专利名称：免疫原和其它药物结合物的制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及哌嗪衍生物在制备具有二烷基氨基基团的免疫原和其它的药物结合物中的应用。
背景技术：
描述接受药物治疗的个体常常必须定期监测其血清或其它体液中的药物水平。已经有检测某些药物水平的方法。例如，利多卡因(lidocaine，一种抗心率失常药)的血清水平可以用气相色谱、高效液相色谱或酶学免疫分析测定。
光散射免疫分析提供了一种高灵敏度的免疫分析手段，它使用具有高折射率的颗粒试剂(particle reagent)，例如在美国专利4,401,765和4,480,042中所描述的颗粒增强比浊抑制免疫分析。自动临床分析仪，例如杜邦aca自动临床分析仪，自动将预先包装好的检测包装中的单剂量试剂与患者样品混合，将样品和试剂在所需的温度(37℃)，保温所需时间，然后读数并打印结果。这样的自动分析仪由于其结果的精确性、可重复性以及容易使用，已经成为临床实验室中必不可少的。光散射免疫分析、异源免疫分析、亲和柱介导的免疫分析、以及一些酶联免疫分析都可以在自动分析仪上完成。必须准备好与目的分析物的反应性衍生物结合的颗粒试剂或一些其它的固体支持物以及分析物的特异性抗体以在这些灵敏的检测中使用。
迄今，还没有适合于所述自动分析仪的利多卡因颗粒试剂。气相和高效液相色谱检测法不适于在自动分析仪中使用。
利多卡因在其结构中包含一个二烷基氨基基团，
据信，许多其它具有二烷基氨基基团的药物也还没有适合于自动分析仪使用的颗粒试剂。
普鲁卡因酰胺是另一种在其结构中具有二烷基氨基基团的药物，
在一种已知的试剂中，蛋白结合在标有*的甲基位点；在另一种试剂中，蛋白结合在上式中标有**的位点。
丙咪嗪和阿米替林(amitriptyline)的结构中都含有二烷基氨基，开发其抗体的方法已描述于文献中。在两种方法中，化合物的结构都通过在化合物的芳香环上附加隔离臂(spacer arm)而被修饰。然后，隔离臂被连结到牛血清白蛋白上并被用于产生抗体。参见Adamczyk，M.等，免疫学方法杂志，162(1)卷，47-58页(1993)和163(2)卷，187-97页(1993)。
人们需要一种促进二烷基氨基药物结合到蛋白上以提供免疫原和颗粒试剂的方法，该免疫原和颗粒试剂被用于更灵敏、迅速和可靠的自动分析技术。特别需要用于制备免疫原和抗原的二烷基氨基药物的反应性衍生物，它们适用于商品化的用来定量检测人血清中利多卡因和其它二烷基氨基药物的自动分析仪中。
发明概述本发明涉及一种用于结合载体化合物的组分，其中该组分具有下式
其中n是大于或等于1的整数，D是一种化合物，优选的是一种药物，在其非衍生结构中具有二烷基氨基基团。在本发明的组分的制备中，该化合物的二烷基氨基基团由如下残基取代，
该残基是一种类似于哌嗪的衍生物，它基本上保留了化合物D的结构，同时为结合到载体化合物上而加入了反应性末端氮原子。
任选地，一个双功能间隔物可以结合到末端氮原子上以将本发明的反应性衍生物组分连结到载体化合物上。双功能间隔物可以选自环酐、二N琥珀酰亚氨基衍生物或二醛。
载体化合物可以是(I)蛋白质物质，例如锁孔帽贝血蓝蛋白、卵清蛋白或牛血清白蛋白(BSA)，或(ii)合成的聚合物质，例如聚乙烯聚胺或聚乙二醇。衍生的组分—载体化合物结合物—可以被用作产生化合物D特异性抗体的免疫原，或者可以通过载体化合物结合到固体支持物(例如聚合物颗粒)上，以用作在免疫分析中检测化合物D的水平的试剂。
本发明的一种优选的颗粒试剂包括一种具有内核和外壳的聚合物颗粒，其中内核是在钠D线波长测量时，具有不小于1.54的折射率的聚合物。外壳是如下单体的聚合物(i)双链不饱和单体，其具有能够与同生物学有关的亲核化合物反应的功能基团；(ii)任选的其它双链不饱和单体，其含量足以产生水不溶性聚合物颗粒，以及(iii)不超过外壳10重量份的内核单聚体，外壳是在与衍生组分(上述载体化合物结合物)共价结合的内核的存在下通过聚合反应形成的。
