赋予酵母絮凝特性的基因和其基因产物的制作方法

专利名称：赋予酵母絮凝特性的基因和其基因产物的制作方法
技术领域：
本发明涉及酵母絮凝基因和其用途。更具体地说，本发明涉及具有赋予酵母以啤酒酵母型絮凝特性的活性的蛋白质，编码所述蛋白质的DNA，含所述DNA的质粒，生产利用DNA赋予或增强了啤酒酵母型絮凝特性的酵母菌株的方法，生产利用DNA消除或降低了啤酒酵母型絮凝特性的酵母菌株的方法，以及通过抑制所述DNA的表达而消除或降低啤酒酵母型絮凝特性的方法。
本发明还涉及通过上述方法被赋予、增强、消除或降低了啤酒酵母型絮凝特性的酵母菌株。
此外，本发明涉及酿造产品的生产方法，包括培养上述酵母菌株，还涉及用所述方法得到的酿造产品。
背景技术：
已经熟知，在酒精类饮料如啤酒和葡萄酒中，发酵中所用的啤酒酵母的絮凝特性是很重要的，这不仅因为它决定了所得产品的气味和味道，还因为它影响在发酵过程中的可操作性。在德国、日本和许多其他国家在生产储藏啤酒时广泛使用的酵母有一种特征，即在发酵快结束时，细胞絮凝并沉淀在发酵的麦芽汁的底部；上述酵母被特别地称为底部发酵酵母。在啤酒酿造中，有一种在其他酿造过程中所没有特征，即回收在发酵结束时沉淀的酵母细胞并在以后的发酵中重新使用。因此，在发酵后期沉淀的底部发酵酵母的特征对于啤酒酿造有特别重要的意义。
由于啤酒酵母是决定最终啤酒产品质量的主要因素，所以培育优秀的酵母菌株是啤酒生产者的重要课题。在底部发酵酵母的育种中，将适宜的絮凝特性赋予酵母有着显著的意义。这是因为，絮凝特性太强的酵母在发酵过程中沉淀在发酵的麦芽汁中，会导致发酵的终止，而另一方面，没有絮凝特性的酵母菌株甚至在发酵后期都会悬浮着，那么就需要经过离心之类的操作从发酵的麦芽汁中除去酵母细胞。因此，对于目前生产方法所需的酵母菌株是在发酵开始时是分散的， 而在发酵后期很好沉淀的菌株。如果生产方法不同，不用说，就需要具有适宜该方法的絮凝特性的酵母菌株。
尽管对在工业上有重要意义的酵母絮凝特性进行了大量的研究，但是尚未阐明酵母絮凝的机制。很难说通过改进酵母菌株本身来控制絮凝特性是成功的。作为酵母遗传研究的结果，已经确定酵母基因如FL01，f103，FL05，FL08，sfl1，fsu1，fsu2，tup1，cyc8，cka2，FMC1以及在线粒体DNA中的基因oli1和oxi2是与酵母絮凝特性有关的基因。作为与酵母絮凝特性有关的这些基因的分子水平的研究，已经完成了FL01基因的分离和分析[酵母，9，423(1993)和酵母，10，211(1994)]。FL05基因的分离和分析也已被报道。所述报道表明，尽管在酵母染色体DNA中，FL05基因的位置不同于以前报道的FL01基因的位置，但是FL05基因的限制图谱和核苷酸序列与FL01的几乎相同[发酵工业杂志，85，95，(1979)和当代基因技术，25，196(1994)]。
但是，在分子水平分析这些基因还不够，而且尚未阐明这些基因以什么样的机制与酵母絮凝特性有关。此外，除FL01和FL05以外，就其他与酵母絮凝特性有关的基因来说，甚至分离或结构分析都尚未完成。对于这些基因所编码的蛋白质也没有报道。
由于试图利用上述与该特性有关的基因来改进酵母的絮凝特性，所以已经报道了通过导入FL01基因(一种啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的絮凝基因)[农业生物化学，55，1547(1991)]而将絮凝特性赋予各种非絮状酵母菌株包括啤酒酵母(brewer’s yeast)。然而，由此转化的啤酒酵母的絮凝能力还报道从发酵开始阶段就被表达了，而且会使发酵延缓[日本酿造协会杂志，88，665(1993)]。因此，不能说以一种良好的方式控制了用FL01基因赋予酵母以絮凝特性，还需要进一步的改善以使所述方法能够进行实际应用。此外，尽管已知FL01基因能够赋予酵母絮凝特性，但是并未阐明在酵母絮凝中其基因产物的作用。分析从FL01基因核苷酸序列推测的氨基酸序列的结果表明，FL01基因产物可能位于酵母细胞表面层。从絮状啤酒酵母细胞的表面层特异性得到的蛋白质(flocculin)N-末端14个残基的氨基酸序列同源于FL01基因的核苷酸序列推测的氨基酸序列[应用环境微生物学，60，2754(1994)]的报道也支持这种假设，但是，尚未阐明上述蛋白质的机制。结果，用FL01基因控制酵母絮凝的努力受到了其限制。
作为使用除FL01以外的基因的尝试，用FL05基因和细胞融合方法将遗传特征赋予酵母，而且已经表明了赋予遗传特征的效用[发酵工业杂志，98，315(1992)]。然而，由于导入遗传特征的方法是细胞融合方法，因此，很难得到具有所需特征的酵母菌株，此外，还有一个问题，就是会将除絮凝相关的基因以外的DNA序列导入到所得的酵母菌株中；如同时导入了给啤酒增加酚味且许多啤酒酵母菌株都有的POF1基因[Proc.Eur.Brew.Conv.，497(1981)]。因此，不能说可以控制用所述方法改善有用酵母菌株的絮凝特性。
