takara Shuzo)并在12℃反应15分钟，这时PstI消化产生的5′粘性末端变成平齐末端。对反应混合物进行苯酚-氯仿提取接着乙醇沉淀。在沉淀中加入30μl含有20mM Tris-HCl(PH8.5)，10mM MgCl2，100mM KCl和1mMDTT的缓冲液和10单位的Bam HI并在37℃反应4小时。反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳，回收约0.3μg的一个约为0.7kb的含有编码一个shIL-5Rα片段的cDNA的DNA片段。
把图12中得到的3μg大肠杆菌表达载体，pMkex1溶解于30μl含有20mM Tris-HCl(PH8.5)，10mM MgCl2，100mM KCl和1mMDTT的缓冲液中，向其中加入10单位的Bam HI并在37℃反应4小时。用乙醇沉淀从反应混合物中回收DNA片段并溶解于30μl含有50mM Tris-HCl(PH7.5)，10mM MgCl2，100mM NaCl和1mMDTT的缓冲液中，向其中加入10单位的ECoRV并在37℃反应4小时。用乙醇沉淀从反应混合物中回收约1.5μg的DNA片段。
把50ng这样得到的编码一个shIL-5Ro片段的cDNA和100ng这样得到的来自pMkex1的ECoRV/Bam HI片段溶解于20μl T4DNA连接酶缓冲液中，向其中加入200单位的T4DNA连接酶。然后，在12℃进行连接16小时。用这样制备的重组质粒DNA转化大肠杆菌菌株JM109，从而得到质粒pAI263，如图13所示。
把上面的质粒pAI263转染进大肠杆菌(分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版社发表的第二版，1989)，并培养在400ml含有200μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中在37℃4小时。然后，加入0.5mMIPTG并于37℃再培养细胞2小时。在3,000xg离心400ml的培养基15分钟。将含有大肠杆菌细胞的沉淀悬浮于100ml缓冲液I〔10mMTris-HCl(PH8.0)，1mM EDTA，150mM NaCl〕。在再离心后，把沉淀悬浮于7ml缓冲液I并超声波粉碎细胞。在10,000xg离心得到的悬浮液30分钟，把沉淀溶解于500μl SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳样品缓冲液〔6mM Tris-HCl(PH6.8)，2％SDS，10％甘油，5％2-硫基乙醇〕并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。这样得到一个纯化的具有一个约为27KD的分子量的ShIL-5Rα片段。(12)从人IL-5Rα表达细胞制备一个细胞膜部分。
按如下所述进行从hIL-5Rα基因转染的CTLL-2细胞〔J.Exp.Mecl.，177，1523(1993)〕或对照CTLL-2细胞〔ATCC TIB214〕制备膜成分。
简要地说，离心细胞(1,200rpm，5分钟)，用PBS洗细胞两次，把细胞悬浮于细胞裂解缓冲液〔20mM HEPES(PH7.4)，1mM EDTA，0.5mM PMSF，250mM蔗糖〕中并用一个匀浆器破碎。破碎后，在5,500rpm离心细胞15分钟除去沉淀。进一步在35,000rpm离心细胞回收沉淀的细胞膜组分。2.动物的免疫和生产抗体细胞的制备对5星期大的雌性BALB/C小鼠或雌性SD大鼠各自用2mg铝胶和1×109细胞的百日咳疫苗(Chiba县血清研究院)和各50μg的实施例1章节(1)的II章节(9)，(10)，(11)或(12)中得到的抗原一起给药。给药后2星期，一星期一次施用50μg蛋白质，总共4次。从眼球静脉丛或末端静脉收集血样，通过在下面3中叙述的酶免疫测定检测其血清的抗体效价。在最后免疫3天后从那些显示足够抗体效价的小鼠或大鼠中取走脾脏。在这个免疫实验中，把实施例1第1节的II第(12)中得到的细胞膜组分用作抗原免疫13只小鼠和5只大鼠。但是，在这些动物中没有观察到明显的抗体效价的上升。同时，在用实施例1第1节II节(9)中得到的shIL-5Rα免疫的5只大鼠中或用实施例1节1第II节(10)中得到的shIL-5Rα免疫的10只大鼠中同样也观察不到满意的抗体效价的上升。
把脾在MEM培养基(NiSSUi Pharmaceaticals)中切成碎片；用镊子松散并离心(1,200rpm，5分钟)。然后，滗弃上清液，用Tris-NH4Cl缓冲液(PH7.65)处理剩余物1-2分钟除去红细胞并用MEM培养基洗3次。把得到的脾细胞用于细胞融合。3.酶免疫测定把如实施例1第1节(10)部分中所述的从昆虫细胞培养上清液得到的hIL-5Rα-FC用作一个抗原根据下面叙述的两个方法进行对起源于用实施例1第1节的第(9)或(10)部分中得到的shIL-5Rα免疫的小鼠或大鼠的杂交瘤细胞培养上清液或抗血清进行测定。(A)向一个96孔的EIA平板(Greiner)中，分别以50μl/孔的量分配给用PBS稀释到1μg/ml的hIL-5Rα-FC和一个对照抗原，具有一个普通人Ig不变区的抗-GD3嵌合抗体KM871并在4℃保留过夜使蛋白质被吸收。在洗涤之后，在平板中加入含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS(下文中称为1％BSA-PBS)(100μl/孔)并在室温反应1小时，从而封闭剩余的活性基团。在滗弃1％BSA-PBS之后，向孔中分配给一个免疫接种小鼠或大鼠起源的抗血清和一种杂交瘤的培养上清液(50μl/孔)并反应2小时。在用吐温-PBS洗涤之后，在平板中加入过氧化物酶标记的兔抗小鼠免疫球蛋白或抗大鼠免疫球蛋白(DAKO)(50μl/孔)并反应1小时，用吐温-PBS洗。然后，用ABTS底物溶液〔通过在1升0.1M柠檬酸缓冲液(PH4.2)中溶解550mg2，2′连氮基二(3′-乙苯基噻唑-6-磺酸)二铵盐并在使用之前立即加入1μl/ml过氧化氢得到的一种溶液〕使得到的混合物形成一种颜色来测量OD415nm的吸光值(NJ2001；Japan Intermed)。(B)进一步，为了具有更高可能性筛选一个具有对IL-5的中和活性的单克隆抗体，利用一个生物素标记人IL-5和从实施例1第1节小章节(10)中得到的昆虫细胞培养上清液中得到的shIL-5Rα-FC对一个抑制与一个IL-5受体结合的活性进行筛选。按照免疫学方法杂志，125，233(1989)中叙述的方法制备用于生物素标记的人IL-5。
通过下面的过程按照与生物素标记试剂(Biotin-LC-Hydrazide)(Pierce)相结合的方案对人IL-5进行生物素标记。首先，把1.6mg/ml溶解于PBS的人IL-5加到一个用一个标记缓冲液(100mM NaAC，0.02％NaN3，PH5.5)平衡过的PD10柱(Pharmacia)上进行盐交换并回收1ml具有高蛋白浓度的组分。向0.5ml这种人IL-5溶液中加入1ml含有30mM偏高碘酸的标记缓冲液并在室温避光反应30分钟。在完成反应后，把反应混合物加到一个用标记缓冲液平衡过的PD10柱上除去不反应的偏高碘酸。这样得到1.5ml具有高蛋白浓度组分。向该组分中加入20l含有5mM上述生物素标记试剂的一个标记缓冲液并在室温反应1小时。在完成反应后，加入50μl反应终止缓冲液(0.1M Tris，PH7.5)，然后，把反应混合物加到一个用含0.05％NaN3的PBS平衡过的PD10柱上交换盐并同时除去未反应试剂。把这样得到的生物素标记人IL-5贮藏于4℃。
用PBS把从实施例1第1节小章节(10)中的昆虫细胞培养上清液中得到的shIL-5Rα-FC稀释到一个5μg/ml的浓度，分配到96孔EIA平板(Greiner)(50μg/)并保留在4℃过夜使蛋白质被吸收。在用PBS洗涤之后，向平板中加入含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS(1％BSA-PBS)(100μl孔)并在室温反应1小时封闭剩余的活性基团。然后，用吐温-PBS洗平板。然后，以50μl/孔的量将来源于免疫小鼠或大鼠的一个抗血清和杂交瘤培养上清液，和上述生物素标记人IL-5分别加入该平板并在4℃反应过夜。在第二天，用吐温0PBS洗平板，然后加入50μl/孔的用1％BSA-PBS稀释4000倍的过氧化物酶标记抗生物素蛋白(Nippon Reizo)并在室温反应1小时。在用吐温-PBS洗之后，加入50μl/孔ABTS底物溶液使之显现颜色并测量OD415的吸光值。
对于起源于那些用实施例1第1节小章节(11)中得到的hIL-5Rα片段免疫的小鼠或大鼠的抗血清和杂交瘤的培养上清液的测量，把实施例1第1节小部分(11)中由大肠杆菌生产的hIL-5Rα片段用作抗原。以相同于上面叙述的方式，分别将大肠杆菌生产的shIL-5Rα和一个大肠杆菌细胞蛋白质(对照抗原)吸附到平板。用这样制备的平板测定杂交瘤的培养上清液和免疫小鼠或大鼠的抗血清的反应性。
进一步，对于起源于那些用实施例1第1节小章节(12)中得到的来自hIL-5Rα表达细胞的细胞膜组分免疫的小鼠或大鼠的抗血清和杂交瘤培养上清液的测定，把实施例1第1节小章节(12)中得到的细胞膜组分用作抗原。以一个相同于上面所述的方式，分别将来自IL-5Rα表达细胞的细胞膜组分和一个来自对照细胞的细胞膜组分吸附到平板。用这样制备的平板测定免疫小鼠或大鼠的抗血清和杂交瘤培养上清液的反应性。4.制备鼠骨髓瘤细胞在一个正规培养基上培养一个8-氮杂鸟嘌呤抗性鼠骨髓瘤细胞系，P3-U1并获得不少于2×107细胞，并将它作为细胞融合的亲本。5.杂文瘤的制备以10∶1的比例将实施例1第2节中得到的小鼠或大鼠脾细胞和实施例1第4节中得到的骨髓瘤细胞混合。离心该混合物(1,200rpm，5分钟)。然后滗弃上清液并充分疏松沉淀细胞。向得到的细胞中，以每108鼠脾细胞加入0.2到1ml的量加入由2g聚乙二醇-1000(PEG-1000)，2mlMEM培养基和0.7mlDMSO组成的混合溶液，接着在37℃在1-2分钟间隔加入1-2mlMEM培养基部分。然后，加入MEM培养基至总量为50ml。在离心(900rpm，5分钟)后，滗弃上清液并温和疏松细胞。然后，用一个吸管抽吸和释放把细胞温和地悬浮于100mlHAT培养基中。
把这一细胞悬浮液分配到一个96孔培养平板(100μl/孔)并在37℃在一个5％CO2的温育箱中培养10-14中。用实施例1第3节中叙述的酶免疫测定检测得到的培养上清液并选择那些显示与从一个昆虫细胞培养上清液制备的hIL-5Rα-FC或与大肠杆菌生产的shIL-5Rα有特异性反应的孔。进一步，用HT培养基和一个正规培养基替换其中的培养基，重复克隆两次。结果建立了产生一个抗人IL-5Rα单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
筛选约4000个从用实施例第1第1节小章节(11)中得到的hIL-5Rα片段免疫的6只小鼠或8个大鼠得到的杂交瘤克隆的结果，得到一个抗人IL-5Rα单克隆抗体并命名为KM1074。与后面将要叙述的抗人IL-5Rα单克隆抗体KM1257和KM1259相比，它与IL-5Rα的反应性特别弱。
在一个独立的步骤中，从12或6个显示一个高抗体效价的动物获得杂交瘤，所述动物选自于用实施例1第1节小章节(9)中得到的shIL-5Rα或实施例1第1节小章节(10)中得到的shIL-5Rα免疫的15或20个小鼠。筛选超过10000个杂交瘤克隆的结果，建立了81个杂交瘤克隆，它们产生一个抗人IL-5Rα单克隆抗体并当用在后来的实施例3第1节中叙述的方法测试时显示一个与hIL-5Rα表达细胞的特异性反应。在这些中间，在将在后面实施例3第1节中叙述的免疫细胞染色方法中显示最强反应性的单克隆抗体是KM1257。杂交瘤KM1257以登记号FERM BP-5133，在1995年6月13日寄存于工业科学和技术部，国家生物科学和人技术研究院(1-3，Higashi 1-Chome，TsukubaCity，Ibaraki，Japan；下文中该研究院地址相同)。在这81个克隆中，只有六个克隆显示了将在后面实施例3的第2节叙述的抗IL-5的生物活性的强抑制活性。在这六个克隆中，显示最强抑制活性的单克隆抗体是KM1259和KM1486。杂交瘤KM1259以登记号FERM BP-5134在1995年6月13日和杂交瘤KM1486以登记号FERM BP-5651在1996年9月3日贮存于工业科学和技术部，国家生物科学和人技术研究院。
单克隆抗体KM1257，KM1259和KM1486的反应性表示在图14。利用一个亚类型测试药盒通过一个酶免疫测定确定了每个抗体的亚类，结果是KM1257，KM1259和KM1486的抗体类别都是IgG1。
6、单克隆抗体的纯化以5-20×106细胞/鼠的剂量给异十八烷处理的，雌性裸体的8个星期大的小鼠(Balb/c)腹膜内施用上面5中得到的杂交瘤细胞系。约药后10到20天，杂交瘤引起腹水肿瘤。从其中积累了腹水的那些鼠中，收集腹水(1-8ml/鼠)，以3,000rpm离心5分钟，除去固体，然后用辛酸沉淀方法(抗体--本实验室手册，冷泉港实验室，1988)纯化，获得纯化的单克隆抗体。
实施例2制备抗人IL-5Rα人属性抗体1.串联的表达盒型人属性抗体表达载体pkANTEX93的构建。
根据公开在kokai NO.257891/90中的质粒pSE1UK1SEd1-3，按如下所述构建了一个串联表达盒型人属性化抗体表达载体pKANTEX93，用于在动物细胞中表达人抗体IgG1 K型一个人属性化抗体，该载体中在编码人抗体Cγ1的一个cDNA和编码人抗体Cκ的一个cDNA的上游分别转染了编码人属性化抗体VH的一个cDNA和编码人属性化抗体VL的一个cDNA，所构建的人属性化抗体表达载体用于在动物细胞中表达人嵌合抗体和人CDR-移存植抗体。
(1)在兔β-球蛋白基因拼接信号和多聚(A)信号中存在的ApaI和EcoRI限制位点的修饰利用一个NotI-ApaI片断(VH)和一个EcoRI-Sp1I片断(VL)，通过在一个人属性化抗体表达载体中插入一个表达盒中的人嵌合抗体或人CDR-移植的抗体的可变区，如下所述修饰了存在于质粒pSEIUK1SEd1-3的兔β-球蛋白基因拼接多聚(A)信号中的ApaI和EcoRI限制位点，以便能够构建人嵌合抗体表达载体或人CDR-移植的抗体(＝人属性化抗体)表达载体。
简要地说，将3ug质粒pBluescript SK(一)(Stratagene)加入10ul含有10mM Tris-Hcl(pH7.5)，10mM氯化镁和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶ApaI(Takara Shuzo)，并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，利用一个DNA制备平齐末端药盒使通过ApaI消化产生的3’粘性末端变成平齐末端，利用DNA连接药盒(Takara Shuzo)连接了所产生的DNA片断。利用这样得到的重组质粒DNA溶液，转化大肠杆菌HB101，得到图15中所示的质粒pBSA。
进一步，将3ug这样得到的质粒pBSA加入到10ul含有50mMTris-HCl(pH7.5)，10mM氯化镁，100mM NaCl和1mM DTT的缓冲液中，其中加入10单位的限制酶EcoRI(Takara，Shuzo)并在37℃反应1小时，乙醇沉淀反应混合物，利用DNA制备平齐末端药盒(Takara Shuzo)使EcoRI消化产生的5’粘性末端变成平齐末端，并用DNA连接药盒(Takara Shuzo)连接产生的DNA片段。利用这样得到的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌HB101，得到图16中所示的质粒pBSAE。
随后，将3ug这样得到的质粒pBSAE加入到10ul含有10mMTris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，50mM NaCl和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶Hind III(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，沉淀溶解于20ul含有10mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，把产生的混合物分成2个10ul部分，在一部分中，加入10单位的限制酶Sac II(Toyobo)，在另一部分，加入10单位的限制酶KpnI(Takara Shuzo)，然后，两个混合物都在37℃反应1小时，两个反应混合物都进行琼脂糖凝胶电泳，回收得到一个大约2.96kb的Hind III-SacII片段和一个大约2.96kb的KpnI-Hind III片段，每个大约0.3ug。
随后，将3ug质粒pSE1UK1SEd1-3加入到10ul含有10mMTris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶Sac II(Toyobo)和10单位的限制酶KpnI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，沉淀溶解于10ul含有10mMTris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，50mM NaCl和1mM DTT的缓冲液中。在产生的混合物中，加入10单位的限制酶Hind III(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时，反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳，回收得到一个大约为2.42kb的HindIII-Sac II片段和一个大约为1.98kb的KpnI-Hind III片段，每个大约0.2ug。
然后，来自质粒pSE1UK1SEd1-3的0.1ug Hind III-Sac II片段和来自上面得到的pBSAE的0.1ug Hind III-Sac II片段溶解于蒸馏水中，得到总量为20ul，并用Ready-To-Go T4 DNA连接酶(Pharmacia Biotech)连接。利用这样得到的重组质粒DNA溶液，转化大肠杆菌HB101得到质粒pBSH-S，显示如图17。同时，来自质粒pSE1UK1SEd1-3的0.1ug的KpnI-Hind III片段和来自pBSAE(上面获得)的0.1ug的KpnI-HindIII片段溶解于蒸馏水中得到总量为20ul并用Ready-To-Go T4 DNA连接酶(Pharmacia Biotech)连接。用这样得到的重组质粒DNA溶液，转化大肠杆菌HB101以获得质粒pBSK-H，显示于图18。
然后，各3ug这样得到的质粒pBSH-S和pBSK-H分别加入10ul含有10mMTris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶ApaI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀两个反应混合物，用DNA制备平齐末端药盒(Takara Shuzo)使ApaI消化产生的3’粘性末端变成平齐末端，用DNA连接药盒(Takara Shuzo)连接产生的DNA片段。利用这样得到的每个重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌HB101得到质粒pBSH-SA和pBSK-HA，显示如图19。
然后，各5ug这样得到的质粒pBSH-SA和pBSK-HA分别加入10ul含有50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，100mM NaCl和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶EcoRI(Takara Shuzo)并在37℃反应10分钟使质粒部分消化。然后乙醇沉淀两个反应混合物。在用DNA制备平齐末端药盒(Takara Shuzo)使EcoRI消化产生的5’粘性末端变成平齐末端之后，两个反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳，得到一个大约为5.38kb的片段和一个大约为4.94kb的片段，每个大约为0.5ug，然后，各0.1ug这样得到的片段分别溶解于蒸馏水中，得到总量为10ul，并用Ready-To-Go T4DNA连接酶(Pharmacia Bioteeh)连接，用每个这样得到的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌HB101得到质粒pBSH-SAE和pBSK-HAE，显示如图20。