附图
描述附图表明本发明方法的成功，它显示的是通过每分钟在340nm处的毫吸光度随样品中利多卡因浓度的变化(mA/min)而测量出的凝集速率的图。
优选实施方案的详细描述本发明提供了一种促进化合物(具体地说，是具有二烷基氨基的药物)，通过用哌嗪取代二烷基氨基基团，与载体化合物结合的新方法。载体化合物可以是蛋白质物质，例如抗原或酶。通过衍生成包含哌嗪结构而提供的附加的氨基基团促进了结合过程。如果需要，可以在哌嗪的末端氨基基团和载体之间插入间隔物。
本发明提供了一种具有如下结构的二烷基氨基药物的反应性的衍生物
其中D是任何药物，在其未衍变的结构中，通常含有二烷基氨基基团，n是等于或大于1的整数，优选的是在1至3之间，最优选的是等于2。本发明的反应性衍生物的每条二烷基链的n的数目是相等的。蛋白不结合到二烷基链上，并且结合不被链的长度影响，所以链的长度对于哌嗪衍生物或结合物的功能并非决定性的。而且，在原来药物中将二烷基链的长度改变成哌嗪类结构不会改变抗体对药物的识别。
可选地，该组分可以包括一个双功能间隔物以连结反应性药物哌嗪衍生物和蛋白质载体化合物，其结构如下所示
其中n’是从0至6的整数。也可以使用其它的双功能间隔物。例如，针对氨基基团的双功能间隔物如环酐、二N琥珀酰亚氨基衍生物或二醛可以用作双功能间隔物。可以使用许多其它可能的双功能间隔物。例如，参见S.S.Wong的《蛋白结合和交联化学》(CRC出版社1991年)中的第4章第76-97页表1所列的同双功能间隔物(homobifunctional spacer)，及第5章第152-167页表1所列的异双功能间隔物(heterobifunctional spacer)。
为了将反应性药物衍生物用作抗原，举例来说，一种蛋白质被连到末端氮原子上或双功能间隔物的官能团上，如下所示
or
可选地，有或没有间隔物的药物衍生物-蛋白质结合物可以被用于将药物固定到固体支持物上，该固体支持物例如描述于美国专利4,401,765和4,480,042中的颗粒试剂，该专利在此引用作为参考，或任何适合的固体支持表面。本发明的药物衍生物-载体结合物尤其适合于在上述常规自动临床分析仪上进行的免疫分析。有许多种不同的蛋白可以用于结合反应。其选择取决于药物-蛋白质结合物的最终应用。例如，如果结合物被用于将药物附着在固体支持物上或颗粒上以用作免疫分析中的抗原，可以使用一种连接物(linker)，如聚乙烯聚胺(PEPA)和人血清蛋白(HSA)或牛血清蛋白(BSA)。相同的结合物可以被用作免疫原。但是，由于免疫原性和特异性的原因，优选的是不同的蛋白质载体。如果结合物将被用作免疫原，优选的是BSA、卵清蛋白、锁孔帽贝血蓝蛋白(KLH)。不同的蛋白质载体是用已知的技术结合到反应性药物哌嗪衍生物上的，如S.S.Wong在《蛋白结合和交联化学)》(CRC出版社1991年)中所描述的。
可以从本发明的哌嗪衍生物中受益的二烷基氨基药物的个例列于下表I。
表I
诺昔替林(抗抑郁)
去甲替林(抗抑郁)
当用作免疫原时，本发明的反应性药物衍生物产生一种抗体，该抗体比用现有技术可能产生的抗体对于基本药物(basic drug)具有更高的特异性。由于哌嗪的结构与二烷基氨基基团的结构非常近似，所以哌嗪衍生物保留了基本药物结构。
所得化合物与基本药物的唯一不同是添加了一个氨基，此氨基有效地环化了存在于基本药物结构中的二烷基氨基支链。现有技术是在药物结构中的一个位点偶联蛋白，这样改变了其基本结构。
哌嗪的氨基被用于将药物用已知的技术偶联到蛋白上以生成免疫原。(参见S.S.Wong，引文同上)于是，药物的结构被保留了，没有发生明显的改变，并且附着物所在的位点无害于药物。