正如到目前为止所描述的，至今还没有在实践中应用与酵母絮凝有关的已经尝试的那些基因来改善酵母的絮凝能力。
在这些情况下，本发明的目的在于下列方面(1)提供具有赋予酵母以啤酒酵母型絮凝特性的活性的蛋白质(2)提供编码蛋白质的DNA链，所述蛋白质具有赋予酵母以啤酒酵母型絮凝特性的活性(3)提供生产利用上述DNA链赋予或增强啤酒酵母型絮凝特性的酵母菌株的方法，或生产利用上述DNA链消除或降低了啤酒酵母型絮凝特性的酵母菌株的方法，以及利用上述方法赋予、增强、消除或降低了啤酒酵母型絮凝特性的酵母菌株；(4)提供了通过抑制上述DNA链的表达而消除或降低酵母菌株的啤酒酵母型絮凝特性的方法；和(5)提供了生产酿造产品的方法，包括培养上述酵母菌株并提供了用所述方法得到的酿造产品。
发明公开为了解决上述问题，本发明人已经对底部发酵啤酒酵母的絮凝特性进行了广泛深入的研究。结果，本发明人确定存在与FL01同源的絮状底部发酵酵母特异性含有的基因(下文称为“Lg-FL01(基因)”)，并阐明了Lg-FL01基因与絮凝特性之间的关系。
随后，本发明人通过导入Lg-FL01，而使因破坏了FL01而成为非絮状的酵母菌株生产了Lg-FL01基因产物。结果，本发明人发现通过导入Lg-FL01基因可以诱导啤酒酵母型絮凝作用。这一发现不仅暗示了啤酒酵母型絮凝特性的赋予，还表明可以将具有实验室型絮凝特性的酵母菌株转变成具有啤酒酵母型絮凝特性的酵母菌株。此外，本发明人还确定了在酵母中控制啤酒酵母型絮凝作用的Lg-FL01基因产物的区域。另外，本发明人还成功地通过导入被破坏的Lg-FL01基因而将絮状啤酒酵母菌株转变成非絮状菌株。如此，本发明得以完成。
本发明提供了基本上具有序列表SEQ ID NO1中所示氨基酸序列的Lg-FL01基因产物；或基本上含有序列表SEQ ID NO1中所示氨基酸序列并具有赋予酵母以啤酒酵母型絮凝特性的活性的肽；或含有一种具有赋予酵母以啤酒酵母型絮凝特性的活性的多肽的蛋白质， 所述多肽具有基本上如序列表SEQ ID NO1中所示的部分氨基酸序列，含从位置25至位置213的氨基酸残基；或含有一种具有赋予酵母以啤酒酵母型絮凝特性的活性的多肽的蛋白质，所述多肽具有基本上如序列表SEQ ID NO1中所示的部分氨基酸序列，含至少从位置25至位置97的氨基酸残基；以及具有赋予酵母以啤酒酵母型絮凝特性的活性并基本上含有序列表SEQ ID NO2中所示氨基酸序列的多肽。所用的术语“基本上”指氨基酸序列可以有一个或数个氨基酸残基缺失、取代、加入、聚合等，只要该氨基酸序列具有赋予酵母以啤酒酵母型絮凝特性的活性即可。
另外，本发明提供含有编码基本上如序列表SEQ ID NO1中所示氨基酸序列的核苷酸序列的DNA链，或编码多肽的核苷酸序列的DNA，所述多肽具有基本上如序列表SEQ ID NO1中所示氨基酸序列的部分，含位置25至位置213的氨基酸残基；或编码多肽的核苷酸序列的DNA，所述多肽具有基本上如序列表SEQ ID NO1中所示氨基酸序列部分，含至少从位置25至位置97的氨基酸残基。所用的术语“基本上”指氨基酸序列可以有一个或数个氨基酸残基缺失、取代、加入、聚合等，只要该氨基酸序列具有赋予酵母以啤酒酵母型絮凝特性的活性即可。
另外，本发明还提供含有编码一氨基酸序列的核苷酸序列并具有序列表SEQ ID NO3中从位置59至位置697的部分核苷酸序列的DNA或与其互补的DNA，所述氨基酸序列具有赋予酵母以啤酒酵母型絮凝特性的活性；含有编码一氨基酸序列的核苷酸序列并具有序列表SEQID NO3中从位置1 31至位置697的部分核苷酸序列的DNA或与其互补的DNA，所述氨基酸序列具有赋予酵母以啤酒酵母型絮凝特性的活性；含有序列表SEQ ID NO3中从位置131至位置349的部分核苷酸序列的DNA或与其互补的DNA；以及含有序列表SEQ ID NO4中所示核苷酸序列并编码多肽的DNA或其互补DNA，所述多肽具有赋予酵母以啤酒酵母型絮凝特性的活性。
本发明还提供插入到质粒KTYT2，YESKT2，KNWtC3或KNYES中并含有编码一蛋白质的核苷酸序列的DNA以及含所述DNA的质粒，所述蛋白质具有赋予酵母以啤酒酵母型絮凝特性的活性。
此外，本发明提供啤酒酵母型絮凝特性已经被赋予或增强的酵母菌株的制备方法，其特征在于将上述DNA导入其中。本发明还提供啤酒酵母型絮凝特性已经被消除或降低的酵母菌株的制备方法，其特征在于将一DNA导入其中，通过破坏所述DNA而消除或降低其表达具有赋予啤酒酵母型絮凝特性的活性蛋白质的能力。
另外，本发明还提供用上述方法的一制备的且其中啤酒酵母型絮凝特性已经被赋予，增强，消除或降低的酵母菌株。
本发明还通过抑制上述DNA的表达而提供消除或降低酵母的啤酒酵母型絮凝特性的方法。
另外，本发明提供包括培养上述酵母菌株的用于生产酿造产品的方法以及用所述方法得到的酿造产品。