然后，将各3ug这样得到的质粒pBSH-SAE和pBSK-HAE分别加入10ul含有50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，100mM NaCl和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶EcoRI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀两个反应混合物，用DNA制备平齐末端药盒(Takara Shuzo)，使EcoRI消化产生的5’粘性末端变成平齐末端，并用DNA连接药盒(TakaraShuzo)连接产生的DNA片段。用每个这样得到的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌HB101得到质粒pBSH-SAEE和pBSK-HAEE，显示如图21。根据自动读序测试药盒(Pharmacia Biotech)附带的方法分别反应各10ug这样得到的质粒，然后用A.L.F DNA测序仪(Pharmacia Biotech)电泳从而测定碱基序列。结果证明，通过上面叙述的修饰已经删除了ApaI和EcoRI限制位点。
(2)在含有兔β-球蛋白基因拼接信号，兔β-球蛋白基因多聚(A)信号和SV40早期基因多聚(A)信号的下游部分导入一个SalI限制位点。
为了保证人属性化抗体表达载体中的人抗体H和L链的表达启动子能被任何启动子替代，如下所述，一个SalI限制位点被转染进入含有质粒pSE1UK1SEd1-3的兔-球蛋白基因拼接信号，兔β-球蛋白基因多聚(A)信号和SV40早期基因多聚(A)信号的下游部分。
简要地说，将3ug实施例2的第1节的小部分(1)中得到的质粒pBSK-HAEE加入10ul含有10mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶NaeI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时，乙醇沉淀反应混合物，沉淀溶解于20ul含有50mMTris-HCl(pH9.0)和1mM MgCl2的缓冲液中，向其中加入1单位的碱性磷酸酶(大肠杆菌C75，Takara Shuzo)，在37℃反应1小时，使5’末端去磷酸。然后，对反应混合物进行苯酸一氯仿提取，接着乙醇沉淀。沉淀溶解于20ul含有10mM Tris-Hcl(pH8.0)和1mM乙＝胺四乙酸二钠的缓冲液(下文中称为“TE缓冲液”)中。1ul的混合物和0.1ug的一个去磷酸的SalI接头(Takara Shuzo)加入蒸馏水中，得到总量为20ul，用Ready-To-Go T4DNA连接酶(Pharmacia Biotech)连接。用这样得到的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌HB101得到质粒pBSK-HAEESal，如图22所示。根据自动读序药盒(Pharmacia Biotech)附带的方法反应10ug各种这样得到的质粒，并然后用A.L.F DNA测序仪(Pharmacia Biotech)电泳，从而确定碱基序列。结果证明，一个SalI限制位点已经转染进入含有兔β-球蛋白基因拼接信号，兔β-球蛋白基因多聚(A)信号和SV40早期基因多聚(A)信号的下游部分。
(3)存在于单纯疱疹病毒胸苷激酶(下文称为“HSVtk”)基因的多聚(A)信号中的ApaI限制位点的修饰。
存在于定位在质粒pSE1UK1SEd1-3的Tn5卡那霉素磷酸转移酶基因下游的HSVtk基因的多聚(A)信号中的ApaI限制位点的修饰进行如下。
简要地说，将3ug实施例2的第1节的小部分(1)中得到的质粒pBSA加入10ul含有10mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2和1mMDTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶XhoI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时，反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳，得到大约1ug的一个大约2.96kb的SacII-XhoI片段。
然后，将5ug质粒pSE1UK1SEd1-3加入10ul含有10mMTris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶Sac II(Toyobo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，沉淀溶解于10ul含有50mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM NaCl，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶XhoI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳，得到大约1ug的一个大约为4.25kb的Sac II-XhoI片段。
随后，将0.1ug上面得到的来自pBSA的Sac II-XhoI片段和来自质粒pSE1UK1SEd1-3的Sac II-XhoI片段加入蒸馏水，得到总量为20ul，然后用Ready-To-Go T4 DNA连接酶(Pharmacia Bio tech)连接。用这样得到的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌HB101得到质粒pBSX-S，如图23所示。
随后，将3ug这样得到的质粒pBSX-X加入10ul含有1mMTris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶ApaI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，利用DNA制备平齐末端药盒(Takara Shuzo)使ApaI消化产生的3’粘性末端变成平齐末端，并用DNA连接药盒(Takara Shuzo)连接产生的DNA片段。用这样得到的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌HB101得到质粒pBSX-SA，显示如图24。根据自动读序药盒(Pharmacia Biotech)附带的方法反应10ug这样得到的质粒，然后用A.L.F，DNA测序仪(Pharmacia Biotech)电泳确定碱基序列。结果证明，已经删除了HSVtk基因多聚(A)信号的ApaI限制位点。
(4)构建一个人属性化抗体L链表达单位。
具有一个人属性化抗体L链表达单位的质粒mMohCk构建如下，所述质粒中一个编码人k-型L-链(Ck)的不变区的cDNA定位于莫洛尼氏鼠白血病毒终端重复序列启动子/增强子下游并且其中可以在表达盒中插入一个编码人嵌合抗体或人CDR-移植抗体的VL的cDNA。
简要地说，将3ug质粒pBluescript Sk(-)(Stratagene)加入10ul含有10mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶SacI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，将沉淀加入含有10mM Tris-HCl(pH7.5)50mM NaCl，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶ClaI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，用DNA制备平齐末端药盒(Takara Shuzo)使SacI和ClaI消化产生的粘性末端变成平齐末端。然后，反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳，从而得到大约1ug的一个大约为2.96kb的DNA片段，然后，将0.1ug得到的DNA片段加入蒸馏水得到总量为20ul，并用Ready-TO-GO T4DN连接酶(Pharmacia Biotech)连接。用这样得到的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌HB101得到质粒pBSSC，如图25所示。
然后，将3ug这样得到的质粒pBSSC加入10ul含有10mMTris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶KpnI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，沉淀溶解于10ul含有50mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM NaCl，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶XhoI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。然后，反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳，从而得到大约1ug的大约为2.96kb的Kpn-XhoI片段。
然后，将5ug公开在kokai NO.205694/94的质粒pAGE147加入到10ul含有10mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶KpnI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，将沉淀溶解于10ul含有50mM Tris-HCl(pH7.5)，100mMNaCl，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶XhoI(Takara Shuzo)并且37℃反应1小时，然后，反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳，从而得到大约0.3ug的一个大约为0.66kb的含有莫洛尼化鼠白血病毒终端重复序列的启动子/增强子的KpnI-XhoI片段。
然后，将上面得到的0.1ug来自pBSSC的KpnI-XhoI片段和0.1ug来自pAGE147的KphI-XhoI片段溶解于蒸馏水得到总量为20ul，并用Ready-TO-GO T4 DNA连接酶(Pharmacia Biotech)连接。用这样得到的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌HB101得到质粒pBSMo，如图26所示。
然后，将3ug上面得到的质粒pBSMo加入10ul含有10mMTris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶KpnI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，将沉淀溶解于10ul含有10mM Tris-HCl(pH7.5)，50mM NaCl，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中进一步加入10单位的限制酶HindIII(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。然后，反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳，从而得到大约1ug一个大约为3.62kb的KpnI-Hind III片段。
然后，利用一个自动DNA合成仪(380A，Applied Biosystems)分别合成了具有SEQ ID NOS16和17所示的碱基序列的两个合成DNA。然后，将0.3ug每个得到的合成DNA加入15ul蒸馏水并在65℃加热5分钟。反应混合物在室温下保留30分钟。在这个混合物中，加入2ul 10X缓冲液[500mM Tris-HCl(pH7.6)，100mM MgCl2，50mM DTT]和2ul的10mM ATP。进一步加入10单位的T4聚核苷酸激酶(Takara Shuzo)并在37℃反应30分钟使5’末端磷酸化。然后，将0.1ug上面得到的来自质粒pBSMo的KpnI-Hind III片段(3.66kb)和0.05ug磷酸化的合成DNA加入蒸馏水得到总量为20ul，并用Ready-To-Go T4DNA连接酶(Pharmacia Biotech)连接，用这样得到的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌HB101得到质粒pBSMoS，如图27所示。根据自动读序药盒(Pharmacia Biotech)附带的方法反应10ug这样得到的质粒。并用A.L.F.DNA测序仪(Pharmacia Biotech)电泳从而决定碱基序列，结果证明，所需的合成DNA已经被转染了。
然后，将3ug公开在kokai No.304989/93的质粒pChiIgLAl溶解于10ul含有50mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM NaCl，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，其中加入各10单位的限制酶EcoRI(Takara Shuzo)和EcoRV(TakaraShuzo)并在37℃反应1小时。反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳，从而得到大约1ug的一个大约为9.70kb的EcoRI-EcoRV片段。然后，用一个自动DNA合成仪(380A，Applied Biosystems)合成分别具有SEQ ID NOS18和19所示的碱基序列的两个合成DNA，然后，将各0.3ug得到的合成DNA，加入到15ul蒸馏水并在65℃加热5分钟。反应混合物在室温下保留30分钟，在这一溶液中加入2ul 10x缓冲液[500mM Tris-HCl(pH7.6)，100mMMgCl2，500mM DTT]和2ul的10mM ATP，进一步加入10单位的T4聚核苷酸激酶(Takara Shuzo)并在37℃反应30分钟使5’末端磷酸化。然后，将0.1ug上面得到的来自质粒pChiIglA1的EcoRI-EcoRV片段(9.70kb)和0.05ug磷酸化的合成DNA加入蒸馏水中得到总量为20ul并用Ready-TO-GO T4 DNA连接酶(Pharmacia Biotech)连接。用这样得到的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌HB101得到质粒pChiIgLAlS，如图28所示。
然后，将3ug上面得到的质粒pBSMoS溶解于10ul含有20mMTris-HCl(pH8.5)，100mM KCl，10mM MgCl2，和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶HpaI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，将沉淀溶解于10ul含有50mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM NaCl，10mMMgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶EcoRI(TakaraShuzo)并在37℃反应1小时。然后，反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳得到大约1ug一个大约为3.66kb的HpaI-EcoRI片段。
然后，将10ug上面得到的质粒pChiIgLAlS溶解于10ul含有20mMTris-HCl(pH7.9)，50mM KAc，10mM MgAc2，1mM DTT和100ug/ml BSA的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶NlaIV(New England Biolabs)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，将沉淀溶解于10ul含有50mMTris-HCl(pH7.5)，100mM NaCl，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶EcoRI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。然后，反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳得到大约0.3ug的一个大约为0.41kb的N1aIV-EcoRI片段。
然后，将各0.1ug上面得到的来自pBSMoS的HpaI-EcoRI片段和来自pChiIgLAlS的NlaIV-EcoRI片段加入蒸馏水得到总量为20ul并用Ready-TO-GO T4 DNA连接酶(Pharmacia Biotech)连接。用这样得到的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌HB101得到质粒pMohCk，如图29所示。
(5)构建人属性化抗体H链表达单位具有人属性化抗体H链表达单位的质粒mMohCrl构建如下，所述质粒中一个编码人IgG1型H链(Cr1)的不变区的cDNA定位于莫洛尼氏鼠白血病毒终端重复序列启动子/增强子的下游并且其中将一个编码人嵌合抗体或人CDR-移植抗体的VH的cDNA插入到表达盒中。
简要地说，在实施例2的第1节的小部分(4)中得到的质粒pBSMO 3ug加入到10ul含有50mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM NaCl，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶XhoI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，将沉淀溶解于10ul含有30mMNaAc(pH5.0)，100mM NaCl，1mM ZnAC2和10％甘油的缓冲液中，向其中加入10单位的绿豆核酸酶(Takara Shuzo)并在37℃反应10分钟。反应混合物进行苯酸-氯仿提取，接着乙醇沉淀。然后，用DNA制备平齐末端药盒(Takara Shuzo)使粘性末端变成平齐末端并用DNA连接药盒(Takara Shuzo)连接产生的DNA片段。利用这样得到的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌HB101得到质粒pBSMoSal，如图30所示。根据自动读序药盒(PharmaciaBiotech)附带的方法反应10ug这样得到的质粒，然后用A.L.F.DNA测序仪(Pharmacia Biotech)电泳从而决定碱基序列。结果证明，定位于莫洛尼氏鼠白血病毒终端重复序列启动子/增强子下游的XhoI限制位点已经删除了。
随后，将3ug上面获得的质粒pBSMosal加入到10ul含有10mMTris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶KpnI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，将沉淀溶解于10ul含有10mM Tris-HCl(pH7.5)，50mM Nacl，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶Hind III(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。然后，反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳从而得到大约1ug的一个大约为3.66kb的KpnI-Hind III片段。