下面是说明本发明的二烷基氨基药物的哌嗪衍生物的制备和应用的实施例。
以下的利多卡因衍生物已被合成并被表征N-利多卡因和N-利多卡因丙酸。
用于免疫原和颗粒试剂合成的利多卡因衍生物1.利多卡因
2.利多卡因丙酸
制备以下的免疫原N-利多卡因-BSA、N-利多卡因-KLH、N-利多卡因丙酸-BSA、N-利多卡因丙酸-KLH。已知KLH是较好的免疫原，但是其低溶解性使它难以操作和表征。因此，还制备了BSA结合物以作备份。这些免疫原可以用于启始用现有的技术生产利多卡因抗体。
为免疫原和颗粒试剂的制备正确地选择一种反应性利多卡因衍生物是关键的，否则该免疫原就不能产生利多卡因特异性抗体，并且颗粒试剂不能特异性地与患者血清中的利多卡因结合。
利多卡因颗粒试剂是从N-利多卡因-HSA、N-利多卡因-PEPA1300(聚乙烯聚胺，平均分子量1300)、N-利多卡因丙酸-HSA和N-利多卡因丙酸-PEPA200制备的。当用购自Kallestad实验室的山羊抗利多卡因抗体检测时，所有的颗粒试剂在Cary19分光光度计上都显示了很高的活性。使用含2.5％的聚乙二醇800(PEG)、0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)的0.15M的磷酸盐(pH7.8)作为分析缓冲液，将12μl的颗粒试剂和8μl的抗利多卡因抗体一起保温。当颗粒试剂用几批兔抗利多卡因抗体检测时，既观察到了抗HSA活性也观察到了无抗HSA活性。
绘制了N-利多卡因-HSA-颗粒试剂的利多卡因颗粒增强比浊抑制免疫分析曲线，结果示于附图中。凝集速率变化是通过绘制340nm毫吸光度每分钟的变化对样品中利多卡因浓度的曲线来测量的。样品中药物的存在抑制了凝集，所以药物浓度越高，凝集速率越低。该分析不是最优化的，但是在治疗范围内已达到了很好的分离。结果说明该利多卡因颗粒试剂和免疫原适合于利多卡因颗粒增强比浊抑制免疫分析。而且，利多卡因的治疗范围(1.0-12μg/μl)很好地在颗粒增强比浊抑制免疫分析灵敏度范围之内(约0.5μg/ml-50μg/ml)。
实施例实施例1利多卡因衍生物的合成a.N-利多卡因的制备1.N-氯乙酰-2，6-二甲苯胺。160mL冰醋酸中的24mL 2，6-二甲苯胺溶液(0.2摩尔)在冰浴中冷却至10℃，17.1mL的氯乙酰氯(0.22摩尔)一次全部加入。剧烈搅拌混合液10分钟，一次加入半饱和的醋酸钠溶液200mL。立即生成白色沉淀。混合液用水补足至500mL，在室温下搅拌30分钟，然后在4℃搅拌1小时。过滤收集白色粉末，在甲醇水溶液中重结晶，得到白色细小针状晶体，熔点145-146℃，干重32.5克(83％)。
2.N-利多卡因的制备。哌嗪样品(17.2g，0.2摩尔)加热溶于150mL的乙酸乙酯。在热溶液中加入溶于50mL乙酸乙酯的3.98g从上述步骤b.1制得的N-氯乙酰-2，6-二-甲苯胺(0.02摩尔)，混合溶液回流30分钟。在冰浴中冷却30分钟后，过滤该溶液以除去生成的盐酸哌嗪。将过滤物用20mL的水洗涤三次，并用无水硫酸钠干燥。在旋转蒸发器中70℃1小时除去溶剂。冷却时油性残余物凝固。将其收集并在真空条件下干燥。干燥后的沉淀物具有以下的性质熔点109-114℃，重量3.82g(77％)，NMR(氘代氯仿)ppm始自四甲基硅烷低场方向；δ2.2(6H，单重峰)，δ2.6(4H，三重峰)，δ2.9(4H，三重峰)，δ3.1(2H，单重峰)和δ7.0(3H，单重峰)。