附图简述

图1表示啤酒酵母菌株和其减数分裂分离子Southern和Northern分析中的电泳结果(照片)。
图2表示Lg-FL01基因的限制图谱。
图3表示通过反向PCR全长克隆Lg-FL01基因的概念图。
图4表示Lg-FL01全长片段的限制图谱。
图5表示构建Lg-Sc嵌合FL01基因的概念图。
图6图示说明用于破坏Lg-FL01基因的质粒的构建。
图7图示(续)说明用于破坏Lg-FL01基因的质粒的构建。
图8表示分别由Lg-FL01基因和Sc-FL01基因推导的N-末端氨基酸序列的比较。
图9表示在具有各种修饰的FL01基因的那些菌株中的絮凝表型。
完成本发明的最佳方式下面将详细说明本发明。
应注意到本文所用的术语“DNA”，“核苷酸序列”，“基因”和“DNA链”具有基本上相同的含义。另外，还应注意到本文所用的术语“氨基酸序列”“肽”和“蛋白质”也具有基本上相同的含义。
<酵母中的细胞间絮凝>
已经知道酵母中的细胞间絮凝作用归因于细胞和α细胞之间的性絮凝作用，从母细胞芽出的子细胞不分离，非性絮凝等等。在这些因素中本发明的目标在于控制非性絮凝。
作为解释非性絮凝机制的一种方式，外源凝集素假设很有力，即相邻的两个酵母细胞通过絮状酵母细胞表面层外源凝集素样蛋白质与糖链的连接而彼此相互作用[细菌学杂志，150，878(1982)]，但尚未鉴定出所述外源凝集素样蛋白质。这是控制酵母絮凝仍很困难的原因的一。
已经报道根据抑制絮凝的糖的种类可以粗略地将非性絮凝分成两类，即甘露糖特异性F101型絮凝和由除甘露糖外，还由麦芽糖，葡萄糖等抑制的NewFlo型絮凝[酵母，7，559(1991)]。本发明人已经发现可以将普通底部发酵酵母的絮凝特性分类成NewFlo型。为了便于理解，用下列术语表达这些絮凝特性。
简而言之，本文用术语“实验室酵母型絮凝特性”表示由共存的甘露糖，而不由麦芽糖和葡萄糖抑制的普通实验室酵母的絮凝特性。另一方面，用术语“啤酒酵母型絮凝特性”表示由普通底部发酵啤酒酵母所代表的那些酵母菌株的絮凝特性，所述絮凝特性除由共存的甘露糖抑制外，还由麦芽糖，葡萄糖等抑制。这两类絮凝特性均不受半乳糖的抑制。本发明人认为底部发酵啤酒酵母具有“啤酒酵母型絮凝特性”很重要，至少在啤酒酿造中，其原因如下。简要地说，这种“啤酒酵母型絮凝特性”与实验室酵母的絮凝特性有很大的不同，前者被葡萄糖，麦芽糖等所抑制。啤酒是由啤酒酵母发酵麦芽汁产生的。由于在麦芽汁中含有约6％的麦芽糖和约1％的葡萄糖，所以这些糖抑制啤酒酵母的絮凝作用有着重要的意义。换句话说，可以作如下猜想。由于“啤酒酵母型絮凝特性”特征，将啤酒酵母加到麦芽汁中就会由其中所含的糖防止其发生絮凝从而能够分散到麦芽汁中。因此，发酵过程进展迅速，而且当在发酵的麦芽汁中糖浓度在发酵后期降低时，对絮凝的抑制作用会变弱。结果，酵母细胞形成絮凝物并沉淀以使其容易回收。
<Lg-F101蛋白质>
Lg-F101蛋白质是由FL01-同源的基因，即Lg-F101基因所编码，为表现出啤酒酵母型絮凝特性的底部发酵啤酒酵母及其其减数分裂分离子所特有。
本发明包括Lg-F101蛋白质和其衍生物。Lg-F101蛋白质可以从酵母特别是啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中得到，而且它具有能够赋予酵母以啤酒酵母型絮凝特性的特征。Lg-F101蛋白质在其氨基酸序列中含有基本上如序列表SEQ ID NO1中所示的氨基酸序列。“基本上如序列表SEQ ID NO1中所示的氨基酸序列”除“序列表SEQ ID NO1中所示的氨基酸序列”外，还包括含有修饰，即一个或多个氨基酸残基增加、插入、缺失或取代的SEQ ID NO1的氨基酸序列，只要所述氨基酸序列赋予酵母以啤酒酵母型絮凝特性即可。
本发明“序列表SEQ ID NO1中所示的氨基酸序列”与从实验室酵母FL01基因已知的核苷酸序列推导的氨基酸序列有一些同源性。然而，这两者之间决定性的不同之处在于，含有本发明“序列表SEQ IDNO1中所示的氨基酸序列”的Lg-F101蛋白质和其衍生物能够赋予酵母以上述对于啤酒酵母很重要的“啤酒酵母型絮凝特性”。在本发明完成后，这是第一次表明Lg-F101蛋白质和其衍生物能够赋予酵母以“啤酒酵母型絮凝特性”。
就从絮状啤酒酵母细胞表面层得到的蛋白质flocculin而言，其生物学功能尚未阐明，但已经确定了其N-末端16个残基的氨基酸序列(*TQACLPVG*RKNGMN*代表未确定的氨基酸残基)[应用环境微生物学，60，2754(1994)]。由本发明首次阐明功能的Lg-F101蛋白质包括所述的氨基酸序列(从序列表SEQ ID NO1中位置25至位置40)。目前，没有证据表明本发明的Lg-F101蛋白质与flocculin相同。但是，本发明的Lg-F101蛋白质还有一种极大的可能性，就是由SEQ IDNO1中位置1至位置24氨基酸序列所代表的区域是Lg-F101蛋白质被定位于细胞表面层所必需的分泌信号序列。因此，推测位于絮状酵母细胞表面层并具有赋予酵母絮凝特性的活性的蛋白质是含有序列表SEQ ID NO1从位置25到末端的氨基酸序列的蛋白质。