然后，用一个自动DNA合成仪(380A，Applied Biosystems)合成分别具有SEQ ID NOS20和21所示的碱基序列的两个合成DNA。然后，将0.3ug得到的合成DNAs加入15ul蒸馏水并在65℃加热5分钟。反应混合物在室温下保留30分钟。在这一溶液中，加入2ul 10x缓冲液[500mMTris-HCl(pH7.6)，100mM MgCl2，50mM DTT]和2ul 10mM ATP。进一步加入10单位的T4聚核苷酸激酶(Takara Shuzo)并在37℃反应30分钟使5’末端磷酸化。然后，0.1ug上面得到的来自质粒pBSMoSal的KpnI-Hind III片段(3.66kb)和0.05ug磷酸化的合成DNAs加入蒸馏水中得到总量为20ul并用Ready-To-Go T4 DNA连接酶(Pharmacia Biotech)连接。用这样得到的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌HB101得到质粒pBSMoSalS，如图31所示。根据自动读序药盒(Pharmacia Biotech)附带的方法反应10ug这样得到的质粒，并用A.L..F.DNA测序仪(Pharmacia Biotech)电泳从而决定碱基序列。结果证明，所需的合成DNA已经被转染了。
随后，10ug公开在kokai No.304 989/93的质粒pChiIg HB2溶解于10ul含有50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM NaCl，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶Eco52I(Toyobo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，将沉淀溶解于10ul含有30mM NaAc(pH5.0)，100mMNaCl，1mM ZnAC2和10％甘油的缓冲液中，向其中加入10单位的绿豆核酸酶(Takara Shuzo)并在37℃反应10分钟。对反应混合物进行苯酸-氯仿提取，接着乙醇沉淀。然后，用DNA制备平齐末端药盒(Takara Shuzo)使粘性末端变成平齐末端。乙醇沉淀之后，沉淀溶解于10ul含有10mMTris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶ApaI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳从而得到大约0.7ug的一个大约为0.99kb的ApaI-平齐末端片段。
然后，将3ug质粒pBluescript SK(一)(Stratagene)加入10ul含有10mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，其中加入10单位的限制酶ApaI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，沉淀加至10ul含有33mM Tris-HCl(pH7.9)，10mM MgAc2，66mMKAc，0.5mM DTT和10ug/ml BSA的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶SmaI(Takara Shuzo)并在30℃反应1小时。对反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳从而得到大约1ug的一个大约为3.0kb的ApaI-SmaI片段。
随后，将0.1ug上面得到的来自质粒pChiIgHB2的ApaI-平齐端片段和0.1ug来自pBluescript SK(一)的ApaI-SmaI片段加入蒸馏水中得到总量为20ul，并用Ready-To-Go T4 DNA连接酶(Pharmacia Bictech)连接。利用这样得到的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌HB101得到质粒pBShCγ1，如图32所示。
随后，将5ug上面得到的质粒pBShCγ1加入到10ul含有10mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶ApaI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，将沉淀溶解于10ul含有10mM Tris-HCl(pH7.5)，50mM NaCl，10mM MgCl2和1mMDTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶SpeI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。然后，反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳从而得到大约1ug的一个大约为1.0kb的ApaI-SpeI片段。
然后，将3ug上面得到的质粒pBSMoSalS加入到10ul含有10mMTris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl21mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶ApaI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，将沉淀溶解于10ul含有10mM Tris-HCl(pH7.5)，50mM NaCl，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶SpeI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。然后，对反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳从而得到大约1ug的一个大约为3.66kb的ApaI-SpeI片段。
然后，将0.1ug上面得到的来自pBShCγl的ApaI-SpeI片段和来自pBSMoSalS的ApaI-speI片段加入到蒸馏水中得到总量为20ul并用Ready-To-Go T4 DNA连接酶(Pharmacia Biotech)连接。用这样得到的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌HB101得到质粒pMohCγl，如图33所示。(6)构建串联表达盒型人属性化抗体表达载体pKANTEX93利用在实施例2的第1节的小部分(1)-(5)中得到的各种质粒，按如下所述构建一个串联表达盒型人属性化抗体表达载体pKANTEX93。
简要地说，将3ug实施例2的第1节的小部分(1)中得到的质粒pBSH-SAEE加入到10ul含有10mM Tris-HCl(pH7.5)，50mM NaCl，10mM MgCl2和1mMDTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶Hind III(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，将沉淀溶解于10ul含有50mMTris-HCl(pH7.5)，100mM NaCl，10mM MgCl2，和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶SalI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。然后，反应混合物进行琼脂凝胶电泳从而得到大约1ug的一个大约为5.42kb的Hind III-SalI片段。
随后，将5ug实施例2的第1节的小部分(1)中得到的质粒pBSK-HAEE加入到10ul含有10mM Tris-HCl(pH7.5)，50mM NaCl，10mM MgCl2和1mMDTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶KpnI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，将沉淀溶解于10ul含有50mMTris-HCl(pH7.5)，100mM NaCl，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶SalI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。然后，对反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳从而得到大约0.8ug的一个大约为1.98kb的含有兔β-球蛋白基因拼接信号，兔β-球蛋白基因多聚(A)信号和SV40早期基因多聚(A)信号的KpnI-HindIII片段。
随后，将5ug实施例2的第1节的小部分(5)中得到的质粒pMohCγ1加入到10ul含有10mM Tris-HCl(pH7.5)，50mM NaCl，10mM MgCl2和1mMDTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶KpnI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，将沉淀溶解于10ul含有50mMTris-HCl(pH7.5)，100mM NaCl，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶SalI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。然后，对反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳从而得到0.8ug的一个大约1.66kb的含有人属性化抗体H链表达单位的KpnI-SalI片段。
随后，将各0.1ug上面得到的来自pBSH-SAEE的Hind III-SalI片段，来自pBSK-HAEE的KpnI-Hind III片段和来自pMohCγ的KpnI-SalI片段加入蒸馏水中得到总量为20ul并用Ready-To-Go T4 DNA连接酶(PharmaciaBioteeh)连接。用这样得到的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌HB101得到质粒pMoγ1SP，如图34所示。
随后，将3ug这样得到的质粒pMoγ1SP加入到10ul含有50mMTis-HCl(pH7.5)，100mM NaCl，10mM MgCl2，和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入各10单位的限制酶SalI(Takara Shuzo)和XhoI并在37℃反应1小时。对反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳从而得到大约1ug的一个大约为9.06kb的SalI-XboI片段。
随后，将5ug实施例2的第1节的部分(1)中得到的质粒pBSK-HAEESal加入到10ul含有10mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶KpnI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，将沉淀溶解于10ul含有50mMTris-HCl(pH7.5)，100mM NaCl，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶SalI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。然后，对反应混合物进行琼脂凝胶电泳从而得到大约0.7ug一个大约为1.37kb的含有兔β-球蛋白基因拼接信号，兔β-球蛋白基因拼接信号多聚(A)信号和SV40早期基因多聚(A)信号的KpnI-SalI片段。
随后，将5ug实施例2的第1节的小部分(4)中得到的质粒pMohCκ加至10ul含有10mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶KpnI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，将沉淀溶解于10ul含有50mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM NaCl，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶XhoI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。然后，对反应混合物进行琼脂凝胶电泳从而得到大约0.7ug一个大约为1.06kb的含有人属性抗体L链表达单位的KpnI-XhoI片段。
随后，将各0.1ug来自上面得到的质粒pMoγ1SP的SalI-XhoI片段，来自pBSK-HAEE Sal的KpnI-SalI片段和来自pMoh Cκ的KpnI-XhoI片段加入蒸馏水中得到总量为20ul，并用Ready-To-Go T4 DNA连接酶(Pharmacia Biotech)连接。利用这样得到的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌HB101得到质粒pMoκγ1SP，如图35所示。
随后，将3ug这样得到的质粒pMoκγ1SP溶解于10ul含有50mMTis-HCl(pH7.5)，100mM NaCl，10mM MgCl2，和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入各10单位的限制酶XhoI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，将沉淀加至10ul含有10mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶SacII(Toyobo)并在37℃反应10分钟使DNA片段部分消化。然后，对反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳从而得到大约0.2ug的一个大约为8.49kb的SacII-XhoI片段。
随后，将3ug实施例2的第1节的小部分(3)中得到的质粒pBSX-SA加至10ul含有10mMTris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入各10单位的限制酶Sac II(Toyobo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，将沉淀溶解于10ul含有50mM Tris-HCl(pH7.5)，100mMNaCl，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶XhoI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。然后，对反应混合物进行琼脂凝胶电泳从而得到大约1ug一个大约为4.25kb的Sac II-XhoI片段。
随后，将各0.1ug上面得到的来自质粒pMoκγlSP的SalI-XhoI片段和来自pBSX-SA的Sac II-XhoI片段加入蒸馏水中得到总量为20ul，并用Ready-To-Go T4 DNA连接酶(Pharmacia Biotech)连接。利用这样得到的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌HB101得到质粒pKANTEX93，如图36所示。
2.分离和分析编码抗人IL-5Rα单位克隆抗体的cDNA。
(1)从产生抗人IL-5Rα单克隆抗体的杂交瘤分离mRNA。
根据药盒附带的说明，利用Fast Track，一个Invitrogen生产的mRNA提取药盒，从每个产生鼠抗人IL-5Rα单克隆抗体KM1257，KM1259和KM1486的杂交瘤细胞系(分别对应于杂交瘤FERM BP-5133，FERM BP-5134和FERM BP-5651)的1×108细胞中分离mRNA。
(2)从产生鼠抗人IL-5Rα单克隆抗体的杂交瘤制备H和L链cDNA文库。
利用cDNA合成药盒(Pharmacia Biotech)和根据药盒附带的说明，从各5ug由实施例2第2节的小部分(1)中的KM1257，KM1259和KM1486得到的mRNA分别合成了在两个末端具有一个EcoRI接头的一个cDNA。大约6ug的各个cDNA溶解于10ul蒸馏水并进行琼脂糖凝胶电泳，从而得到大约各0.1ug的对应于编码IgG型抗体的H链的cDNA的大约1.5kb的cDNA片段和对应于免疫球蛋白的L链的大约为1.0kb的片段。然后，将0.1ug的大约1.5kb cDNA片段或大约1.0kb cDNA片段和1ugλ ZAP II载体(在用EcoRI切割后用小牛肠碱性磷酸酶处理过；Stratagene)溶解于11.5 ul的T4连接酶缓冲液中，向其中加入175单位的T4 DNA连接酶并在12℃温育24小时，接着进一步在室温下温育2小时。通过常规的方法(分子克隆，2.95，冷泉港实验室，1989)利用Giga Pack Gold(Stratagene)，利用4ul各反应混合物，将cDNAs包装进入一个λ噬菌体。用常规的方法(分子克隆，2.95-107，冷泉港实验室，1989)在Giga Pack Gold把产生的λ噬菌体感染到大肠杆菌菌株XL1-Blue(生物技术，5,376(1987)]中，对于每个KM1257，KM1259和KM1486的H链cDNA文库和L链cDNA文库得到4000个噬菌体克隆。
(3)克隆编码产生抗人IL-5Rα单克隆抗体的杂交瘤的H和L链的cDNAs。
用常规的方法(分子克隆，2.12，冷泉港实验室，1989)把实施例2的第2节的小部分(2)中制备的重组噬菌体固定在一个硝酸纤维滤膜上。用ECL直接核酸标记和检测系统标记编码鼠Ig的C区的cDNA{H链是一个来自鼠Cr1cDNA的片段[细胞，18,559(1979)]和L链是一个来自鼠Ck cDNA的片段[细胞，22,197(1980)]}。利用这些标记的cDNA作为探针，筛选重组噬菌体。随后，根据λZAP II载体(Stratagene)附带的说明，噬菌体克隆被质粒pBluescriptSK(一)代替。最后，得到下面的质粒含有一个编码KM1257的H链的cDNA的重组质粒pKM1257H和含有一个编码KM1257的L链的cDNA的重组质粒pKM1257L；含有一个编码KM1259的H链的cDNA的重组质粒pKM1259H和含有一个码KM1259的L链的cDNA的重组质粒pKM1259L；和含有一个编码KM1486的H链的cDNA的重组质粒pKM1486H和含有一个编码KM1486的L链的cDNA的重组质粒pKM1486L。
(4)测定编码抗人IL-5Rα单克隆抗体的H和L链的cDNA的V区的碱基序列。
根据自动读序测序药盒(Pharmacia Biotech)附带的说明和随后用A.L.F.DNA序列仪(Pharmacia Biotech)电泳，通过反应10ug得到的质粒分析实施例2的第2节的小部分(3)中得到的各个编码鼠抗人IL-5Rα单克隆抗体的H和L链的cDNA的V区的碱基序列。根据这样决定的每个cDNA的碱基序列，决定了KM1257，KM1259和KM1486的L和H链的V区的氨基酸序列。SEQ ID NO22显示了KM1257的H链的V区的碱基序列和氨基酸序列；SEQ ID NO23显示了KM1257的L链的V区的碱基序列和氨基酸序列；SEQ ID NO24显示了KM1259的H链的V区的碱基序列和氨基酸序列；SEQ ID NO25显示了KM1259的L链的V区的碱基序列和氨基酸序列，SEQ ID NO26显示了KM11486的HI链的V区的碱基序列和氨基酸序列；SEQ ID NO27显示了KM1486的L链的V区的碱基序列和氨基酸序列。
(5)鉴定抗人IL-5Rα单克隆抗体的H和L链的CDR序列。