b.N-利多卡因-丙酸的制备。从上述步骤b.2获得的1.23g的N-利多卡因(5摩尔)和1.25g的碘丙酸(6.25毫摩尔)在20mL乙腈中的混合液，于70℃加热1小时。向混合液中加入1.25mL的三乙胺，继续加热30分钟。混合液在冰浴中冷却30分钟。沉淀用过滤法收集，用冷乙腈洗涤并干燥。干燥的沉淀具有如下性质熔点250-252℃，重1.5克(94％)，NMR(氘代三氟乙酸)ppm始自四甲基硅烷低场方向；δ2.2(6H，单重峰)，δ3.2(2H，三重峰)，δ3.85(2H，三重峰)，δ4.2(8H，宽单重峰)，δ4.7(2H，单重峰)和δ7.1(3H，单重峰)。实施例2利多卡因结合物的合成a.N-利多卡因-蛋白结合物1.在300mg HSA(纯化自第五级分，即级分V)溶于17mL水的溶液中加入300mg的乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸化物(EDPC)。pH值调至6(通过加入0.1M的盐酸)，并且加入溶于3mL乙醇的150mg N-利多卡因。pH值重新调至6。混合液在室温下搅拌90分钟，然后加入另外150mg的EDPC。混合液在4℃搅拌过夜，然后用15mM的磷酸缓冲液(pH值7.8)彻底透析。
2.用同样的方法制备N-利多卡因-BSA和N-利多卡因-KLH结合物。
b.N-利多卡因-丙酸结合物的制备1. 160mg的N-利多卡因-丙酸(0.5毫摩尔)溶于10mL二甲基甲酰胺的溶液(用分子筛干燥)在冰浴中冷却，加入139μL的三乙胺(0.5毫摩尔)，之后加入130μL的异丁基氯甲酸酯(0.5毫摩尔)。混合液在4℃搅拌20分钟，添加包含300mg PEPA-200的水至15mL。混合液在4℃保存30分钟，然后在室温下保存5小时。不用透析即可使用该产物。
2.除产物用15mM的磷酸缓冲液(pH值7.8)透析外，其它步骤与制备PEPA-200结合物相同。实施例3利多卡因颗粒试剂(PR)的制备a.N-利多卡因-HSA-PR 1mg/mL的N-利多卡因-HSA、0.4％的颗粒原料以及0.18％的GAFAC溶于34mL 15mM磷酸缓冲液(pH值7.5)的溶液在70℃加热45分钟。混合液在冰浴中冷却，用Sorvall RC-5B离心机于19k rpm离心90分钟。弃去上清液，沉淀重悬于15mL 15mM的磷酸缓冲液。颗粒试剂再次离心，沉淀用超声处理重悬于5mL 15mM的甘氨酸(pH值9.0)和0.01％的硫汞撒(thimerosal)。
b.N-利多卡因-PEPA-PR、N-利多卡因-丙酸-HSA-PR和N-利多卡因-丙酸-PEPA-PR除用于合成PEPA颗粒试剂的pH值为9.5外，使用相同的方法制备其它的利多卡因颗粒试剂。实施例4颗粒增强比浊抑制免疫分析(PETINIA)的反应性利多卡因颗粒试剂的PETINIA的反应性在包含2.5％PEG和0.1％SDS、8μL抗利多卡因抗体、10μL标定剂和12μL颗粒试剂的1mL 150mM磷酸缓冲液中测定。用Cary19分光光度计在340nm于室温下跟踪反应速率。
当用兔抗利多卡因抗体测定时，几批颗粒试剂给出了大约400mA/分钟的速率，但是反应不可被利多卡因抑制。当用山羊抗利多卡因抗体测定时，得到相同的速率，并且80％可被利多卡因抑制。结果示于表II。
表II利多卡因颗粒试剂的反应性利多卡因颗粒试剂(PR) 抗利多卡因抗体 所用校准物速率(μg/mL) (mA/min)N-利多卡因-HSA-PR 兔 0 600N-利多卡因-HSA-PR 兔 12 540N-利多卡因丙酸-PEPA-PR 兔 0 400N-利多卡因丙酸-PEPA-PR 兔 12 380N-利多卡因-PEPA-PR 兔 0 360N-利多卡因-PEPA-PR 兔 12 330N-利多卡因-HSA-PR 山羊 0 510N-利多卡因-HSA-PR 山羊 1 350N-利多卡因-HSA-PR 山羊5250N-利多卡因-HSA-PR 山羊12 175N-利多卡因-HSA-PR 山羊20 125N-利多卡因丙酸-PEPA-PR山羊0360N-利多卡因丙酸-PEPA-PR山羊1270N-利多卡因-PEPA-PR山羊0370N-利多卡因-PEPA-PR山羊1270以下是N-乙酰普鲁卡因酰胺(NAPA)或普鲁卡因酰胺的衍变序列。