<Lg-FL01基因>
本发明包括Lg-FL01的DNA链。本文所用的术语“Lg-FL01的DNA链”指含有一段核苷酸序列的DNA，所述核苷酸序列编码具有赋予酵母以啤酒酵母型絮凝特性的活性的Lg-F101蛋白质或其衍生物。
更具体地说，本发明包括含有编码一种蛋白质的核苷酸序列的DNA链，所述蛋白质含有基本上如序列表SEQ ID NO1中所示的氨基酸序列。在此，应注意“编码含有氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列”这种表述意味着由于遗传密码简并性而可以产生的所有不同的核苷酸序列。
完成本发明不可缺少的是在实施例1中描述的发现，即表现啤酒酵母型絮凝特性的底部发酵酵母菌株和其减数分裂分离子有与众不同的FL01同源基因。在本发明说明书中，用术语“Lg-FL01基因”表示“表现啤酒酵母型絮凝特性的底部发酵酵母和其减数分裂分离子与众不同的FL01同源基因”。但是仅仅上述发现并不能导致“Lg-FL01基因”具有赋予酵母以“啤酒酵母型絮凝特性”的活性。还需要其他努力来完成本发明。
从另一点看，本发明还包括插入到质粒KTYT2中并含有编码一种蛋白质的核苷酸序列的DNA，所述蛋白质具有赋予酵母以啤酒酵母型絮凝特性的活性。
在下文中，上述本发明的DNA统称为“Lg-FL01 DNA”链。
本发明的Lg-FL01 DNA链可以是天然产生的DNA，完全合成的DNA，或用天然产生的DNA的一部分合成的部分合成的DNA。
<转化>
通过导入本发明的Lg-FL01基因DNA链，可能得到啤酒酵母型絮凝特性已经被赋予或增强的酵母菌株。
就导入所述Lg-FL01 DNA链的方法而言，根据常规标准可以使用在遗传工程领域中常规使用的标准技术[参见如，分析生物化学163，391(1987)]。所述方法的具体实例包括如将所需DNA插入到载体中，然后将其导入到酵母细胞中的方法，和将所需DNA直接导入到酵母细胞中而不需插入到载体中的方法。
在前一种方法中，将所需DNA插入到载体中，然后导入到酵母细胞中可以用于此目的的载体包括例如，YRp载体(一种使用酵母染色体的ARS序列为其复制原点的酵母多拷贝载体)，YEp载体(一种含有酵母2μm DNA的复制原点的酵母多拷贝载体)，YCp载体(一种含有酵母染色体的ARS序列为其复制原点并还含有酵母染色体着丝粒序列的酵母单拷贝载体)和YIp载体(一种整合到酵母染色体中，不含有酵母复制原点的载体)；可以使用任何已知的载体。在文献(见“新的酵母生物技术”，医学出版中心，p.284)中公开了这些载体而且很容易制备。
就将DNA直接导入到酵母细胞中而不需将所述DNA插入到载体中的代表性技术而言，可以使用共转化方法，其中用含有标记基因(如一种药物抗性基因)和待导入的DNA序列的质粒共转化酵母细胞(日本已审查的专利公开No.5-60918)。
在上述的方法中，为了在酵母中表达导入的DNA序列或增强或减弱其表达，分别将启动子(控制转录和翻译的单位)和终止子插入到本发明DNA链的5’上游区和3’下游区。对于上述目的的启动子和终止子而言，除得自Lg-FL01基因本身的外，还可以使用得自已知基因如醇脱氢酶基因[生物化学杂志257，3018(1982)]，甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因[生物化学杂志254，9839(1979)]的那些，或通过人工改进它们而得到的那些。更具体地说，可以使用以下启动子和终止子如ADH(也称为ADC)，GAPDH(也称为GPD)，PHO，GAL，PGK，ENO，TRP和HIP。
另外，通过选择适当的启动子，可以以可控制的方式使含有本发明DNA链的基因在酵母细胞中表达。例如，若使用来自半乳糖激酶基因的启动子，通过改变培养基的糖源，例如从葡萄糖到半乳糖，就可以提高所述基因的表达。
此外，通过导入经破坏Lg-FL01基因而消除或减弱了Lg-F101蛋白质表达能力的DNA，可以得到其絮凝特性已经被消除或减弱了的酵母菌株。Lg-FL01基因的破坏可以通过在Lg-FL01基因中与Lg-F101蛋白质表达有关的区域内(比如启动子区或编码区)加入或删除一个或多个碱基，或通过删除整个所述区域而达到。可以用与上述DNA导入相同的技术，将通过破坏Lg-FL01基因而消除或减弱了Lg-F101蛋白质表达能力的DNA导入到酵母细胞中。考虑如下。通过所述DNA的导入，在宿主酵母细胞的染色体DNA中的Lg-FL01基因和被导入的DNA之间发生同源重组，从而打断宿主细胞的Lg-FL01基因。这导致消除或减弱了表达Lg-F101蛋白质的能力，结果，消除或减弱了宿主酵母细胞的絮凝特性。