通过将上面的氨基酸序列与已知抗体的V区氨基酸序列进行比较(免疫有用的蛋白质的序列，美国健康和人服务部，1991)，从实施例2的第2节的小部分(4)决定的作为单克隆抗体的每个鼠抗人IL-5Rα的H和L链的V区的氨基酸序列鉴定了每个H链的CDR序列和每个L链的CDR序列。SEQ ID NO28，29和30分别显示了KM1257的H链的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。SEQ ID Nos31，32和33分别显示了KM1257的L链的CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列。SEQ ID NOs34，35和36分别显示了KM1259的H链的CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列。SEQ ID NOs37，38和39分别显示了KM1259的L链的CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列，SEQ IDNOs40，41和42分别显示了KM1486的H链的CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列，SEQ ID NOs43，44和45分别显示了KM1486的L链的CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列。
3.制备抗人IL-5Rα人嵌合抗体来源于具有抑制人IL-5的生物学活性的抗人IL-5Rα单克隆抗体KM1259的抗人IL-5Rα人嵌合抗体制备如下。
(1)构建抗人IL-5Rα人嵌合抗体的表达载体pKANTEX1259。
利用实施例2的第1节中构建的人属性化抗体表达载体pKANTEX93和实施例2的第1节中得到的质粒pKM1259H和pKM1259L，如下所述构建一个用于抗人IL-5Rα人嵌合抗体的表达载体，pKANTEX1259简要地说，将3ug人属性化抗体表达载体pKANTEX93加入到10ul含有10mMTris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶ApaI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，将沉淀加至10ul含有50mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM NaCl，10mMMgCl2，1mM DTT，100ug/mlBSA和0.01％Triton X-100的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶NotI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳从而得到大约1ug的一个大约为12.75kb的ApaI-NotI片段。随后，将5ug质粒pKM1259H加入到10ul含有10mMTris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，1mM DTT缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶BanI(Toyobo)并在37℃反应1小时。反应混合物用乙醇沉淀，将沉淀加至10ul含有50mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM NaCl，10mM MgCl2，1mMDTT，100ug/mlBSA和0.01％Triton X-100的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶NotI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳从而得到约0.5ug的大约为0.41kb的BanI-NotI片段。
随后，用一个自动DNA合成仪(380A，Applied Biosystems)合成了分别具有SEQ ID NOs46和47所示的碱基序列的两个合成DNAs。然后，将各0.3ug得到的合成DNA加至15ul蒸馏水并在65℃加热5分钟。在反应混合物室温下保留30分钟后，加入2ul 10X缓冲液[500mMTris-HCl(pH7.6)，100mM MgCl2，50mM DTT]和2ul 10mM ATP。进一步加入10单位的T4聚核苷酸激酶并在37℃反应30分钟从而使5’末端磷酸化。
然后，上面得到的0.1ug来自人属性化抗体表达载体pKANTEX93的ApaI-NotI片段，0.1ug来自质粒pKM1259H的BanI-NotI片段和0.05ug磷酸化合成DNA加至蒸馏水中得到总量为20ul并用Ready-To-Go T4 DNA连接酶(Pharmacia Biotech)连接。用这样得到的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌HB101得到质粒pKANTEX1259H，如图37所示。
随后，将3ug这样得到的质粒pKANTEX1259H加至10ul含有50mMTris-HCl(pH7.5)，100mM NaCl，10mM MgCl2，和100ug/ml BSA的缓冲液中，向其中加入各10单位的限制酶EcoRI(Takara Shuzo)和SplI(TakaraShuzo)并在37℃反应1小时。反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳从而得到大约1ug的一个大约为13.20kb的EcoRI-SplI片段。
随后，将5ug质粒pKM1259L加至10ul含有10mM Tis-HCl(pH7.5)，100mMNaCl，10mM MgCl2，和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入各10单位的限制酶Ava II(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，沉淀加至10ul含有50mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM NaCl，10mM MgCl2，1mM DTT的缓冲液中，向其中加入各10单位的限制酶EcoR I(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳从而得到大约0.5ug的一个大约为0.38kb的Ava II-EcoRI片段。
随后，用一个自动DNA合成仪(380A，Applied Biosystems)合成了分别具有SEQ ID NOs48和49所示的碱基序列的两个合成DNA。然后，将各0.3ug得到的合成DNA加至15ul蒸馏水中并在65℃加热5分钟，在反应混合物室温下保留30分钟之后，加入2ul 10X缓冲液[50mMTris-HCl(pH7.6)，100mM MgCl2，50mM DTT)和2ul 10mM ATP，进一步加入10单位的T4聚核苷酸激酶并在37℃反应30分钟从而使5’末端磷酸化。
然后，将上面得到的0.1ug来自质粒pKANTEX1259H的EcoRI-SplI片段，0.1ug来自质粒pKM1259L的Ava II-EcoRI片段和0.05ug磷酸化合成DNA加至蒸馏水中得到总量为20ul并用Ready-To-Go T4 DNA连接酶(Pharmacia Biorech)连接。用这样得到的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌HB101得到质粒pKANTEX1259，如图38所示。
(2)利用pKANTEX1259在大鼠骨髓瘤YB2/0细胞(ATCC CRL1581)中表达抗人IL-5Rα人嵌合抗体。
根据Miyaji et.al的方法，通过电击穿[细胞工程技术，3，133，(1990)]把抗人IL-5α人嵌合抗体表达载体pKANTEX1259转染进入YB2/0细胞。
简要地说将4ug实施例2的第3节的小部分(1)中得到的质粒pKANTEX1259转染至4×106YB2/0细胞，然后，将RPMI1640-FCS(10)分配到一个96孔的微量滴定平板(200ul/孔)。在一个5％CO2的温育箱中，在37℃培养细胞24小时。然后，加入Geneticin(下文中称为“G418”；Gibco)得到浓度为0.5mg/ml，再培养细胞1-2星期。从孔中收集培养上清液，它们随着具有G418抗性的转化体克隆出现已经变为融合了。通过下面所述的ELISA方法1或2决定了上清液中抗人IL-5Rα人嵌合抗体的活性。ELISA方法1用PBS将从实施例1的第1节的小部分(10)中的昆虫细胞培养上清液中得到的shIL-5Rα-Fc稀释至浓度为5ug/ml或更小。将稀释液分配到一个96孔的EIA平板(Greiner)(50ul/孔)，保存于4℃过夜使蛋白质被吸收。在洗涤平板之后，以100ul/孔的量将含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS(1％BSA-PBS)加入到平板中并在室温下反应1小时封闭剩下的活性基团。在滗去1％BSA-PBS之后，以25ul/孔的量将浓度为40ug/ml的来自转化体或各种纯化的抗人IL-5Rα抗体的培养上清液加入到平板中。进一步以25ul/孔的量将实施例1第3节中制备的生物素标记人IL-5(0.4ug/ml)加入到平板中并在室温反应4小时。在用0.05％吐温-pBS洗涤之后，以50ul/孔的量将用1％BSA-PBS稀释4000倍的过氧化物酶标记的抗生物蛋白D(Nippon Reizo)加入到平板中并在室温下反应1小时。在用0.05％吐温-PBS洗涤之后，以50ul/孔加入一个ABTS底物溶液[通过在1升0.1M柠檬酸缓冲液(pH4.2)中溶解550mg的2.2’azinobis(3-乙苯噻唑-6-磺酸)二铵并在使用之前立即加入1ul/ml过氧化氢制备的]来显示颜色。然后，测量415mm处的光吸收值(OD)。把缺少抗体时的吸收值作为零抑制百分数，通过下面的公式计算抗体生物素标记IL-5的抑制百分数来估计每个样品。

其中A存在抗体时的OD值B没有抗体时的OD值C没有生物素标记人IL-5时的OD值ELISA方法2用PBS稀释将从实施例1的第1节的小部分(10)的昆虫细胞培养上清液中得到的shIL-5Rα稀释到2ug/ml的浓度或更少。将该稀释液加入到一个96孔的EIA平板(Greiner)(50ul/孔)，保留在4℃过夜使蛋白质被吸收，在洗涤平板之后，以100ul/孔的量将含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS(1％BSA-PBS)加入到平板中并在室温下反应1小时从而封闭剩余的活性基因。在滗去1％BSA-PBS之后，以50ul/孔的量将浓度为50ug/ml的来自转化体或各种纯化抗人IL-5Rα抗体的培养上清液加入到平板中并在室温下反应2小时。在用0.05％吐温-PBS洗涤之后，以50ul/孔的量将用1％BSA-PBS稀释500倍的过氧化物酶标记的抗人IgG抗体(American Qualex International，Inc.)加入到平板中并在室温下反应1小时。在用0.05％吐温-PBS洗涤之后，以50ul/孔的量加入ABTS底物溶液[通过在1升0.1M柠檬酸缓冲液(pH4.2)中溶解550mg2.2’azinobis(3-乙苯基噻唑-6-磺酸)二铵，在使用之前马上加入1ul/ml过氧化氢制备得到)来显示颜色。然后，测量415nm处的吸收值(OD)。
把那些其中在它们的培养上清液中观察到抗人IL-5Rα人嵌合抗体活性的转化体悬于含有0.5mg/mlG418和50nm MTX(Sigma)的RPMI1640-FCS(10)培养基中，并在一个5％CO2温育箱中在37℃培养1-2星期，从而诱导具有对50nM MTX具抗性的转化体。当转化体在孔中变得融合时，用上面叙述的一个ELISA方法测定上清液中抗人IL-5Rα人嵌合抗体的活性，以同样于上面叙述的方法进一步培养观察到活性的那些转化体，其中MTX浓度增加到100nM和200nM，从而得到能够生长在含有0.5mg/mlG418和200nM MTX的RPMI1640-FCS(10)培养基并产生一个抗人IL-5Rα人嵌合抗体的转化体。通过应用有限稀释方法对这样得到的转化体进行克隆从而得到最后产生抗人IL-5Rα人嵌合抗体的转化体。作为产生抗人IL-5Rα人嵌合抗体的转化体的一个特殊例子，可以给出KM1399(FERM BP-5650)。这一菌株产生的抗人IL-5Rα人嵌合抗体命名为KM1399。转化体KM1399以登记号FERM BP-5650在1996年9月3日寄存于工业科学和技术部，国家生物科学和人技术研究所。在转化体克隆KM1399中的抗人IL-5Rα人嵌合抗体KM1399的生产力大约为5ug/106细胞/24小时。
(3)从培养上清液中纯化抗人IL-5Rα人嵌合抗体KM1399把实施例2的第3节的小部分(2)中得到的抗人IL-5Rα人嵌合抗体KM1399悬于含有0.5mg/mlG418和200mM MTX的GIT培养基中(NipponPharmaceuticals)得到浓度为1-2×105细胞/ml，并以200ml部分分配进175cm2的烧瓶(Greiner)中。在一个5％CO2的温育箱中在37℃培养细胞5-7天，当每个烧瓶中变得融合时收集培养上清液。利用一个ProcepA(Bioprocessing)柱，从大约1.0升培养上清液中，得到3ug纯化的抗人IL-5Rα人嵌合抗体KM1399。根据已知的方法[自然学，227，680(1970)]，将大约4ug的纯化抗人IL-5Rα人嵌合抗体KM1399电泳进行分子量分析。结果显示如图39。正如从图39中可见，在还原条件下，抗体H链的分子量大约为50kDa和抗体L链的分子量为25kDa。从而证实了具正确分子量的H和L链的表达。另一方面，在非还原条件下，抗人IL-5Rα人嵌合抗体KM1399的分子量大约为140kDa。所以，证实了正确分子量的包括两个H链和两个L链的一个人嵌合抗体的表达。进一步，通过自动Edman方法用一个蛋白质序列分析仪(470A，Applied Biosystems)分析了纯化的抗人IL-5Rα人嵌合抗体KM1399的H和L链的N末端氨基酸序列。结果，得到了所期望的正确的氨基酸序列。
(4)抗人IL-5Rα的人嵌合抗体KM1399与人IL-5Rα的反应性(ELISA方法1)。
通过实施例2的第3节的小部分(2)中叙述的ELISA方法1测定了抗人IL-5Rα鼠抗体KM1259和抗人IL-5Rα人嵌合抗体KM1399与人IL-5Rα的反应性。结果显示如图40。正如从图40可见，与抗人IL-5Rα鼠抗体KM1259反应性比较，抗人IL-5Rα人嵌合抗体KM1399证明具有一个强烈的人IL-5Rα的反应性，相当于抗人IL-5Rα鼠抗体KM1259的反应性。
4.在COS-7细胞(ATCC CRL1651)中抗人IL-5Rα人嵌合抗体的瞬时表达。
为了更快地估计有待后来叙述的各种类型的抗人IL-5Rα人CDR-移植的抗体的活性，利用pKANTEX1259及其一个修饰载体通过lipofectamine方法如下检测的COS-7细胞中抗人IL-5Rα人嵌合抗体的瞬时表达。
(1)构建一个提高的pKANTEX1259载体。
由于在动物细胞中一个基因的瞬时表达效率依赖于其中被转染表达载体的拷贝数，假定一个更小的表达载体将导致一个更好的表达效率。所以，通过删去pKANTEX1259的一些区域，这被确信不影响一个抗体的表达，一个更小的抗人IL-5Rα人嵌合抗体表达载体，pT1259构建如下。
简要地说，将3ug质粒pKANTEX1259加至10ul含有10mMTris-HCl(pH7.5)，50mM NaCl，10mM MgCl2和1mMDTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶Hind III(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，将沉淀加入10ul含有50mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM NaCl，10mMMgCl2和1mMDTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶MluI(TakaraShuzo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，用DNA制备平齐末端药盒(Takara Shuzo)使限制酶消化产生的5’末端。反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳从而得到大约1ug的一个大约为9.60kb的DNA片段。然后，将0.1ug得到的DNA片段加入蒸馏水中得到总量为20ul并用Ready-To-GoT4 DNA连接酶(Pharmacia Biotech)连接。用这样得到的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌HB101从而得到质粒pT1259，如图41所示。(2)利用pT1259瞬时表达抗人IL-5Rα人嵌合抗体。
将浓度为1×105细胞/ml的COS-7细胞分配到一个96孔平板(2ml/孔)并37℃培养过夜。在100ul OPTI-MEM(Gibco)中加入2ug pT1259，接着加一个通过在100ul OPTI-MEM培养基(Gibco)中加入10ulLipofectamine试剂(Gibco)得到的溶液。得到的混合物在室温下反应40分钟从而形成DNA-微脂粒复合体。用2ml OPTI-MEM培养基(Gibco)洗上面叙述的COS-7细胞2次，又加入含有DNA-微脂粒复合体的溶液。然后，在37℃培养细胞7小时。在除去培养液后，加入2ml含有10％FCS的DMEM培养基(Gibco)并在37℃培养细胞。在从培养开始72小时，收集培养上清液，用实施例2的第3节的小部分(2)中叙述的ELISA方法1估计培养上清液中抗人IL-5Rα人嵌合抗体的活性。如图42所示，在COS-7细胞的培养上清液中观察到依赖浓度的活性，其中COS-7细胞转染了pT1259。所以，证实了一个抗人IL-5Rα人嵌合抗体的表达。从这些结果，显示了有可能通过制备一个改良的小型载体pKANTEX93，然后把这个载体转染进COS-7细胞，估计在一个瞬时表达系统中起源于各种表达载体的人属性化抗体的活性。进一步，为了正确比较有待后来叙述的各种抗人IL-5Rα的人CDR-移植的抗体的活性，通过下面的部分4的小部分(3)叙述的ELISA方法测定了培养上清液中由瞬时表达形成的抗体的浓度。(3)通过ELISA测定瞬时表达培养上清液中人属性化抗体浓度在一个96孔微量滴定平板中分配一种通过用PBS将山羊抗人IgG(γ-链)抗体(药学和生物学研究所)稀释400倍得到的溶液(50ul/孔)在4℃反应过夜。在除去抗体溶液之后，加入100ul/孔的1％的BSA-PBS并在37℃反应1小时从而封闭剩余的活性基团。在滗去1％BSA-PBS之后，加入50ul/孔的瞬时表达培养上清液或纯化的抗人IL-5Rα人嵌合抗体KM1399并在室温反应1小时。反应之后，除去混合物，用0.05％吐温-PBS洗涤平板，然后，在平板中加入50ul/孔的通过用10％BSA-PBS稀释的过氧化物酶标记的鼠抗人κL链抗体(Zymed)500倍得到的溶液并在室温下反应1小时。在用0.05％的吐温-PBS洗涤之后，加入50ul/孔的ABTS底物溶液[通过在1升0.1M的柠檬酸缓冲液(PH4.2)中溶解550mg 2.2-azinobis(3-乙苯基噻唑-6-磺酸)二铵并在使用之前马上加入1ul/ml的过氧化氢得到]来显示颜色。然后，测定415nm处吸收值OD。
5.制备一个抗人IL-5Rα的人CDR-移植抗体。
如下所述制备一个抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体；该抗体具有一个可与鼠抗人IL-5Rα单克隆抗体KM1259和抗人IL-5Rα人嵌合抗体KM1399相当的活性，这两种抗体具有抑制人IL-5的生物学活性的活性。