生成普鲁卡因酰胺和NAPA的哌嗪衍生物过程中，一个关键步骤是生成二(氨基乙基)哌嗪(BAP)。如上述反应序列I所示，哌嗪与氯乙腈反应以提供二(氰基甲基)哌嗪(BCP)，并且通过加压催化加氢作用而减少BCP以生成二(氨基乙基)哌嗪(BAP)。BAP与NHS-酯(II)
偶联形成乙酰普鲁卡因酰胺哌嗪衍生物(APP，NAPA哌嗪衍生物)。通过APP与琥珀酸酐反应引入蛋白结合物连接子，然后它与蛋白偶联以提供NAPA蛋白结合物。普鲁卡因酰胺蛋白结合物的合成与NAPA相比还包括一个保护和去保护的步骤。如以下反应序列II所示，叔丁氧氨基甲酰基(t-BOC)基团被用于保护对氨基苯酸的氨基基团以生成叔丁氧氨甲酰基苯甲酸(BOC-BA)，然后BOC-BA与二琥珀酰亚胺碳酸酯(DSC)在四氢呋喃(THF)和三乙胺(TEA)溶液中反应以生成NHS-酯II’，叔丁氧氨甲酰基琥珀酰亚胺苯甲酸酯(BOC-SB)。
在普鲁卡因酰胺与蛋白结合后，如反应序列III所示，BOC保护基团在有机溶液(二氯甲烷)中用三氟乙酸除去。
使用上述BAP衍生途径，合成了两个NAPA和两个普鲁卡因酰胺蛋白结合物(带有卵清蛋白和KLH)。该途径的局限是BCP的高压加氢反应，它导致BAP产率较低，约15-20％。
NAPA哌嗪衍生物及其蛋白结合物的合成实施例5BCP和BAP的合成21.535g哌嗪(0.25摩尔)、77mL三乙胺(TEA)(0.55摩尔)和300mL二氯甲烷放入一个1000mL的烧瓶。34.81mL氯乙腈(0.55摩尔)与100mL-二氯甲烷混合，之后搅拌加入哌嗪溶液。反应液在室温搅拌16小时，得到大量固体沉淀。加入100mL HCl(1N)溶液以提取产物(反应液至少提取三次，100mL×3)。HCl水溶液用50mL二氯甲烷洗涤两次。溶液的pH值用氢氧化钠溶液(3N)调整至11-12。过滤收集固体，然后用水洗涤并在真空中干燥得到20g BCP，产率约50％。用核磁共振(NMR)确定化合物的结构，结果如下1H NMR(400MHz，CDCl3)δppm2.67(8H，s)，3.55(4H，s)。
一个高压弹(high-pressure bomb，常用的耐高压金属容器)中注入20g-二(氰甲基)哌嗪(BCP)(0.122摩尔)；然后加入2-3g悬于25mL95％乙醇的拉内(Raney)镍催化剂。再加入25mL乙醇以清洗催化剂。关闭弹体，从钢瓶引入约15g(0.882摩尔)的液态氨水。然后接入罐压(15001b)的氢气，并升温至90℃。当2-3小时后氢气不再被吸收时，关闭加热器使弹体冷却。放掉氢气和氨水，弹体内的成分用两份50mL 95％乙醇洗出。过滤除去催化剂，然后用旋转蒸发法除去溶剂。所得的棕色油进一步用真空蒸馏(70-80℃/5mmHg)纯化以得到约4.2g BAP，产率约21％。从哌嗪得到BAP的总产率约为10％。NMR结果如下1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm1.87(2H，s)，2.23-2.25(2H，m)，2.37(2H，m)，2.58-2.71(6H，m)，3.66(H2O，s)。实施例6琥珀酰亚胺基对乙酰氨基苯甲酸(NHS-酯II，见上述序列III)的合成5.375g对乙酰胺基苯甲酸(0.03摩尔)、8.453g DSC(0.033摩尔)和150THF置于烧瓶中。混合液于室温搅拌30分钟以上。加入5mL三乙胺，该反应物于室温下搅拌16小时。用旋转蒸发法除去溶剂。所得的固体用水洗涤三次(在真空过滤条件下)以除去副产物。