被转化的酵母菌株，即本发明中的宿主酵母菌株可以是分类上分成酵母的任何菌株。对于本发明的所述目的，属于啤酒酵母的工业酵母，更具体地说，啤酒酵母，葡萄酒酵母或用于酒精生产的酵母是优选的。
本发明还包括通过抑制上述Lg-FL01基因表达而消除或减弱酵母絮凝特性的方法。该方法的具体实例包括导入通过破坏Lg-FL01基因，而消除或减弱表达Lg-F101蛋白质的能力的DNA的方法，反义RNA法等。
本发明还包括在实施例1(6)中所描述的，通过用上述Lg-FL01基因取代实验室型FL01基因而将实验室酵母型絮凝特性转变成啤酒酵母型絮凝特性的方法。还可以用本发明提供的Lg-FL01基因DNA进行反向转变。
通过包括培养本发明酵母菌株的方法而生产的酿造产品包括酒精饮料如啤酒，日本清酒，低级的蒸馏酒精，葡萄酒，威士忌和白兰地；调味品如酱油，豆酱和甜清酒；燃料酒精。就生产酿造产品的本发明方法而言，还包括与上述酿造产品有关的酿造方法。
在下文中，本发明将参考下列实施例作详细的描述，所述实施例不应构成对本发明范围的限制。
实施例1与啤酒酵母型絮凝密切相关的FL01同源基因的克隆(1)寻找与啤酒酵母絮凝特性有关的基因为了寻找与啤酒酵母絮凝特性有关的基因，要完成下列实验。从絮状啤酒酵母菌株KI084中，用Stewart等人的方法[酿造工业杂志，93，216-219，(1987)]形成孢子，由此制备染色体数目减少了的菌株(下文称为“减数分裂分离子”)。对于所得的减数分裂分离子，在20℃静止条件下，在表1所列的培养基中将6个菌株培养48小时。培养后，离心收集细胞，用0.1M EDTA洗涤两次，用水洗涤两次，然后重悬在无菌水中。用下列方法判断细胞的絮凝特性。简而言之，将细胞悬浮在絮凝测量缓冲液(50mM乙酸钠，0.1％氯化钙，pH4.6)中使最终OD值达到OD600＝2.0，在室温下放置30分钟，然后剧烈搅拌20秒。将细胞静止放置5分钟，用肉眼判断絮凝或非絮凝。结果，将受试的6个减数分裂分离子菌株分成2个非絮状菌株和4个絮状菌株。
用于絮凝测量的培养基半乳糖 50g/lYNB w/o AA&AS*1.7g/l氨基酸天冬氨酸 100mg/ml谷氨酸100mg/ml苏氨酸100mg/ml丝氨酸100mg/ml赖氨酸盐酸盐 100mg/ml精氨酸100mg/ml*酵母氮碱不包含氨基酸，也不包含硫酸铵。在培养转化体时，使用以20 mg/ml的速率用腺嘌呤硫酸，色氨酸和组氨酸盐酸盐补充的上述培养基。
按下述方法对这些菌株进行Southern分析和Nouthern分析。根据Hereford等人的方法[Cell，18，1261-1271，(1979)]，在30℃ YPD培养基(2％bacto胨(Difco)，1％酵母提取物(Difco)，2％葡萄糖)中振荡培养细胞，然后从到达静止期的细胞中提取总DNA，从而完成总DNA的提取。用HindIII(贝林格尔·曼海姆分司)消化两微克提取的DNA，然后用1％琼脂糖凝胶电泳。将所述DNA印迹到尼龙滤纸Hybond N+(Amersham)上(按所附的方法说明)，随后进行Southern分析。另一方面，按Villeneve和Meyer[细胞，48，25-37(1987)]的方法，在20℃表1所列的培养基中，于静止条件下将这些菌株培养48小时，然后提取总RNA，从而完成总RNA的提取。通过在16μl乙二醛/DMDO溶液[1M乙二醛，50％DMSO，10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)]中，于50℃处理1小时将10μg由此将RNA乙二醛化。此后，向其中加入2μl的载样缓冲液[50％(w/v)甘油，10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)，0.4％(w/v)溴酚蓝]和1μl 1mg/ml溴化乙锭溶液，将所得溶液在含10mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)和1％琼脂糖的凝胶中电泳。在所述的电泳过程中，用一泵使在电泳层中的缓冲液稳定地循环以避免产生pH梯度。当溴酚蓝到达凝胶的70％长时，终止电泳。然后，用紫外透射仪观察用溴化乙锭染色的凝胶中的RNA，用核糖体RNA作为指示剂确定未降解的RNA。此后，将凝胶中的RNA印迹到尼龙滤纸上，在80℃将印迹有RNA的滤纸处理2小时。然后，按附于Genscreen-Plus的方法对所述滤纸进行Northern分析。