(1)根据已知的人抗体的VH的同感序列构建一个编码一个抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体的VH的cDNAKabat et al(免疫学有用的蛋白质的序列，美国健康和人服务部，1991)根据FR序列的同源性把各种已知人抗体VH分成I-III亚类(HSG I-III)并鉴定了每个亚类的同感序列。所以，本发明人决定根据这些同感序列设计一个抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体VH的一个氨基酸序列。首先，为了筛选一个用作基础的同感序列，检测了每个亚类的鼠抗人IL-5Rα单克隆抗体KM1259的VH的FR序列和每个亚类的人抗体VH的同感序列的FR序列的同源性(表1)。
表1鼠KM1259VH的FR序列和每个亚类的人抗体VH的同感序列的FR序列的同源性(％)HSG IHSG II HSG III72.1 50.6 55.2结果证明鼠KM1259VH对FR序列中的亚类I有最高同源性。所以，根据亚类I的同感序列设计了一个抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体VH的氨基酸序列，并且利用PCR，如下所述构建一个编码上面的氨基酸序列的cDNA。
简要地说，用一个自动DNA合成仪(380A，Applied Biosytems)合成分别具有SEQ ID NOS50-55所示的碱基序列的6个合成DNA。各个合成DNA加入50ul含有10mMTris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，1.5mM Mgcl2，0.001％明胶，200uMdNTP，0.5uM M13引物RV(Takara Shuzo)，0.5uM M13引物M4(Takara Shuzo)和2单位的TakaRa Taq DNA聚合酶(TakaraShnco)得到最后浓度为0.1uM。然后，用50ul无机油覆盖得到的混合物并置于一个DNA热循环仪(PJ480，Pekin Elmer)。然后，通过30个循环进行PCR，每个循环包括94℃2分钟，55℃2分钟和72℃2分钟，用乙醇沉淀反应混合物，沉淀溶解于20ul TE缓冲液中。以后，反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳从而得到大约0.2ug的一个大约为0.48kb的扩增片段。
随后，将3ug质粒pBluescript Sk(-)(Strategene)加入10ul含有33mM Tris-HCl(PH7.9)，10mM MgAc2，66mM KAc，0.5mM DTT和100ug/mlBSA的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶Sma I(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。反应混合物用乙醇沉淀，将沉淀加至20ul含有50mMTris-HCl(pH9.0)，1mM MgCl2，的缓冲液中，向其中加入1单位的碱性磷酸酶(大肠杆菌C75，Takara Shuzo)并在37℃反应1小时，从而使5′未端去磷酸。然后，反应混合物进行苯酚一氯仿提取，接着乙醇沉淀，沉淀溶解于20ul TE缓冲液中。
随后，将0.1ug通过PCR得到的扩增片段和0.1ug来自pBluescriptSK(-)的Sma I片段加入蒸馏水中得到总量为20ul并用Reacdy-To-Go T4DNA连接酶(Pharmacia Biotech)连接。用这样得到的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌HB101。从10个转化体克隆中，分别制备了质粒DNA并测定了其碱基序列。结果，得到了包括一个编码所需的一个抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体VH的氨基酸序列的cDNA显示在图43的质粒phKM1259HVO。phKM1259HVO(下文中称为“HV.0”)包含的抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体VH的碱基序列和氨基酸序列显示在SEQ ID NO56。
(2)根据已知人抗体VL的同感序列构建一个编码抗人IL-5αX人CDR-移植抗体的VL的cDNA根据FR序列的同源性Kabatetal把各种已知人抗体VL分类成I-IV亚类(HSG I-IV)并鉴定了每个亚类的同感序列。所以，本发明人决定根据这些同感序列设计一个抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体VL的一个氨基酸序列。首先，为了选择一个用作基础的同感序列，检测了鼠抗人IL-5Rα单克隆抗体KM1259的VL的FR序列和每亚类的人抗体VL的同感序列的FR序列之间的同源性(表2)表2
鼠KM1259VL的FR序列和每个亚类的人抗体VL的同感序列的FR序列的同源性(％)HSG I HSGII HSGIII HSGIV73.857.560.0 65.0结果证明，鼠KM1259VL在FR序列中对亚类I有最高的同源性。所以，根据亚类I的同感序列设计了一个抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体VL的氨基酸序列，并利用PCR如下构建了一个编码上面氨基酸序列的cDNA。
简要的说，用一个自动DNA合成仪(380A，Applied Biosystems)合成了分别具有SEQ ID No57-62显示的碱基序列的6个合成DNA。各个合成DNA加入50ul含有10mM Tris-Hcl(pH8.3)，50mM KCl，1.5mM MgCl2，0.001％明胶，200uM dNTP，0.5uM M13引物RV(Takara Shuzo)，0.5uM M13引物M4(Takara Shuzo)和2单位TaKaRa Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)得到最后浓度为0.1uM。然后，用50ul无机油覆盖得到的混合物并进入一个DNA热循环仪(PT480；Perkin Elmer)。然后，经30次循环进行PCR，每个循环包括94℃2分钟，55℃2分钟和72℃2分钟。乙醇沉淀反应混合物，将沉淀溶解于20ul TE缓冲液中，以后，溶液进行琼脂糖凝胶电泳从而得到大约0.2ug的一个大约为0.43kb的扩增片段。
随后，将0.1ug上面经PCR得到的扩增片段和0.1ug来自实施例2第5节的小部分(1)中得到的pBluescript SK(一)的SmaI片段加入蒸馏水中得到总量为20ml并用Ready-To-Go T4 DNA连接酶(Pharmac ia Biotech)连接。用这样得到的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌HBlol。从10个转化克隆中，分别制备了质粒DNA并决定了其碱基序列。结果，得到了含有编码所需的抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体VL的氨基酸序列的cDNA，如图44所示的质粒phKm1259LVO。phKm1259LVO(下文中称为“LV.O”)包含的抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体VL的氨基酸序列和碱基序列显示在SEQ IDNO63。
(3)根据已知人抗体V区的同感序列，构建抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体的表达载体pKANTEX1259HVOLVO。
利用实施例2的部分1中得到的人属性化抗体表达载体pKANTEX93，实施例2第5节的小部分(1)中得到的质粒phKM1259HVO和实施例2部分的小部分(2)中得到的质粒phKM1259LVO按如下所述构建一个抗人IL-5Rα人COR-移植抗体表达载体，pKANTEX1259HVOLVO。
简要地说，将5ug质粒pKMh1259HVO加入10ul含有10mMTris-Hcl(PH7.5)，10mMMgCl2和1mMDTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶ApaI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，沉淀加至10ul含有50mM Tris-Hcl(PH7.5)，100mM Nacl，10mM MgCl2，1mMDTT，100ug/ml BSA和0.01％Tritonx-100的缓冲液中，其中加入10单位的限制酶NotI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时，反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳从而得到大约0.5ug的一个大约为0.44kb的ApaI-Not I片段。
随后，将0.1ug实施例2第3节的小部分(1)中得到的来自人属性化抗体表达载体pkANTEX93的ApaI-NotI片段和0.1ug上面得到的来自质粒phkM1259HVD的ApaI-NotI片段加入蒸馏水中得到总量为20ul并用Ready-To-Go T4DNA连接酶(Pharmacia Biotech)连接。用这样得到的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌HB101从而得到质粒pKANTEX1259HVO，如图45所示。
随后，将3ug这样得到的质粒pKANTEX1259HVO加入10ul含有50mMTris-Hcl(PH7.5)，100mMNacl，10mM MgCl2，1mM DTT和100ug/ml BSA的缓冲的液中，向其中加入各10单位的限制酶EcoRI(Takara Shuzo)和限制酶SplI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳从而得到大约1ug的一个大约为13.20kb的EcoRI-SplI片段。
随后，将5ug质粒phKM1259LVO加入10ul含有50mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM NaCl，10mM MgCl2，1mM DTT和100ug/ml BSA的缓冲液中，向其中加入各10单位的限制酶EcoRI(Takara Shuzo)和限制酶SplI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳从而得到大约0.5ug的一个大约为0.39kb的EcoRI-SplI片段。
然后，将0.1ug上面得到的来自质粒pKANTEX1259HVO的EcoRI-SplI片段和0.1ug上面得到的来自质粒phKM1259LVO的EcoRI-SplI片段加入蒸馏水中得到总量为20ul并用Ready-To-Go T4 DNA连接酶(PharmaciaBiotech)连接。用这样得到的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌HB101从而得到质粒pKANTEX1259HVOLVO，如图46所示。
(4)利用pKANTEX1259HVOLVO根据已知人抗体V区的同感序列在鼠骨髓瘤YB2/0细胞(ATCC CRL1581)中表达一个抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体。
利用pKANTEX1259HVOLVO根据实施例2第3节的小部分(2)中叙述的方法在已知人抗体V区的同感序列的基础上在鼠骨髓瘤YB2/0细胞(ATCCCRL1581)中进行一个抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体的表达。
结果，在已知人抗体V区的同感序列的基础上，作为产生一个抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体的一个转化体得到KM8397。该菌株产生的抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体命名为KM8397。在转化体KM8397中抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体KM8397的生产力为大约4ug/106细胞/24小时。
(5)从培养上清液中纯化抗体IL-5Rα人CDR-移植抗体KM8397。
根据实施例2第3节的小部分(3)中叙述的方法培养实施例2第5节的小部分(4)中得到的产生抗人lL-5RX人CDR-移植抗体的克隆KM8397并纯化从而得到约2mgKM8397。为了检测分子量根据实施例2第3节的小部分(3)叙述的方法将约4ug纯化的抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体KM8397。结果表示如图47。还如图47所示，在还原条件下，抗体H链的分子量约为50KDa，抗体L链分子量约为25KDa。所以证实了正确分子量的H和L链的表达。另一方面，在非还原条件下，抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体KM8397的分子量约为140KDa。所以证实了具有正确分子量的含有两条H链和两条L链的一个人CDR-移植抗体的表达。进一步，通过自动Edman方法用一个蛋白质序列仪(470A，Applied Bio Systems)分析了纯化的抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体KM8397的H和L链的N未端的氨基酸序列。结果得到了所期望的正确的氨基酸序列。
(6)抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体KM8397与人IL-5Rα的反应性(ELISA方法2)通过实施例2的第3节的小部分(2)中叙述的ELISA方法2测定了抗人IL-5Rα人嵌合抗体KM1399和抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体KM8397与人IL-5Rα的反应性。结果表示在图48。正如图48所示，抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体KM8397与人IL-5Rα的反应性显示约为抗人IL-5Rα人嵌合抗体KM1399的一半。
6.通过修饰抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体KM8397的V区的氨基酸序列提高活性。
抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体KM8397与人IL-5Rα的反应性下降到大约为抗人IL-5Rα人嵌合抗体KM1399的一半。所以通过下面叙述的方法经过修饰V的氨基酸序列可提高KM8397的活性。
(1)修饰抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体KM8397的VH的氨基酸序列。
通过突变使显示在SEQ ID NO56中的抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体KM8397的VH的氨基酸突变，制备了抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体VH的各种修饰类型。参考一个抗人IL-5Rα鼠抗体KM1259的V区的计算机化的三维结构模型任意选择待突变的氨基酸。作为转染突变的方法，利用用于突变的引物通过进行实施例2第5节的小部分(1)中叙述的过程得到包含编码一个IL-5Rα人CDR-移植抗体的所需的VH的一个修饰类型的cDNA的一个质粒。
事实上，利用显示在SEQ ID NO64的序列作为用于突变的一个引物和利用分别具有SEQ ID NOs50，51，52，53，54和55的碱基序列的合成DNA通过进行实施例2第5节小部分(1〕中叙述的过程得到包含一个编码显示在SEQ ID NO65的抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体的VH的修饰类型1(下文中称为“HV.1”)的cDNA的一个质粒，phKM1259HV1。在HV.1的氨基酸序列中，定位于SEQ ID NO56的FR的位置95的酪氨酸和位置97的丙氨酸分别被亮氨酸和甘氨酸取代，亮氨酸和甘氨酸是在鼠抗体KM1259H链的V区发现的氨基酸，这是为了保留与鼠抗体和人嵌合抗体中认可的人IL-5Rα的反应性。
进一步，利用SEQ ID NOs64，66和67显示的序列作为突变用引物和利用分别具有SEQ ID NOs50，51，66，67，64和55的碱基序列的合成DNA通过进行实施例2第5节的小部分(1)中叙述的过程得到一个包含编码SEQ ID NO68表示的抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体的VH的修饰类型2(下文中称为“HV.2”)的一个cDNA的质粒，phKM1259HV2。在HV.2的氨基酸序列中，定位于SEQ ID NO56的FR的位置46的谷氨酸，位置74的苏氨酸，位置95的酪氨酸和位置97的丙氨酸分别被丙氨酸，精氨酸，亮氨酸和甘氨酸取代。后四个氨基酸是在鼠抗体KM1259H链的V区发现的氨基酸，这是为了保留与鼠抗体和人嵌合抗体中认可的人IL-5Rα的反应性。
进一步，利用SEQ ID NOs69，70和71显示的序列作为突变用的引物和利用分别具有SEQ ID NOs50，51，69，70，71和55的碱基序列的合成DNA通过进行实施例2部分第5节的小部分(1)中叙述的过程得到一个包含编码显示在SEQ ID NO72的抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体的VH的修饰类型3(下文中称为“VH.3”)的一个cDNA的质粒，phKM1259HV3。在HV.3的氨基酸序列中，定位于SEQ ID NO56的FR的位置40的丙氨酸，位置46的谷氨酸，位置67的精氨酸，位置72的丙氨酸，位置74的苏氨酸，位置79的丙氨酸，位置95的酪氨酸和位置97的丙氨酸分别被精氨酸，丙氨酸，赖氨酸，丝氨酸，精氨酸，缬氨酸，亮氨酸和甘氨酸取代，后面这些在氨基酸是在鼠抗体KM1259H链的V区中发现的氨基酸，这是为了保留与鼠抗体和人嵌合抗体中认可的IL-5Rα的反应性。
由于类型从HV.0到HV.4一个比一个提高，起源于参与修饰的氨基酸的单克隆抗体的数目随着类型数目从HV.0到HV.3增加而增加。
(2)修饰抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体KM8397的VL的氨基酸序列。
通过突变显示在SEQ ID NO63的抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体KM8397的VL的基酸，制备了抗IL-5Rα人CDR-移植抗体的VL的各种修饰类型。参考一个抗人IL-5Rα抗体KM1259的V区的计算机3维空间结构模型任意选择待突变的氨基酸。作为转染一个突变的方法，利用用于突变的引物通过进行实施例2第5节的小部分(1)中叙述的过程得到一个包含编码一个抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体的所需的VL的修饰类型的一个cDNA的质粒。
事实上，利用SEQ ID NO73，74和75所示的序列作为突变用引物和利用分别具有SEQ ID NOs57，58，73，74，61和75的碱基序列的合成DNA通过进行实施例2的第5节的小部分(1)中叙述的过程得到一个包含编码SEQ ID NO76所示的抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体的VL的修饰类型(下文中称为“VL.1”)的一个cDNA的质粒，phKM1259LV1。在LV.1的氨基酸序列中，定位于SEQ ID NO63的FR的位置37的谷氨酰胺，位置45的赖氨酸和位置98的苯丙氨酸分别被精氨酸，谷氨酸和缬氨酸取代。后面这些氨基酸是在单克隆抗体KM1259L链的V区发现的氨基酸，这是为了保留与单克隆抗体和人嵌合抗体中认可的人IL-5Rα的反应性。