将固体真空干燥，得到约6.0对乙酰胺基苯甲酸(NHS-酯II)，产率72％。NMR结果如下1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm2.12(3H，s)，2.89(4H，s)，3.36(H2O，s)，7.84(2H，m)，8.05(2H，m)。实施例7乙酰普鲁卡因酰胺哌嗪衍生物(APP)和APP酸的合成1.69g纯化的BAP和10mL THF置于一个25mL的烧瓶中。0.687g琥珀酰亚胺对乙酰胺基苯甲酸溶于29mL的THF中。第二种溶液缓慢搅拌加入BAP溶液中。搅拌反应物，并用薄层层析监测(TLC)(100％乙酸乙酯作为TLC的溶剂)直至监测不到琥珀酰亚胺对乙酰胺基苯甲酸。形成大量固体。用移液管除去溶剂。固体用乙醚洗涤三次(10mL×3)以除去多余的BAP。固体真空干燥得到66％的产物(APP，550mg)。
166.5mg APP和5mL二乙基甲酰胺(DMG)置于一个50mL的烧瓶中，然后加入69.56μL三乙胺。50mg的琥珀酸酐溶于2mL DMF中，并在搅拌下缓慢加入APP溶液。反应在室温下搅拌进行1小时。加入20mL乙醚(Et2O)后，反应混合物置于冰箱中过夜以沉淀产物(APP酸)。用移液管除去溶剂，并用乙醚洗涤两次(5mL×2)。剩下的固体被真空干燥，获得约100mg的APP酸，产率46％。实施例8NAPA蛋白结合物的合成a.APP-OBt酯的合成1.称量60.00mg(0.138摩尔)APP酸和16.54mg(0.152摩尔)HOBt，并置于一个2mL的小瓶中。放入磁力搅拌棒。600μl的无水DMF用移液管加入小瓶以溶解APP酸和水合羟基苯并三唑(HOBt)。
2.称量28.54mg(0.138毫摩尔)双环己基羰基二亚胺(DDC)，并搅拌加入上述溶液中。
3.反应在室温下搅拌进行2-3小时。活化后的酸于是可以被用于与蛋白偶联。
b.APP-蛋白结合物的合成蛋白溶液A.0.15M NaHCO3中的卵清蛋白1.称量0.315g碳酸氢钠并加入25.0mL容量瓶中，然后用去离子水溶解至恰好25.0mL。
2.50mg的卵清蛋白在一个16mL的有螺旋盖并放入磁力搅拌棒的小瓶中溶于8mL 0.15M NaHCO3(碳酸氢钠)。
B.KLH水溶液50mg KLH在一个16mL的离心管中溶于8mL去离子水，并在冷室(4℃)中轻轻搅拌过夜。然后将该离心管离心。将上清液倒入一个16mL的有螺旋盖的瓶中(将被用作合成结合物的反应容器)并存放于冰箱中。
C.APP-结合物1.从上述步骤制得的300μl上述各APP-OBt DMF溶液用移液管分别加入KLH水(2.B)和卵清蛋白缓冲液(2.A)中并搅拌。反应在室温下小心搅拌10分钟，然后放入4℃的冷室过夜。
2.上述两种APP结合蛋白溶液对去离子水透析三次，然后对磷酸盐缓冲液(PBS)透析三次(卵清蛋白结合物使用6-8,000MW范围的透析袋)。
普鲁卡因酰胺哌嗪衍生物及其蛋白结合物的合成实施例9BOC-BA和BOC-SB的合成a.制备BOC-BA1.称量3.425g氨基苯甲酸(ABA)和1.5g氢氧化钠，并置于一个100mL的烧瓶中。
2.搅拌加入25mL水。
3.加入5.995g二叔丁氧基重碳酸酯(DBDC)。
4.反应在室温下搅拌过夜。
5.溶液用1N盐酸酸化至pH4-5(约需37.5mL 1N盐酸)。
6.产物用乙酸乙酯萃取三次(3×25mL)。
7.乙酸乙酯(EtOAc)溶液用水洗涤三次(3×25mL)。
8.EtOAc溶液用硫酸镁干燥。
9.用旋转蒸发法除去溶剂。
10.产物称重(W)，产率按照下式计算Y＝(W/5.01)×100％b.BOC-SB合成1.称量3.555g BOC-BA(0.015摩尔)并溶于50mL乙腈。