按如下方法制备在Sorthern和Northern分析中用作探针的的FL01基因的部分长度DNA片段。以Teuissen等人[酵母，9，423-427(1993)]报告的FL01基因的核苷酸序列为基础，合成两个引物5’GATGAAACTGTCATTGTTGTCAAA3’和5’TCGTTTCAGCAGCTAAAGTAT3’。用这些引物，以絮状菌株ABXL-1D(a FL01酵母基因保藏中心)的DNA为模板完成PCR，在1％琼脂糖凝胶中电泳总PCR产物。从凝胶中切出1045bp的扩增的DNA片段(下文称为“FL01部分长度的片段)并用Prep-A-Gene(Bio-Rad)回收所述片段。用[α-32p]dCTP(Amersham)标记所述片段，并用作探针。用X射线胶片完成放射性检测。
在图1中列出了结果。作为Sorthern分析的结果，在亲本菌株KI084中检测到与FL01基因同源的四个HindIII片段，分别为约9.5kb，5.4kb，4.8kb和3.7kb。在这些片段中，在检测的所有KI084衍生的减数分裂分离子中均检测到约4.8kb和3.7kb这两个片段。另外，只有在絮状判断试验中判断为絮状的四个减数分裂分离子中，除检测到共有的带外，还检测到一个约9.5 kb片段。作为Northern分析的结果，只在亲本菌株和在絮状判断试验中判断为絮状的四个减数分裂分离子中观察到FL01基因的转录产物。从这些结果看出，在KI084衍生的减数分分离子中，与FL01基因同源的三个HindIII片段中的只有在约9.5kb的HindIII片段所含的部分或全长FL01同源基因被转录，而且只有具有所述同源基因的那些菌株表现出絮凝特性。在下文中，将在KI084菌株约9.5kb的HindIII片段中所含的部分或全部FL01同源基因称为Lg-FL01(较大型-FL01)。
(2)Lg-FL01的限制图谱的制备在KI084衍生的减数分裂分离子中，筛选一个絮状菌株KMS004和一个非絮状菌株KMS001。按上述方法制备其DNA，并用数种各自独立的限制酶或两种酶相组合以及上述部分FL01片段为探针进行Sorthern分析。结果，除观察到与非絮状减数分裂分离子共有的两个带外，在絮状KMS004菌株中总是观察到一个在非絮状减数分裂分离子中观察不到的带。认为在所述絮状减数分裂分离子特异性的该带中含有部分或全长Lg-FL01。因此，确定所述片段的长度并制备出如图2所示的限制图谱。
(3)含部分长度Lg-FL01的KpnI片段的克隆以图2的限制图谱为基础，克隆约5.6kb的KpnI片段。用KpnI(Boehringer Mannheim)完全消化从KI084衍生的絮状减数分裂分离子KMS004的DNA，然后用0.8％琼脂糖电泳分离。从凝胶中切出约5.6kb的DNA片段混合物，然后在透析管中通过电洗脱纯化。用上述FL01部分长度的片段为探针进行Sorthern分析的结果，确定在纯化的DNA片段混合物中含有所需的DNA片段。然后用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo)将用KpnI完全消化的质粒pUC18(TakaraShuzo)与纯化的DNA片段混合物相连，然后用所得的质粒转化大肠杆菌DH5α(BRL)。在所得的转化体中，用滤纸吸附的方法，将5000个菌株印迹到尼龙滤纸Hybond N+(Amsham)上，用所述FL01部分长度的片段作为探针完成菌落杂交，由此得达10个阳性菌株。用碱法，从这些菌株中制备质粒并用限制酶分析。结果，确定在从这些菌株得到的质粒中均含有相同的插入片段。用絮状减数分裂分离子KMS004和非絮状减数分裂分离子KMS001的DNA作为对照，对从上述菌株的一中得到的质粒pKF-KpnI的插入片段进行Southern分析。结果，可以确定，插入片段是所需的Lg-FL01基因的一部分。
(4)对含部分Lg-FL01长度的KpnI片段的核苷酸序列进行部分测序为了确定来自pKF-KpnI的插入片段的核苷酸序列，用用于千序列的缺失试剂盒(Takara Shuzo)，按照试剂盒所附的方法，制备pKF-KpnI插入片段的缺失系列。用DNA测序仪(Perkin Elmer)确定核苷酸序列。用DNASIS(日立软件工程)分析核苷酸序列。从两个方向确定在与已知FL01编码区同源的编码区中，KpnI位点至HindIII位点2.9kb的核苷酸序列。在确定的核苷酸序列中，从Lg-FL01编码区的中部到终止密码子有一2.6kb的ORF。
(5)用反向PCR得到全长Lg-FL01在图3中列出了用反向PCR得到全长Lg-FL01的一般方法。从以前确定的Lg-FL01部分长度的核苷酸序列[图3中的(1)]，合成引物5[5’AATACACAACATGGTGTCCT3’，图3中(2)]和引物8[5’AACAGAGGTGGAACTACTGG3’，图3中(3)]。用300单位HindIII(Boehringer Mannheim)消化来自絮状减数分裂分离子菌株KMS004的DNA(60μg)，用乙醇沉淀回收，然后溶在30μlTE缓冲液中。用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo)以300μl的规模完成DNA片段的自我连接。结果，期望在所得的反应产物中存在连接了图3中由(4)和(5)所示的HindIII位点的环状分子。用乙醇沉淀回收这些环状分子。用4μg这些反应产物作为模板，用上述引物5[图3中(2)]和引物8[图3中(3)]为引物，用LA-PCR试剂盒(Takara Shuzo)完成反向PCR。在所述试剂盒所附的方法中说明了反应溶液的组分。用DNA Thermal Cycler 480(Perkin Elmer)按如下程序完成反应在94℃用1分钟完1个循环，然后在98℃20秒和在68℃10分钟完成30个循环。用0.8％琼脂糖电泳所述反应产物，观察到扩增了约8.2kb，约3.6kb和约3.0kb的片段。