进一步，利用SEQ ID NOs74，75，77和78所示的序列作为突变用引物和利用分别具有SEQ ID NOs57，58，77，74，78和75的碱基序列的合成DNA通过进行实施例2第5节的小部分(1)中叙述的过程得到一个包含编码SEQ ID NO79所示的抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体的VL的修饰类型3(下文中称为“LV.2”的一个cDNA的质粒，phKM1259LV2。在LV.2的氨基酸序列中，定位于SEQ ID NO63的FR的位置22的苏氨酸，位置37的谷氨酰胺，位置45的赖氨酸，位置77的丝氨酸和位置98的苯丙氨酸分别被甘氨酸，精氨酸，谷氨酸，天冬氨酸和缬氨酸所取代。后面这些氨基酸是在单克隆抗体KM1259L链的V区发现的氨基酸，这是为了保留与单克隆抗体和人嵌合抗体中认可的人IL-5Rα的反应性。
进一步，利用SEQ ID NOs74，80，81，82和83所示的序列作为突变用引物和利用分别具有SEQ ID NOs57，80，81，74，82和83的碱基序列的合成DNA通过进行实施例2第5节的小部分(1)中叙述的过程得到一个包含编码SEQ ID NO84所示的抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体的VL的修饰类型3(下文中称为“LV.3”)的一个cDNA的质粒，phKM1259LV3。在LV3的氨基酸序列中，定位于SEQ ID NO63的FR的位置7的丝氨酸，位置8的脯氨酸，位置22的苏氨酸，位置37的谷氨酸胺，位置38的谷氨酰胺，位置45的赖氨酸，位置77的丝氨酸，位置87的酪氨酸和位置98的苯丙氨酸分别被丙氨酸，苏氨酸，甘氨酸，精氨酸，赖氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，苯丙氨酸和缬氨酸替代，后面这些氨基酸是在该单克隆抗体KM1259L链的V区发现的氨基酸，这是为了保留与该单克隆抗体和人嵌合抗体中认可的IL-5Rα的反应性。
进一步，利用SEQ ID NOs80，83，85，86和87所示的序列作为突变用引物和利用分别具有SEQ ID NOs57，80，85，86，74，和83的碱基序列的合成DNA通过进行实施例2第5节的小部分(1)中叙述的过程得到一个包含编码SEQ ID NO88所示的抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体的VL的修饰类型4(下文中称为“LV.4”)的一个cDNA的质粒，phKM1259LV4。在LV4的氨基酸序列中，定位于SEQ ID NO63的FR的位置7的丝氨酸，位置8的脯氨酸，位置22的苏氨酸，位置37的谷氨酸胺，位置38的谷氨酰胺，位置44的脯氨酸，位置45的赖氨酸，位置71的苯丙氨酸，位置77的丝氨酸，位置87的酪氨酸和位置98的苯丙氨酸分别被丙氨酸，苏氨酸，甘氨酸，精氨酸，赖氨酸，缬氨酸，谷氨酸，酪氨酸，天冬氨酸，苯丙氨酸和缬氨酸替代，后面这些氨基酸是在抗体KM1259L链的V区发现的氨基酸，这是为了保留与单克隆抗体和人嵌合抗体中认可的IL-5Rα的反应性。
结果，由于类型从LV.0到LV.4一个到一个地改进，起源于参与修饰的氨基酸的单克隆抗体的数目随着类型数目，从LV.0到LV.4提高而提高。
(3)制备具有V区各种修饰类型的抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体。
利用实施例2的部分1中构建的人属性化抗体表达载体pKANTEX93和实施例2的第5节的小部分(1)和(2)中得到的包含编码抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体的V区的各种修饰类型的cDNA的各种质粒，通过实施例2第5节的小部分(3)中叙述的方法构建表达具有V区的各种修饰类型的抗人IL-5RαCDR-移植抗体的载体。表3表示了用于所构建的表达载体和设计这些表达载体的V区各种修饰类型的联合。表3(略，参见原文P124)在这些表达载体中，通过实施例2第4节的小部分(1)中叙述的方法，一个总共13个载体pKANTEX1259 HVOLVO，pKANTEX1259HV1LV0，pKANTEX1259HV2LV0，pKANTEX1259HVOLV1，pKANTEX1259HV1LV1，pKANTEX1259HV2LV1，pKANTEX1259HVOLV2，pKANTEX1259HV1LV2，pKANTEX1259HV2LV2，pKANTEX1259HVOLV3，pKANTEX1259HV1LV3，pKANTEX1259HV2LV3，和pKANTEX1259HV3LV3修饰成瞬时表达载体。利用这些瞬时表达载体和根据实施例2的第4节的小部分(2)叙述的方法，进行具有V区各种修饰类型的抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体的瞬时表达。作为对照，同时进行抗人IL-5R人嵌合抗体KM1399的瞬时表达。通过实施例2第3节的小部分(2)中叙述的ELISA方法1测定了培养上清液中一个抗体的人IL-5Rα结合活性并且通过实施例2第4节的小部分(3)中叙述的ELISA方法测定了培养上清液中该抗体浓度。利用两种ELISA方法，具有V区各种修饰类型的抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体的活性作为相对值显示如图49，其中人嵌合抗体KM1399的活性当作100。在图49中，用一个VH和VL的联合代表抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体的各种修饰类型。从图49中，由VH认可的一个趋势是随着修饰从HV.0进行到HV.3活性增加。对于VL，认可的一个趋势是在LV.0和LV.3中反应性高但在LV.1和LV.2中低。然后，利用纯化抗体如下所述进行包含LV.0和和各种修饰的VH；LV.3和Hv.0；LV.3和HV.3；和LV4(是LV3的一个进一步修饰类型)和各种修饰的VH的联合的抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体的一个更精确的活性估计。
简要地说，利用10个上面叙述的抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体的表达载体，即pKANTEX1259 HVOLVO，pKANTEX1259HV1LV0，pKANTEX1259HV2LV0，pKANTEX1259HV3LV0，pKANTEX1259HVOLV3，pKANTEX1259HV3LV3，pKANTEX1259HV0LV4，pKANTEX1259HV1LV4，pKANTEX1259HV2LV4，和pKANTEX1259HV3LV4，并根据实施例2的第3节的小部分(2)中叙述的方法，在YB20细胞中表达所需的抗体从而得到产生各种抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体的转化体，生产力为2-4ug/106细胞/24小时。用实施例2第3节的小部分(3)中叙述的方法培养和纯化产生各种抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体的转化体，从而各种抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体各得到1-2mg。用实施例2第3节的小部分(3)中叙述的方法电泳各4ug的各种纯化的抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体以测定他们的分子量。在还原条件下，在每个抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体中；抗体的H链的分子量大约为50kDa，抗体的L链约为25kDa。所以证实了正确分子量的H和L链的表达。在非还原条件下，在每个抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体中，抗体的分子量约为140kDa。所以证实了正确大小的包含两个H链和两个L链的每个人CDR-移植抗体的表达。进一步，通过自动Edman方法用一个蛋白质序列仪(470A，Applied Bio systems)分析了各种纯化抗人IL-5R人CDR-移植抗体的H和L链的N末端氨基酸序列。结果，对于每个这些抗体中获得了期望的正确氨基酸序列。
用实施例2第3节的小部分(2)叙述的ELISA方法2测定上面得到的各种纯化抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体与人IL-5Rα的反应性，结果如图50所示。在图50中，用VH和VL的联合代表抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体的各种修饰类型。正如图50所示，在10个纯化抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体中，HV.3 LV.0和HV.3LV.4证明具有一个与抗人IL-5Rα人嵌合抗体KM1399的反应性，同样强的与人IL-5Rα的反应性。
当将显示一个与抗人IL-5Rα人嵌合抗体KM1399的反应性同样强烈的与人IL-5Rα的反应性的抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体HV.3LV.0和HV.3LV.4的氨基酸序列进行比较时，就VH而言两者具有同样氨基酸序列显示为HV.3，但他们具有不同的氨基酸序列。即LV.0和LV.4。而LV.0是简单地移植CDR到一个人抗体的FR中获得的一个序列，LV.4是为了提高活性转换一个人抗体的FR中的11个氨基酸残基转换成那些在该单克隆抗体中发现的氨基酸残基得到的一个序列。但是，从图50显示的结果来看，氨基酸残基的修饰对真正增加活性的作用不大。根据这些事实，具有一个与抗人IL-5Rα嵌合抗体KM1399的反应性同样强烈的与人IL-5Rα的反应性并且由于来源于该单克隆抗体的氨基酸的代替少而有期望对人是较少的抗原性的HV.3LV.0已经选择为一个抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体。HV.3LV.0被命名为KM8399，产生抗人IL-5RαCDR-移植抗体KM8399的转化体KM8399以登记号FERM BP-5648，在1996年九月3日，寄存于工业科学和技术部，国家生物科学和人技术研究所。
在制备抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体KM8399时，已经考虑了下列事项。正如在制备其它人CDR-移植抗体时可见，抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体KM8397的活性(它是只简单地将抗人IL-5Rα单克隆抗体KM1259的CDR移植进入一个人抗体的FR中获得的)下降至大约为单克隆抗体KM1259的活性的1/2。所以，修饰H和L链的V区的FR内的几个氨基酸成为单克隆抗体KM1259中发现的氨基酸并检测到一个活性的增加。对于VH，活性随着修饰的推进而增加。另一方面，对于VL，小数目的氨基酸的修饰导致活性下降；虽然可以通过增加被修饰氨基酸的数目增加活性，但活性只能上升到不修饰的VL的水平。虽然没有更详细的分析(即X-射线晶体分析)这一事实的原因还不能澄清，一个抗体的VH和VL之间的相互作用可能参与其中并且根据所用的抗体这一作用有变化。由于这些问题，还没有建立有效的制备一个人CDR-移植抗体适用于任何的抗体的方法，还需要如本实施例做的试验和错误。随着这样的试验和错误的积累，可以建立一个更有效的制备人CDR-移植抗体的方法。本实施例显示了第一种成功制备一个抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体的情况并由此提出了有效制备人CDR-移植抗体的建议。
7.制备人抗体IgG4亚类的抗人IL-5Rα人属性化抗体(1)分离和分析一个编码人抗体IgG4亚类的C区(cγ4)的cDNA。
根据附带的说明用Dynabeads(DYNABEADS M-450 Pan-B(CD19)；NipponDyner)和DETACHABEAD(Nippon Dyner)包b被的抗-CD19抗体从来自一个健康志原者的200ml外围血液中分离1.1×107B细胞。然后，根据附带的说明用Quick prep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia Biotech)从分离细胞中得到mRNA。从所有得到的mRNA中，根据附带的说明用Time Saver cDNA合成试剂盒(Pharmacia Biotech)合成cDNA。然后，用所有上面得到的cDNA和作为引物的表示在SEQ ID NOs89和90的合成DNA，他们与编码人抗体Cγ4的一个cDNA的5’和3’端同源，如实施例2第5节小部分(1)中所述进行PCR(核酸研究，14，1789(1986)，已经设计了用于PCR的5’侧和3’侧引物，在它们的5’末端具有限制酶ApaI和BamHI的识别序列，所以得到的cDNA可以容易地插入到一个人属性化抗体表达载体。用QIAquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR后的反应混合物并加至含有10mMTris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2和1mM DTT的10ul缓冲液中，在得到的混合物中加入10单位的限制酶ApaI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，将沉淀加至10ul含有20mM Tris-HCl(pH8.5)，100mMKCl，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶BamHI(Takara Shuzo)并在30℃反应1小时。反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳从而得到大约0.5ug的一个约为1.0kb的ApaI-BamHI片段。
随后，将3ug质粒pBluescriptSK(一)(Strategene)加入10ul含有10mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，和1mMDTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶ApaI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，将沉淀加至10ul含有20mM Tris-HCl(pH8.5)，100mM KCl，10mMMgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶BamHI(TakaraShuzo)并在30℃反应1小时。反应混合物进行琼脂糖胶电泳从而得到约2ug的一个约为3.0kb的ApaI-BamHI片段。
然后，将0.1ug上面得到的PCR-扩增的ApaI-BamHI片段和0.1ug上面得到的来自pBluescript SK(一)的ApaI-BamHI片段加入蒸馏水中得到总量为20ul并用Ready-TO-GO T4DNA连接酶(Pharmacia Biotech)连接。用这样得到的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌HB101。从10个转化体克隆中，制备每个质粒DNA并测定其碱基序列。结果得到图51所示的包含所需的编码人抗体Cγ4的cDNA的质粒pBShCr4。
(2)构建一个人抗体IgG4亚类的抗人IL-5Rα人属性化抗体的表达载体。
利用实施例2第7节的小部分(1)中得到的含有编码人抗体Cγ4的cDNA的质粒pBShCγ4，实施例2的第3节的小部分(1)中得到的抗人IL-5Rα人嵌合抗体KM1399的表达载体PKANTEX1259和实施例2第6节的小部分(3)中得到的抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体KM8399的表达载体pKANTEX1259，HV3LVO按如下叙述构建人抗体IgG4亚类的抗人IL-5Rα人属性化抗体的一个表达载体。
简要地说，将4ug含有编码人抗体Cγ4的一个cDNA的质粒pBSHCγ4加至10ul含有10mM Tris HCl(pH7.5)，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶ApaI(Takara Shuzo)并在37℃反应1小时。乙醇沉淀反应混合物，将沉淀加至10ul含有20mM Tris-HCl(pH8.5)，100mMKCl，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶BamHI(Takara Shuzo)并在30℃反应1小时。反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳从而得到约1ug的一个约为1.0kb的ApaI-BamHI片段。
随后，将各3ug抗人IL-5Rα人型嵌合抗体KM1399的表达载体pKANTEX1259和抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体KM8399的表达载体pKANTEX1259HV3LV0分别加入10ul含有10mMTris-HCl(pH7.5)，10mMMgCl2，1mMDTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶ApaI(TakaraShuzo)并在37℃反应1小时.乙醇沉淀两个反应混合物，将沉淀分别加至10ul含有20mM Tris-HCl(pH8.5)，100mM KCl，10mM MgCl2和1mM DTT的缓冲液中，向其中加入10单位的限制酶BamHI(Takara Shuzo)并在30℃反应1小时.两个反应混合物都进行琼脂糖凝液电泳从而从每个反应混合物中得到约2ug的一个大约为12.59kb的ApaI-BamHI片段.
0.1ug来自质粒pBShCγ4的ApaI-BamHI片段和0.1ug的来自质粒pKANTEX1259的ApaI-BamHI片段的一个组合和0.1ug来自质粒pBShCγ4的ApaI-BamHI片段和0.1ug的来自质粒pKANTEX1259HV3LV0的ApaI-BamHI片段的一个组合分别加入蒸馏水中得到总量为20ul并用Ready-TO-GO T4 DNA连接酶(Pharmacia Biotech)连接。用每个这样得到的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌HB101从而得到用于表达IgG4亚类的一个抗人IL-5Rα人嵌合抗体的表达载体pKANTEX1259γ4和用于表达IgG4亚类的一个抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体的表达载体pKANTEX1259HV3LV0γ4，如图52所示。
(3)在大鼠骨髓瘤YB2/0细胞(ATCC CRL1581)中表达抗人IL-5Rα人属性化抗体。
用实施例2第7节的小部分(2)中得到的用于表达IgG4亚类的一个抗人IL-5Rα人嵌合抗体的表达载体pKANTEX1259γ4和IgG4亚类的一个抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体的表达载体pKANTEX1259HV3LV0γ4通过实施例2第3节的小部分(2)中叙述的方法在YB2/0细胞中进行抗人IL-5Rα人属性化抗体的表达。
结果得到了作为产生IgG4亚类的一个抗人IL-5Rα人嵌合抗体的一个转化体，KM7399(FEKM BP-5649)，这一菌株产生的IgG4亚类的抗人IL-5Rα人嵌合抗体命名为KM7399。产生抗人IL-5Rα人嵌合抗体KM7399的转化体KM7399以登记号FERM BP-5649，在1996年九月3日寄存于工业科学和技术部，国家生物科学和人技术研究所，抗人IL-5Rα人嵌合抗体KM7399在转化体KM7399中的生产力约为3ug/106细胞/24小时。