2.加入4.224g DSC(0.015×1.1摩尔)和5.22mL TEA(0.015×2.5摩尔)至该混合物。
3.反应在室温下搅拌进行2-3小时(反应物用50％EtOAc和50％己烷检查)。
4.除去溶剂。
5.产物的纯度用TLC(用色谱柱多次纯化该产物)检测。
6.产物称重(W)，产率按照下式计算Y＝(W/5.925)×100％NMR结果如下1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm1.50(9H，s)，2.88(4H，s)，3.34(H2O，s)，7.71(2H，m)，8.00(2H，m)。实施例10BOC-PP和BOC-PP-NHS酯的合成a.BOC-PP(叔丁氧基氨基甲酰基普鲁卡因酰胺哌嗪衍生物)的合成1. 0.688mg BAP溶于10mL THF。
2. 334mg BOC-SB溶于15mL THF。
3.步骤2的溶液(BOC-SB)缓慢搅拌加入步骤1的溶液(BAP)中。5-10分钟后产生一些固体沉淀。
4.反应在室温下搅拌30分钟以上。
5.用移液管除去溶剂。固体用乙醚洗涤三次(10mL×3)以除去多余的BAP。
6.将固体真空干燥，得到87％的产物(BOC-PP，340mg)。
BOC-PP极易吸湿，应存放于干燥器中。
b.BOC-PP-NHS酯的合成1.称量107.92mg(0.276毫摩尔)BOC-PP并置于一个4mL小瓶中。放入一个磁力搅拌棒。用移液管将500μl无水DMF和40μl TEA加入小瓶中以溶解BOC-PP。
2.27.6mg(0.276毫摩尔)琥珀酸酐溶于100μl DMF中，并搅拌加入步骤1的溶液中；小瓶用100μl DMF溶剂清洗，并加入到溶液中以保证定量转移。
3.反应在室温下搅拌进行1小时。
4.称量77.78mg DSC(0.152毫摩尔)并加入上述反应液中，之后搅拌加入56.0μl TEA。
5.反应在室温下搅拌进行2小时。实施例11普鲁卡因酰胺蛋白结合物的合成a.蛋白溶液A.0.15M NaHCO3中的卵清蛋白1.称量0.630g碳酸氢钠并加入一个50.0mL的容量瓶中，然后用去离子水溶解至恰好50.0mL。
2.100mg卵清蛋白在一个40mL的有螺旋盖并加入磁力搅拌棒的瓶中溶于16mL 0.15M NaHCO3(碳酸氢钠)。
B.KLH水溶液100mg KLH在一个离心管中溶于16mL去离子水，在4℃的冷室中轻轻搅拌过夜。将该离心管离心，然后将上清液倒入一个40mL的有螺旋盖的瓶中(将被用作合成结合物的反应容器)并存放于冰箱中。
b.BOC-PP-NHS与蛋白的结合从实施例6b.5制得的400μl上述BOC-PP-NHS DMF溶液(0.138毫摩尔的BOC-PP-NHS)用移液管转至KLH水和卵清蛋白缓冲液溶液中，并搅拌。反应在室温下小心搅拌进行10分钟，然后存放于冷室(4℃)中过夜。
c.BOC-基团的去保护和结合物的纯化1.两种结合了BOC-PP-NHS的蛋白溶液对去离子水透析三次。
2.两种蛋白溶液在真空中冻干(冰冻干燥)以获得蛋白固体。每种蛋白加入5mL CH2Cl2，之后加入5mL三氟乙酸。搅拌5分钟后，溶剂在真空中浓缩，剩余物重新溶于16mL PBS缓冲液。所得的混浊液对去离子水透析三次，再对PBS缓冲液透析三次(使用6-8,000MW范围的透析袋)。
本发明的反应性衍生物提供了将具有二烷基氨基基团的药物或其它化合物结合到蛋白或其它载体化合物上的新的化合物。许多具有二烷基氨基基团的药物可以从本发明的衍生物中获益。上文已经描述了将两种不同类型的药物衍生成本发明的反应性衍生物的方法。本领域的专业人员应认识到可以使用衍生其它二烷基氨基化合物的其它方法，并且这些方法可以随不同的化合物而不同，但是准确的衍生技术属于本领域的方法。用于将反应性哌嗪类衍生物N末端或双功能间隔物的功能基团结合到载体化合物的方法会随药物和载体化合物组合的不同而不同，但是也完全在本领域的技术范围中。