在这些DNA片段中，从凝胶中切出约8.2kb[图3中(6)]，然后用Prep-A-Gene(Bio-Rad)按所附的说明纯化。由于该片段含有在图2的图谱中所表明的BamHI，EcoRI和XbaI位点，判断在该片段中还有一个尚未得到的Lg-FL01部分。用AluI(Boehringer Mannheim)消化该DNA片段，与pUC118(Takara Shuzo)的HincII位点连接，然后导入到大肠杆菌DH5菌株(Toyobo)中。从30个所得的转化体中制备质粒，确定插入片段的大小。结果，可以将这些质粒分成24组。就这些质粒而言，用上述方法确定插入片段的核苷酸序列。结果得到一个含有一467 bp插入片段的克隆，所述片段与已知FL01的氨基末端部分高度同源。将该质粒称为KF1。在图3中由(7)表示KF1插入片段在染色体中的位置。
然而，KF1插入片段并不含有似乎是翻译起始位点的序列。以KF1的核苷酸序列为基础，合成引物KN-2[5’TTGTATCGGAGTATTTATA3’，图3中(8)]。随后，用在上述反向PCR中所用模板，用上述引物5[图3中(2)]和引物KN-2[图3中(8)]为引物，用GeneAmp PCR Reagent试剂盒(Takara Shuzo)完成反向PCR反应。在所述试剂盒所附的方法中说明了反应溶液的组分。用DNA Thermal Cycler 480按如下程序完成反应在94℃1分钟，55℃2分钟，并在72℃2分钟完成30个循环，接着在72℃10分钟完成1个循环。用0.8％琼脂糖电泳反应产物的，发现扩增了约4.4kb，约1.1kb和约0.6kb的DNA片段。在这些片段中，从凝胶中切出约4.4kb的片段[图3中(9)]，用上述方法纯化，用Klenow片段(TakaraShuzo)制成平整末端，与pUC118的HincII位点连接，然后导入大肠杆菌DH5菌株中。KF14(得到的转化体的一的质粒)在图2中所示限制图谱中表明含有BamHI，EcoRI和XbaI位点。因此，判断该片段内含有Lg-FL01的翻译起始位点和其5’上游区。
为了确定KF14 EcoRI位点[图3中(10)表示]到3’插入片段的部分核苷酸序列，用EcoRI消化KF14，然后构建自我连接的质粒KF14ΔEc。该质粒含有从图3中(10)代表的EcoRI位点到由图3中(8)代表的引物KN-2的退火位点的片段。从EcoRI位点确定部分KF14ΔEc插入片段的核苷酸序列。以所得的核苷酸序列为基础，合成引物KT5’Ec[5’AGCGGTCGACCTAATAAAGGAAAAGGGGAA3’，图3中(11)]。以前确定的pKF-Kpn11插入片段的部分核苷酸序列为基础，合成引物KT3’Hd[5’GGAAGCTTTTTTGTAAAACAGATTTTTTGCCCCGCTT3’，图3中(12)]。用这两个引物并用来自絮状减数分裂分离子菌株KMS004的2μg DNA为模板，用LA-PCR试剂盒完成PCR。按如下程序完成反应在94℃1分钟完成1个循环，在98℃20秒并在68℃10分钟完成30个循环。用0.8％琼脂糖电泳反应产物，发现扩增了约9kb[图3中(13)]的DNA片段。由该片段含有在图2所示限制图谱中所标明的BamHI和XbaI位点，所以判断在该片段内含有全长Lg-FL01。在下文中，将该PCR片段称为Lg-FL01全长片段。用数种限制酶消化Lg-FL01全长片段，然后用0.8％琼脂糖凝胶将所得的消化产物电泳。确定限制片段的大小，制备限制图谱。图4中列出了Lg-FL01全长片段的限制图谱。
(6)将Lg-FL01全长片段导入到酵母中并表征絮凝特性就用于检验因Lg-FL01的导入而产生表型改变的酵母菌株而言，使用KY644菌株，它是通过下列方法而制备的FL01被破坏了的菌株。简而言之，将部分长度的FL01片段连接在pRS405(Stratagene)的BamHI和HindIII位点之间。在只存在于插入片段中的BstEII位点切割该质粒，然后用锂方法导入到絮状酵母菌株KY642(a，ura3，1eu2，FL08)中，由此得到因在FL01座位同源重组而成为非絮状的菌株。用Southern分析确定通过pRS405的导入已破坏了该菌株的FL01基因。将该菌株称为KY644菌株。