同样，由于获得了产生IgG4亚类的一个抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体的一个转化体KM9399(FERM BP-5647)并且这一菌株产生的IgG4亚类的抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体命名为KM9399。抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体KM9399在转化体9399中的生产力约为7ug/106细胞/24小时。产生抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体KM9399的转化体KM9399以登记号FERMBP-5647，在1996年9月3日，寄存在工业科学和技术部国家生物科学和人技术研究所。
(4)从培养上清液中纯化人抗体IgG4亚类的抗人IL-5Rα人属性化抗体。
根据实施例2第3节的小部分(3)中叙述的方法培养和纯化实施例2第7节的小部分(3)中得到的产生IgG4亚类的抗人IL-5Rα人嵌合抗体的转化体KM7399和产生IgG4亚类的抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体的转化体KM9399，从而得到约1mg的KM7399和约5mg的KM9399。根据实施例2第3节的小部分(3)中叙述的方法将约各4ug的纯化的IgG4亚类的抗人IL-5Rα人属性化抗体KM7399和KM9399电泳测定它们的分子量。结果表示如图53，正如图53所示，在还原条件下，每个抗体的H链的分子量约为50KDa，每个抗体的L链的分子量约为25KDa。所以，证实了具有正确分子量的H链和L链的表达。在非还原条件下，每个抗人IL-5Rα人属性化抗体的分子量约为140KDa。从而证实了正确大小的包含两条H链和两条L链的一个人CDR-移植抗体的表达。进一步。通过自动Edman方法用一个蛋白质序列仪(470A，Applied Bio Systems)分析了纯化的亚类IgG4的抗人IL-5Rα人属性化抗体KM7399和KM9399的H链和L链的N末端氨基酸序列。结果得到期望的正确氨基酸序列。
(5)人抗体IgG4亚类的抗人IL-5Rα人属性化抗体与人IL-5Rα的反应性(ELISA方法2)。
用实施例2第3节的小部分(2)中叙述的方法测定了人抗体IgGl亚类的抗人IL-5Rα人嵌合抗体KM1399，人抗体IgGl亚类的抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体KM8399，IgG4亚类的抗人IL-5Rα人嵌合抗体KM7399和IgG4亚类的抗人IL-5Rα人CDR-移植抗体KM9399与人IL-5Rα的反应性。结果表示在图54，正如图54所示，人抗体IgG4亚类的抗人IL-5Rα人属性化抗体证明具有与IgG1亚类的抗人IL-5Rα人属性化抗体的反应性同样强烈的与人IL-5Rα的反应性。
实施例31.证明抗-hIL-5Rα抗体的特异性通过下面的免疫细胞染色法证明抗IL-5Rα单克隆抗体和抗-hIL-5Rα人属性化抗体的特异性。
简要地说，将转染一个人IL-5Rα基因进入CTLL-2细胞得到的5×105细胞(ATCC TIB214)(下文中称为“CTLL-2(h5R)”〕[J.Exp.Med.，177，1523(1993)]或作为对照的5×105CTLL-2细胞悬浮于一个免疫细胞染色缓冲液中[含有1％BSA，0.02％EDTA和0.05迭氮化钠的PBS]并分配到一个圆底96-孔平板(100ul/孔)中。在4℃以350xg离心1分钟后，滗去上清液。然后，在每个孔中加入50ug含有10ug/ml的一个hIL-5Rα抗体的免疫细胞染色缓冲液并在4℃反应30分钟。反应之后，加入免疫染色缓冲液(200ul/孔)并在4℃以350xg离心1分钟，然后除去上清液洗细胞。进一步重复洗两次。然后，在每个孔中加入50ul用一个染色缓冲液稀释了30倍的含有FITC标记抗-鼠免疫球蛋白抗或FITC标记抗人免疫球蛋白抗体(两者都由Wako Pure Chemical Industries.Ltd.制造)的免疫细胞染色缓冲液并在4℃反应30分钟。反应之后重复同样的洗操作3次。然后，用一个流式细胞计数器(Coulter)分析细胞。
结果表示在图55，单克隆抗体KM1257，KM1259和KM1486和人属性化抗体KM1399，KM7399，KM8399和KM9399与CTLL-2细胞不反应，但与CTLI-2(h5R)特异性地反应。所以，很清楚，人属性化抗体KM1399，KM7399，KM8399和KM9399特异性识别hIL-5Rα。
2.抗-IL-5Rα抗体抑制IL-5的生物学活性的作用。
由于CTLL-2(h5R)显示了一个依赖人IL-5的增殖应答[J.ExpMed.，177，1523(1993)]，检测了抗-IL-5Rα抗体对CTLL-5(h5R)细胞中依赖人IL-5的细胞增殖的效果。利用细胞计数试剂盒(Dojin ChemicalLaboratory)通过一个显色方法估计了细胞增殖。
简要地说，将1×104CTLL-2(h5R)细胞悬浮于50ul正规培养基中并分配进一个96-孔细胞培养平板。这些细胞与如实施例1第3节叙述的方法制备的25u1/孔的用正规培养基稀释的各种抗-IL-5Rα抗体和25u1/孔的含有0.4ng/ml的人IL-5的正规培养基混合并在37℃，在一个CO2温育箱中培养4小时。然后，在平板中加入10ul/孔的细胞计数试剂盒溶液并且细胞在37℃，在5％CO2的温育箱中再培养4小时。培养完成后，用微孔平板读数器Emax(Molecular Device)测量450nm处的吸光值。用下面的公式计数每个抗体的CTLL-2(h5R)细胞增殖抑制活性。
A-C增殖抑制百分数(％)＝100-----×100B-C其中A存在抗体时的OD值B没有抗体时的OD值C没有人IL-5R时的OD值结果表示在图56，单克隆抗体KM1259，和KM1486和人属性化抗体KM1399，KM7399，KM8399和KM9399抑制CTLL-2(h5R)的依赖人IL-5增殖。但是，这种活性在单克隆抗体KM1257中没有得到认可。
3.人嗜曙红细胞的免疫细胞染色从正规人血液中制常备一部分多形核白细胞并在存在人IL-5时培养3天浓缩嗜曙红细胞。然后用一个流式细胞计数器检测抗-hIL-5Rα单克隆抗体的反应性。
简要地说，分配多形制剂(Nicomed)到8个15ml的聚丙烯离心管(4ml/管)中并且每个铺上6ml加了肝素的正常人血液。然后在室温下以500xg离心30分钟，分离得到多形核白细胞。把多形核白细胞悬于一个正规培养基中得到浓度为1.25×107细胞/10ml并以10ml一部分分配进4个细胞培养盘中。然后，以最后浓度为2ng/ml把人IL-5加入该细胞悬液中并把细胞在37℃，在一个CO2温育箱中培养3天。在培养完成后，离心细胞1.200rpm，5分钟)并悬于免疫细胞染色缓冲液中得到浓度为5×106细胞/ml。然后，将5×105细胞分配进一个圆底96-孔平板。在以350xg在4℃离心平板1分钟后，除去上清液。然后，加入50ul含有10％正规鼠血清的免疫细胞染色缓冲液并在4℃反应30分钟。在缓冲液中以10ug/ml浓度加入用传统的方法[KOSO-KOTAI-HO(酶抗体方法)，Gakusai KikakuCo.，1985]用生物素标记的单克隆抗体KM1259或作为对照的生物素标记抗人粒细胞集落刺激因子单克隆抗体KM341[Agr.Biol，Chem.，53，1095(1989)]。反应之后，在每个孔中加入200ul细胞免疫染色缓冲液并在4℃以350xg离心1分钟，然后除去上清液洗细胞。进一步重复洗两次。然后加入免疫细胞染色缓冲液稀释10倍的藻红蛋白标记的链霉素抗生物素蛋白(Bectn Dickinson)并在4℃反应30分钟。反应后，同样的该操作重复3次。然后，通过面前分散和90分散那些被当作多形核白细胞的细胞用一个流式细胞计数器(Coulter)进行分析。同时，用May-Grunwald-Giemsa染色方法[SENSHOKUHOU NO SUBETE(染色方法的回顾)，Ishiyaku Shuppan Co.，1988]染色同样的细胞并观察多形核白细胞。结果证明75％的细胞是嗜曙h红细胞。
图57显示了得到的矩形图。抗人IL-5Rα单克隆抗体KM1259显示了一个确定的反应性。由于分析的75％的细胞证明是是嗜曙红细胞，证示抗人IL-5Rα单克隆抗体KM1259与嗜曙红细胞具反应性。
4.抗IL-5Rα抗体对人嗜曙红细胞的生存抑制从普通人血液中制备了多形核白细胞组合，并且检测了存在人IL-5时抗人IL-5Rα抗体对嗜曙红细胞的生存的作用。
简要地说，以4ml-部分把多形态制剂(Nicomed)分配进15个15ml的聚丙烯离心管中并且在每个平板中铺8ml加了肝素的正常人血液。然后在室温下以500xg离心管子30分钟分离得到多形核白细胞。
通过加1体积的无菌的1.5M NaCl溶液到9个体积的Percoll溶液(Pharmacia)中制备Percoll贮液。然后，加2个体积的生理盐水到8个体积的Percoll贮液中制备80％Percoll溶液，并加4个体积的生理盐水到6体积的percoll贮液中制备60％的percoll溶液。为了除去伴随的单核细胞，将5ml60％的percoll溶液分配进各两个15ml的聚丙烯离心，铺上悬浮于RPMI1640培养基中的先前得到的多形核白细胞并在室温以500xg离心30分钟，分离得到沉淀的多形核白细胞，进一步，为了除去伴随的红细胞，将各5ml80％的Percoll溶液分配两个15ml聚丙稀离心管，铺上悬于RPMI164培养基中的先前得到的多形核白细胞并在室温以500xg离心30分钟，分离得到悬于Percoll层的单形核白细胞。
随后，以2×106细胞/孔把细胞分配进一个48-孔细胞培养平板并以最后浓度为0.1ng/ml加入人IL-5。进一步，以最后浓度为1ug/ml加入各种抗IL-5R抗体。对于每个抗体。培养2个孔，调整每个孔的溶液到最后量为1ml，在37℃，在一个CO2温育箱中培养细胞3天。完成培养后，从每个孔中收集总细胞悬液总量并离心(3000rpm，1分钟)，得到细胞。将这样得到的细胞悬浮于100ml的PBS，用50ul这种悬浮液，用一个细胞样品制备装置，Cytospin3(Shandon)制备样品。在用May-Grunwald-Giemsa染色方法染色样品后，每个样品观察200个细胞并计算嗜曙红细胞的数目。
结果表示在图58，单克隆抗体KM1259和KM1486和人属性化抗体KM1399，KM7399，KM8399和KM9399都发现有抑制IL-5延长嗜曙红细胞生存时间的活性。但是，这一活性在单克隆抗体KM1257中没有得到认可。
5.用抗-hIL-5Rα抗体检测shIL-5Rα把用PBS稀释到10ug/ml浓度的抗人IL-5Rα单克隆抗体KM1257分配进一个96孔EIA平板(Greiner)(50u.l/孔)并在4℃保留过夜使抗体被吸收。在洗涤之后，加入100u.l/孔的含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS(10％BSA-PBS)，并且在室温下进行反应1小时封闭剩余的活性基团。在滗去1％BSA-PBS后，加入用1％BSA-PBS稀释到1000-0.1ng/ml浓度的实施例1部分1的小部分(9)中得到的纯化的shIL-5Rα并在4℃反应过夜。在用吐温-PBS洗之后，加入(50ul/ml)用1％BSA-PBS稀释的和通过常规方法[KOSO-KOTAI-HO(酶抗体方法)，Gakusai KikakuCo.，1985]用生物素标记的抗人IL-5R单克隆抗体KM1259，并且在室温下反应2小时.在用吐温-PBS洗之后，加入用1％BSA-PBS稀释4000倍的抗生物素蛋白标记的过氧化物酶(Nippon Reizo)(50u.l/孔)并在室温下反应1小时。在用吐温-PBS洗之后，加入ABTS底物溶液(2.2-azinobis(3-乙苯基噻唑-6-索佛那酸)ammoni um]显现颜色，然后，测量415nm处的吸收值OD(NJ2001，Japan Intermed)。
结果表示在图59结果表明，用抗人IL-5Rα单克隆抗体KM1257和生物标记的抗人IL-5R单克隆抗体KM1259可以测量shIL-5Rα。
6.用Western印迹检测shIL-5Rα在含有2-疏基乙醇的SDS-PAGE样品缓冲液或不含2-疏基乙醇的SDS-PAGE样品缓冲液中热变性实施例1部分1的小部分(9)中叙述的shIL-5Rα。在一个商业SDS-PAGE梯度凝胶(Atto)上电泳得到的混合物，然后蛋白质被转移到一个PVDF膜上(Millipore)。为了封闭把PVDF膜浸在含有10％BSA的PBS中并在4℃保留过夜，在完成封闭之后，用含有0.05％吐温PBS的彻底洗膜，然后，在室温下把膜浸在实施例1第5节得到的杂交瘤的培养上清液中2小时并用含有0.05％的吐温PBS彻底洗膜。进一步，在室温下把PVDF膜浸在一个用1％BSA-PBS稀释过氧化酶标记的抗鼠免疫球蛋白(Wako Pure Chemical Industries，(td.)1000倍得到的溶液中1小时，然后用含有0.05％的吐温PBS彻底洗膜，在洗涤溶液被完全除去后，将ECL试剂加到PVFD膜(Amersham)并反应1分钟，在除去多余的试剂后，把膜夹在两个塑料胶片中并放在一个x-射线胶片敏化盒中从而敏化ECL胶片。所以，证实抗体的反应性。
结果表示在图60。KM1257显示反应性。但KM1259，KM1486没有。
7.shIL-5Rα的免疫沉淀将一个用PBS稀释50倍的抗鼠免疫球蛋白抗体(DAKO)分配到一个96孔EIA塑料平板(200ul/孔)并在4℃保留过夜使抗体被吸收。在用PBS洗之后，加入1％BSA-PBS(300ul/孔)并在室温保留1小时进行封闭。在用PBS洗之后，在每个孔中加入各200ul的KM1257，KM1259或KM1486(他们是前面实施例中得到的抗人IL-5Rα单克隆抗体)的培养上清液并在4℃保留过夜使抗体被吸收。在洗平板之后，以50ul的量把实施例1部分1中得到的并用PBS稀释到10ug/ml浓度的shIL-5Rα分配进每个孔中并在4℃反应过夜。在用含有0.05％吐温的PBS洗平板之后，加入5x无2-疏基乙醇的SDS-PAGE样品缓冲液
(50ul/孔)并边振荡边在室温下保留2小时，反应混合物加至200ul的PBS并在一个热块上加热。然后，用一个商品SDS-PAGE梯度胶(Atto)，分离25ul反应混合物，在完成电泳之后，转移蛋白质到一个PVDF膜(Millipore)上。根据实施例3第6节中叙述的方法利用KM1257对PVDF膜进行Western印迹分析，从而检测shIL-5Rα。
结果显示于图61.显然所有KM1257，KM1259和KM1486能免疫沉淀shIL-5Rα。
工业应用性根据本发明，提供了单克隆抗体KM1257，KM1259和KM1486，它们与确信是在人嗜曙红细胞中特异性地表达的人IL-5受体α链特异结合。同时，提供人属性化抗体KM1399，KM8399，KM7399和KM9399，他们与确信在人嗜曙红细胞中特异性表达的人IL-5受体α链特异结合并且能抑制人IL-5的生物学活性。本发明的抗体能用于在免疫细胞染色中免疫学测定人嗜曙红细胞和诊断和治疗由IL-5的生物学活性抑制引起的变态反应性疾病。应该引进特别注意的是本发明的人属性化抗体在抗原性上比单克隆抗体更低并预期在一个长时期内保持他们的效果。
序列表SEQ ID NO1序列长度32序列类型核酸链数单链几何结构线性分子类型其他核酸合成DNA序列描述CAAAGCTTAC CATGATCATC GTGGCGCATG TA32SEQ ID NO2序列长度32序列类型核酸链数单链几何结构线性分子类型其他核酸合成DNA序列描述CAGGATCCCT ACTTACCCAC ATAAATAGGT TG32SEQ ID NO3序列长度27序列类型核酸链数单链几何结构线性分子类型其他核酸合成DNA序列描述CAGATATCTC ACTTCTCCCA CCTGTCA 27SEQ ID NO4序列长度88序列类型核酸链数单链几何结构线性分子类型其他核酸合成DNA序列描述AGCTTCCACC ATGGAGTTTG GGCTCAGCTG GCTTTTTCTT GTCCTTGTTT TCAAAGGTGT 60TCAGTGTGAC TTACTTCCTG ATGAAAAG 88SEQ ID NO5序列长度84序列类型核酸链数单链几何结构线性分子类型其他核酸合成DNA序列描述CTTTTCATCA GGAAGTAAGT CACACTGAAC ACCTTTGAAA ACAAGGACAA GAAAAAGCCA 60GCTGAGCCCA AACTCCATGG TGGA 84SEQ ID NO6序列长度51序列类型核酸链数单链几何结构线性分子类型其他核酸合成DNA序列描述AGCTTCCACC ATGGCTACAG GCTCCCGGAC GTCCCTGCTC CTGGCTTTTG G 51SEQ ID NO7序列长度58序列类型核酸链数单链几何结构线性分子类型其他核酸合成DNA序列描述CCTGCTCTGC CTGCCCTGGC TTCAAGAGGG CAGTGCCGAC TTACTTCCTG ATGAAAAG58SEQ ID NO8序列长度64序列类型核酸链数单链几何结构线性分子类型其他核酸合成DNA序列描述CTTTTCATCA GGAAGTAAGT CGGCACTGCC CTCTTGAAGC CAGGGCAGGC AGAGCAGGCC 60AAAA 64SEQ ID NO9序列长度41序列类型核酸链数单链几何结构线性分子类型其他核酸合成DNA序列描述GCCAGGAGCA GGGACGTCCG GGAGCCTGTA GCCATGGTGG A 41SEQ ID NO10序列长度39序列类型核酸链数单链几何结构线性分子类型其他核酸合成DNA序列描述GGCAGCGGCG GTTCCGGTGA GCCCAAATCT TGTGACAAA39SEQ ID NO11序列长度34序列类型核酸链数单链几何结构线性分子类型其他核酸合成DNA序列描述CAGGATCCCC CGTCGCACTC ATTTACCCGG AGAC 34SEQ ID NO12序列长度34序列类型核酸链数单链几何结构线性分子类型其他核酸合成DNA序列描述CAAAGCTTCC ACCATGGAGT TTGGGCTCAG CTGG 34SEQ ID NO13序列长度39序列类型核酸链数单链几何结构线性分子类型其他核酸合成DNA序列描述ACCGGAACCG CCGCTGCCCT TACCCACATA AATAGGTTG39SEQ ID NO14序列长度34序列类型核酸链数单链几何结构线性分子类型其他核酸合成DNA序列描述CAAAGCTTCC ACCATGGCTA CAGGCTCCCG GACG 34SEQ ID NO15序列长度76序列类型核酸链数双链几何结构线性分子类型其他核酸合成DNA序列描述CGATAAGCTA TGAAAACTAC AGCCTTGGAG GAAGCTTAAA TGAGCTCGAT ATCAAGGCCT 60ACCCGGGCGC CATGCA 76SEQ ID NO16序列长度32序列类型核酸链数单链几何结构线性分子类型其他核酸合成DNA序列描述CACTCAGTGT TAACTGAGGA GCAGGTGAAT TC32SEQ ID NO17序列长度40序列类型核酸链数单链几何结构线性分子类型其他核酸合成DNA序列描述AGCTGAATTC ACCTGCTCCT CAGTTAACAC TGAGTGGTAC40SEQ ID NO18序列长度21序列类型核酸链数单链几何结构线性分子类型其他核酸合成DNA序列描述AATTCGTACG GTGGCTGCAC C 21SEQ ID NO19序列长度17序列类型核酸链数单链几何结构线性分子类型其他核酸合成DNA序列描述GGTGCAGCCA CCGTACG 17SEQ ID NO20序列长度26序列类型核酸链数单链几何结构线性分子类型其他核酸合成DNA序列描述CTCGCGACTA GTGGGCCCGC GGCCGC 26SEQ ID NO21序列长度34序列类型核酸链数单链几何结构线性分子类型其他核酸合成DNA序列描述AGCTGCGGCC GCGGGCCCAC TAGTCGCGAG GTAC34SEQ ID NO22序列长度421序列类型核酸链数双链几何结构线性分子类型cDNA特征名称/关键词sig peptide位置1··57鉴别方法S名称/关键词区域位置148··162鉴别方法S其他信息CDR1名称/关键词区域位置205··255鉴别方法S其他信息CDR2名称/关键词区域位置352··387鉴别方法S其他信息CDR3序列描述ATG