权利要求
1.一种用于与载体化合物结合的组分，它包含
其中D是在其未衍生结构中具有二烷基氨基基团的化合物，该二烷基氨基基团被该组分的
残基替代，n是大于或等于1的整数。
2.权利要求1中的组分，其中D是选自利多卡因、普鲁卡因酰胺、N-乙酰普鲁卡因酰胺、丙吡胺、氯喹、苯海拉明、美沙酮、丙咪嗪、地昔帕明、阿米替林、诺昔替林和去甲替林的药物。
3.权利要求1中的组分，其中末端氮结合到载体化合物上。
4.权利要求3中的组分，其中载体化合物是蛋白质物质。
5.权利要求3中的组分，其中载体化合物结合到固体支持物上。
6.权利要求5中的组分，其中固体支持物是聚合物颗粒。
7.权利要求1中的组分，它还包含结合到末端氮上的双功能间隔物。
8.权利要求7中的组分，其中双功能间隔物具有与哌嗪类衍生物的末端氮结合的第一功能末端和与载体化合物结合的第二功能末端。
9.权利要求8中的组分，其中双功能间隔物选自环酐、二N琥珀酰亚氨基衍生物和二醛。
10.权利要求8中的组分，其中载体化合物是蛋白质物质。
11.权利要求8中的组分，其中载体化合物结合到固体支持物上。
12.权利要求11中的组分，其中固体支持物是聚合物颗粒。
13.一种免疫原，它包含一种选自
和
的组分，其中D是在其未衍生结构中具有二烷基氨基基团的药物，该二烷基氨基基团被该化合物的
衍生物替代，n是大于或等于1的整数，X是双功能间隔物。
14.权利要求13中的免疫原，其中药物选自利多卡因、普鲁卡因酰胺、N-乙酰普鲁卡因酰胺、丙吡胺、氯喹、苯海拉明、美沙酮、丙咪嗪、地昔帕明、阿米替林、诺昔替林和去甲替林。
15.权利要求13中的免疫原，其中双功能间隔物选自环酐、二N琥珀酰亚氨基衍生物或二醛。
16.权利要求13中的免疫原，其中n是从1至3的整数。
17.权利要求13中的免疫原，其中蛋白选自卵清蛋白、锁孔帽贝血蓝蛋白和牛血清白蛋白。
18.一种颗粒试剂，它包含(a)具有内核和外壳的聚合物颗粒，其中内核是在钠D线波长测量时，具有不小于1.54的折射率的聚合物，并且外壳是如下单体的聚合物(i)双键不饱和单体，其具有能够与生物学有关的亲核化合物反应的功能基团；(ii)任选的其它双键不饱和单体，其含量足以产生水不溶性聚合物颗粒，以及(iii)不超过外壳10重量份的内核单体，外壳是在共价结合的内核的存在下通过聚合反应形成的；(b)一种组分，它选自
和
其中D是在其未衍生结构中具有二烷基氨基基团的药物，该二烷基氨基基团被组分的
衍生物取代，n是大于或等于1的整数，X是双功能间隔物。
19.权利要求18中的颗粒试剂，其中药物选自利多卡因、普鲁卡因酰胺、N-乙酰普鲁卡因酰胺、丙吡胺、氯喹、苯海拉明、美沙酮、丙咪嗪、地昔帕明、阿米替林、诺昔替林和去甲替林。
20.权利要求18中的颗粒试剂，其中双功能间隔物选自环酐、二N琥珀酰亚氨基衍生物和二醛。
21.权利要求18中的颗粒试剂，其中n是从1至3的整数。
22.权利要求18中的颗粒试剂，其中载体化合物选自牛血清白蛋白、聚乙烯聚胺和人血清白蛋白。
全文摘要
本发明提供了一种二烷基氨基化合物(特别是二烷基氨基药物)的反应性衍生物，用于直接地或通过双功能隔离物简化药物与载体化合物，例如蛋白质物质的结合。该衍生物如式(a)所示，其中D是药物，n是大于1的整数，优选地等于2。药物衍生物载体结合物可以被用作产生药物特异性抗体的免疫原。另外，该结合物可以被偶联到固体支持物上，例如聚合物颗粒，以用作药物特异性免疫分析中的颗粒试剂。
文档编号C07D295/08GK1163612SQ96190885
公开日1997年10月29日 申请日期1996年6月7日 优先权日1996年6月7日
发明者刘汉平 申请人:达德化学系统公司