AAC TTC GGG CTC AGC TTG ATT TTC CTT GCC CTC ATT TTA AAA GGT48Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly-15 -10 -5GTC CAA TGT GAG GTG CAG TTG GTG GAG TCT GGG GGA GAC TTA GTG AAG 96Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys-1 1 5 10CCT GGA GGG TCC CTG AAA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACT TTC144Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe15 20 25AGT GAC TAT GGC ATG GCT TGG ATT CGC CAA ATT TCA GAC AAG AGG CCG192Ser Asp Tyr Gly Met Ala Trp Ile Arg Gln Ile Ser Asp Lys Arg Pro30 35 40 45GAG TGG GTC GCA GCC ATT AGC AGT GGT GGT AGT TAC ATC CAC TTT CCA240Glu Trp Val Ala Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile His Phe Pro50 55 60GAC AGT TTG AAG GGG CGA TTC ACC GTC TCC AGA GAC 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peptide位置1··60鉴别方法S名称/关键词区域位置130··162鉴别方法S其他信息CDR1名称/关键词区域位置208··228鉴别方法S其他信息CDR2名称/关键词区域位置325··351鉴别方法S其他信息CDR3序列描述ATG ATG TCC TCT GCT CAG TTC CTT GGT CTC CTG TTG CTC TGT TTT CAA 48Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln-20 -15 -10 -5GAT ATC AGA TGT GAT ATC CAG ATG ACA CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT 96Asp Ile Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser-1 1 5 10GCC TCT GTA GGA GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC GGG ACA AGT GAG GAC 144Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gly Thr Ser Glu Asp15 20 25ATT ATC AAT TAT TTA AAC TGG TAT CGG CAG AAA CCA GGG AAA GCC CCT 192Ile Ile Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro30 35 40GAA CTC CTG ATC TAC CAC ACA TCA AGA TTA CAG TCA GGA GTC CCA TCA 240Glu Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser45 50 55 60AGG TTC AGT GGC AGC GGG TCT GGA ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATT AGT 288Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser65 70 75AGT CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCC ACT TAC TAC TGC 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NO81序列长度92序列类型核酸链数单链几何结构线性分子类型其他核酸合成DNA序列描述TAGGAGACAG AGTCACCATC GGTTGCGGGA CAAGTGAGGA CATTATCAAT TATTTAAACT 60GGTATCGGAA GAAACCAGGG AAAGCCCCTG AA92SEQ ID NO82序列长度88序列类型核酸链数单链几何结构线性分子类型其他核酸合成DNA序列描述CAGTGGCAGC GGGTCTGGAA CAGATTTCAC TCTCACCATT AGTGACCTGC AACCTGAAGA 60TTTTGCCACT TACTTTTGCC AACAGGGT 88SEQ ID NO83序列长度91序列类型核酸链数单链几何结构线性分子类型其他核酸合成DNA序列描述GTTTTCCCAG TCACGACCGT ACGTTTTATT TCCACCTTGG TCCCTTGGCC GACCGTGTAC 60GGAAGCGTAT AACCCTGTTG GCAAAAGTAA G 91SEQ ID NO84序列长度382序列类型核酸链数双链几何结构线性分子类型cDNA特征名称/关键词sig peptide位置1··60鉴别方法S名称/关键词区域位置130··162鉴别方法S其他信息CDR1名称/关键词区域位置208··228鉴别方法S其他信息CDR2名称/关键词区域位置325··351鉴别方法S其他信息CDR3序列描述ATG ATG TCC TCT GCT CAG TTC CTT GGT CTC CTG TTG CTC TGT TTT CAA 48Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln-20 -15 -10 -5GAT ATC AGA TGT GAT ATC CAG ATG ACA CAG GCT ACA TCC TCC CTG TCT 96Asp Ile Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ala Thr Ser Ser Leu Ser-1 1 5 10GCC TCT GTA GGA GAC AGA GTC ACC ATC GGT TGC GGG ACA AGT GAG GAC 144Ala Ser Val Gly Asp Arg Val 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Ile Leu His Lys Gly Phe Ser65 70 75Ala Ser Val Arg Thr Ile Leu Gln Asn Asp His Ser Leu Leu Ala80 85 90Ser Ser Trp Ala Ser Ala Glu Leu His Ala Pro Pro Gly Ser Pro95 100 105Gly Thr Ser Val Val Asn Leu Thr Cys Thr Thr Asn Thr Thr Glu110 115 120Asp Asn Tyr Ser Arg Leu Arg Ser Tyr Gln Val Ser Leu His Cys125 130 135Thr Trp Leu Val Gly Thr Asp Ala Pro Glu Asp Thr Gln Tyr Phe140 145 150Leu Tyr Tyr Arg Tyr Gly Ser Trp Thr Glu Glu Cys Gln Glu Tyr155 160 165Ser Lys Asp Thr Leu Gly Arg Asn Ile Ala Cys Trp Phe Pro Arg170 175 180Thr Phe Ile Leu Ser Lys Gly Arg Asp Trp Leu Ala Val Leu Val185 190 195Asn Gly Ser Ser Lys His Ser Ala Ile Arg Pro Phe Asp Gln Leu200 205 210Phe Ala Leu His Ala Ile Asp Gln Ile Asn Pro Pro Leu Asn Val215 220 225Thr Ala Glu Ile Glu Gly Thr Arg Leu Ser Ile Gln Trp Glu Lys230 235 240Pro Val Ser Ala Phe Pro Ile His Cys Phe Asp Tyr Glu Val Lys245 250 255Ile His Asn Thr Arg Asn Gly Tyr Leu Gln Ile Glu Lys Leu Met260 265 270Thr Asn Ala Phe Ile Ser Ile Ile Asp Asp Leu Ser Lys Tyr Asp275 280 285Val Gln Val Arg Ala Ala Val Ser Ser Met Cys Arg Glu Ala Gly290 295 300Leu Trp Ser Glu Trp Ser Gln Pro Ile Tyr Val Gly Lys305 310 31权利要求
1.一种抗体，它特异性地与人白细胞介素-5受体α链反应。
2.根据权利要求1所述的抗体，它选自于单克隆抗体，人属性化的抗体，单链抗体和二硫键稳定的抗体。
3.根据权利要求2所述的抗体，它是单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，它与人白细胞介素-5受体α链的N-末端氨基酸的1-313位抗原决定基结合并且通过免疫细胞染色它特异性地与人白细胞介素-5受体α链反应。
5.根据权利要求3所述的单克隆抗体，它与人白细胞介素-5受体α链的N-末端氨基酸的1-313位抗原决定基结合并且抑制人白细胞介素-5的生物学活性。
6.根据权利要求4所述的单克隆抗体，它属于IgG1亚类，该抗体重链(H链)的可变区(V区)的CDR序列具有下列氨基酸序列CDR1Asp Tyr Gly Met AlaCDR2Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile His Phe Pro Asp Ser Leu LysGlyCDR3Arg Gly phe Tyr Gly Asn Tyr Arg Ala Met Asp Tyr并且轻链(L链)的V区的CDR序列具有下列氨基酸序列CDR1Arg Ala Asn Glu Ser Val Asp His Asn Gly Val Asn Phe Met AsnCDR2Ala Ala Ser Asn Gln Gly SerCDR3Gln Gln Ser Lys Asp Val Pro Trp Thr.
7.根据权利要求6所述的单克隆抗体，它是由杂交瘤KM1257(FERMBP-5133)产生的单克隆抗体KM1257。
8.根据权利要求5所述的单克隆抗体，它属于IgG1亚类，该抗体H链的V区的CDR序列具有下列氨基酸序列CDR1Ser Tyr Val Ile HisCDR2Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe LysGlyCDR3Glu Gly Ile Arg Tyr Tyr Gly Leu Leu Gly Asp Tyr并且L链的V区的CDR序列具有下列氨基酸序列CDRlGly Thr Ser Glu AspIle Ile Asn Tyr Leu AsnCDR2His Thr Ser Arg Leu Gln SerCDR3Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Tyr Thr.
9.根据权利要求8所述的单克隆抗体，它是由杂交瘤KM1259(FERMBP-5134)产生的单克隆抗体KM1259。
10.根据权利要求5所述的单克隆抗体，它属于IgG1亚类，该抗体H链的V区的CDR序列具有下列氨基酸序列CDR1Asp Thr Tyr Met HisCDR2Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Ser Asp Pro Lys Phe GlnAlaCDR3Gly Leu Arg Leu Arg Phe Phe Asp Tyr并且L链的V区的CDR序列具有下列氨基酸序列CDR1Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met HisCDR2Asp Thr Ser Lys Leu Ala SerCDR3Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Ile Thr
11.根据权利要求10所述的单克隆抗体，它是由杂交瘤KM1468(FERMBP-5651)产生的单克隆抗体KM1486。
12.杂交瘤KM1257(FERM BP-5133)，它产生权利要求6所述的单克隆抗体。
13.杂交瘤KM1259(FERM BP-5134)，它产生权利要求8所述的单克隆抗体。
14.杂交瘤KM1486(FERM BP-5651)，它产生权利要求10所述的单克隆抗体。
15.根据权利要求2所述的抗体，它是人属性化的抗体。
16.根据权利要求15所述的人属性化的抗体，它识别人白细胞介素-5受体α链的N-末端氨基酸的1-313位抗原决定基并且通过免疫细胞染色它特异性地与人白细胞介素-5受体α链反应。
17.根据权利要求15所述的人属性化的抗体，它识别人白细胞介素-5受体α链的N-末端氨基酸的1-313位抗原决定基并且抑制人白细胞介素-5的生物学活性。
18.根据权利要求16或17所述的抗体，它属于人抗体IgG类。
19.根据权利要求15，16或17所述的抗体，它是人嵌合抗体。
20.根据权利要求19所述的抗体，其中人嵌合抗体是一种含有非人动物抗体的L链的V区和H链的V区以及含有人抗体L链的C区和H链不变区(C区)的嵌合抗体。
21.根据权利要求20所述的抗体，其中该抗体的H链的V区含有SEQ IDNO24的氨基酸序列以及该抗体的L链的V区含有SEQ ID NO25的氨基酸序列。
22.根据权利要求20所述的抗体，其中该抗体的H链的V区含有SEQ IDNO26的氨基酸序列以及该抗体的L链的V区含有SEQ ID NO27的氨基酸序列。
23.根据权利要求21所述的抗体，它是KM1399，其中该抗体的H链的C区是属于人抗体IgG1亚类。
24.根据权利要求21所述的抗体，它是KM7399，其中该抗体的H链的C区是属于人抗体IgG4亚类。
25.转化子KM1399(FERM BP-5650)，它产生权利要求23所述的抗体。
26.转化子KM7399(FERM BP-5649)，它产生权利要求24所述的抗体。
27.人属性化的抗体是人CDR-移植的抗体。
28.根据权利要求17所述的抗体，其中通过将人抗体的L链的V区和H链的V区中的CDR序列用非人动物抗体L链的V区和H链V区中CDR序列替代而获得人CDR-移植的抗体。
29.根据权利要求28所述的抗体，其中该抗体的H链的V区中的CDR序列含有权利要求8所述抗体的H链的V区中的CDR序列以及该抗体的L链的V区中的CDR序列含有权利要求8所述抗体的L链的V区中的CDR序列。
30.根据权利要求28所述的抗体，其中该抗体的H链的V区中的CDR序列含有权利要求10所述抗体的H链的V区中的CDR序列以及该抗体的L链的V区中的CDR序列含有权利要求10所述抗体的L链的V区中的CDR序列。
31.根据权利要求29所述的抗体，它是抗体KM8399，其中该抗体的H链的C区属于人抗体IgG1亚类。
32.根据权利要求29所述的抗体，它是抗体KM9399，其中该抗体的H链的C区属于人抗体IgG4亚类。
33.转化子KM8399(FERM BP-5648)，它产生权利要求31所述的抗体。
34.转化子KM9399(FERM BP-5647)，它产生权利要求32所述的抗体。
35.串联的表达盒载体pKANTEX93.
36.一种产生人属性化抗体的方法，借助于含有串联的表达盒载体pKANTEX93的转化子进行的。
37.根据权利要求2所述的抗体，其中该抗体是单链抗体。
38.根据权利要求37所述的单链抗体，它识别人白细胞介素-5受体α链的N-末端氨基酸的1-313位抗原决定基并且抑制人白细胞介素-5的生物学活性。
39.根据权利要求38所述的抗体，其中单链抗体含有人属性化抗体的H链的V区和L链的V区。
40.根据权利要求38所述的单链抗体，其中H链的V区和L链的V区中的CDR序列含有权利要求8的单克隆抗体的H链的V区和L链的V区中的CDR序列。
41.根据权利要求38所述的单链抗体，其中H链的V区和L链的V区中的CDR序列含有权利要求8的单克隆抗体的H链的V区和L链的V区中的CDR序列。
42.根据权利要求2所述的抗体，它是二硫键稳定的抗体。
43.根据权利要求42所述的二硫键稳定的抗体，它识别人白细胞介素-5受体α链的N-末端氨基酸的1-313位抗原决定基并且抑制人白细胞介素-5的生物学活性。
44.根据权利要求43所述的二硫键稳定的抗体，它含有人属性化抗体的H链的V区和L链的V区。
45.根据权利要求43所述的二硫键稳定的抗体，其中H链的V区和L链的V区中的CDR序列含有权利要求8所述单克隆抗体的H链的V区和L链的V区中的CDR序列。
46.根据权利要求43所述的二硫键稳定的抗体，其中H链的V区和L链的V区中的CDR序列含有权利要求10所述单克隆抗体的H链的V区和L链的V区中的CDR序列。
47.一种肽，它含有权利要求6，8或10所述单克隆抗体的H链的V区和L链的V区中的CDR序列，它与人白细胞介素-5受体α链具有反应性。
48.含有一种蛋白质的人白细胞介素-5受体α链抗原，它是通过将一种含有能够以所述蛋白或融合蛋白形式表达人白细胞介素-5受体α链的整个区域或部分片段的载体转染到宿主细胞，在培养物中表达，分离和纯化所述蛋白质或片段而获得的。
49.根据权利要求48所述的人白细胞介素-5受体α链抗原，它具有SEQ ID NO91的氨基酸序列。
50.用于免疫检测人白细胞介素-5受体α链的方法，借助于权利要求1-11，15-24，27-32和37-46任一项所述的抗体。
51.用于免疫检测在表面上表达人白细胞介素-5受体α链的细胞的方法，借助于权利要求1-11，15-24，27-32和37-46任一项所述的抗体。
52.用于免疫检测人嗜曙红细胞增多的方法，借助于权利要求1-11，15-24，27-32和37-46任一项所述的抗体。
53.用于免疫检测和确定可溶性人白细胞介素-5受体α链的方法，借助于权利要求1-11，15-24，27-32和37-46任一项所述的抗体。
54.抑制嗜曙红细胞增多的方法，借助于权利要求1-11，15-24，27-32和37-46任一项所述的抗体。
55.治疗变态反应性疾病例如慢性支气管哮喘的方法，借助于权利要求1-11，15-24，27-32和37-46任一项所述的抗体。
56.治疗嗜曙红细胞增多相关疾病的方法，借助于权利要求1-11，15-24，27-32和37-46任一项所述的抗体。
57.一种抑制嗜曙红细胞增多的方法，包括以权利要求1-11，15-24，27-32和37-46任一项所述的抗体作为活性成分。
58.用于变态反应性疾病的治疗剂，包括以权利要求1-11，15-24，27-32和37-46任一项所述的抗体作为活性成分。
全文摘要
本发明提供了与人白细胞介素－5受体α链特异性反应的单克隆抗体和人属性化抗体,本发明还提供了产生所述抗体,所述单克隆抗体和人属性化抗体的杂交瘤和转化子,提供了借助于这些抗体免疫检测白细胞介素－5受体α链的方法,以及借助于所述单克隆抗体和人属性化抗体诊断和治疗疾病例如慢性支气管哮喘的方法。本发明可用于诊断和治疗疾病例如慢性支气管哮喘。
文档编号C07K16/28GK1189190SQ96191210
公开日1998年7月29日 申请日期1996年9月11日 优先权日1995年9月11日
发明者小池正道, 古谷安希子, 中村和靖, 饭田章博, 穴泽秀治, 花井陈雄, 高津圣志 申请人:协和发酵工业株式会社