用引物PCR扩增Lg-FL01全长片段，要设计引物以得到在5’有一SalI位点，在3’有一HindII位点的片段。就克隆载体而言，使用pYT37，该载体是通过将下列两个片段导入到YIp5的EcoRI位点而得到的含有从Entrez(生物技术信息国家中心)(DNA序列数据库)得到的CEN3核苷酸序列和以酵母染色体3’的全部核苷酸序列为基础，经PCR得到的1.2 kb的CEN3的片段以及含有作为YRP7衍生的EcoRI-HindIII片段而得到的ARS序列的片段。将Lg-FL01全长片段连接到pYT37的SaH和HindIII之间，然后用锂方法直接导入到KY644菌株中。
将来自所得转化体的DNA进行Southern分析。结果确定在一个菌株中导入了全长Lg-FL01片段。将在该菌株(称为KY650)中所含的质粒命名为KTYT2。关于KY650菌株和通过只将载体pYT37导入KY650而得到的菌株(命名为KY652)，在20℃于表1所示的培养基中，振荡培养到达静止期后，用以前描述的方法完成絮凝特性的表征。为了检测通过糖对絮凝的抑制作用，以1M的终浓度将糖加到絮凝测量缓冲液中。结果列在表2中。
表2导入了全长Lg-FL01片段的酵母菌株的絮凝特性菌株KY650KY652(对照)无糖 + -甘露糖- -葡萄糖- -麦芽糖- -半乳糖+ -果糖 - -“+”表示絮状， “-”非絮状。
尽管KY652在任何条件下均不表现絮凝特性，但是含Lg-FL01全长片段的KY650菌株在不加入糖时，在絮凝测量缓冲液中表现出絮凝特性。这种絮凝特性受甘露糖，葡萄糖和麦芽糖的抑制，受一点果糖的抑制，但不受半乳糖的抑制。从这些结果得出结论，通过导入Lg-FL01全长片段，可能赋予实验室酵母以啤酒酵母型絮凝特性。
实施例2 用PCR得到Lg-FL01的编码区，将Lg-FL01导入到实验室酵母中并评价关于在KF14插入片段中与载体相连部分的邻接区，用上述方法确定核苷酸序列。结果，在KF1插入片段5’上游49bp处，发现了一个位点，似乎是Lg-FL01的翻译起始位点。以向3’的方向，从该密码子5’上游58bp合成PCR引物KTF7[5’CCCCAAGCTTGCTCTGCAGTAAATTCCGCA3’，图3中(14)]。再以前确定的pKF-Kpn11插入片段的核苷酸序列为基础，以向5’的方向，从Lg-FL01编码区终止密码子3’下游53bp合成PCR引物KTORFA[5’CGGAATTCTAAACACTATAAGCGTGATGATAG3’，图3中(15)]。用这两个引物，并用2μg絮状减数分裂分离子菌株KMS004的DNA为模板，用LA-PCR试剂盒完成PCR。通过在94℃30秒，在60℃1分钟，在72℃3.5分钟重复30个循环而完成反应。用0.8％琼脂糖电泳反应产物，观察到扩增了约5.8kb[图3中(16)]的DNA片段。下文，将该PCR产物称为Lg-FL01ORF片段。用引物PCR扩增Lg-FL01ORF片段，所述引物经设计含有在5’末端有一HindIII位点并在3’末端有一EcoRI位点的片段。用HindIII和EcoRI消化该片段，然后，连接在酵母表达载体pYES2(Invitrogen)的HindIII和EcoRI之间，以便将所述片段以有义方向插入到GAL1启动子的下游。然后，用上述锂方法直接将所述载体导入到KY644菌株。对来自所得转化体的DNA进行Southern分析，将经确定其中导入了Lg-FL01ORF片段的菌株命名为KY646菌株。另外，将在KY646菌株所含的质粒命名为YESKT2。关于KY646菌株和通过只将载体pYES2导入KY644而得到的菌株(命名为KY649)，在20℃于表1所示的培养基中，将其振荡培养到达静止期后，用以前描述的方法完成絮凝特性的表征。为了检测通过糖对絮凝的抑制作用，以1M的终浓度将糖加到絮凝测量缓冲液中。结果列在表3中。
表3导入了GAL1启动子控制的Lg-FL01ORF片段的酵母菌株的絮凝特性菌株KY646KY649(对照)无糖 + -甘露糖- -葡萄糖- -麦芽糖- -半乳糖+ -果糖 - -“+”表示絮 状，“-”表示非絮状。
尽管在任何条件下，KY649菌株都不表现出絮凝特性，但是在不加入糖时，在絮凝测量缓冲液中，含Lg-FL01ORF片段的KY646菌株表现出絮凝特性。该絮凝特性与KY650菌株的，啤酒酵母型絮凝特性相似。换句话说，该絮凝特性受甘露糖，葡萄糖和麦芽糖的抑制，有一点受果糖的抑制，但不受半乳糖的抑制。从这些结果可以得出结论，通过导入受FAL1启动子控制的Lg-FL01ORF片段，可以赋予实验室酵母以啤酒酵母型絮凝特性。换句话可以得出结论，Lg-FL01基因的编码区存在于Lg-FL01ORF片段中。
实施例3鉴定在Lg-FL01中控制啤酒酵母型絮凝作用的区域为了鉴定在Lg-FL01中控制啤酒酵母型絮凝作用的区域，用图5中所示的方法，产生由Lg-FL01和Sc-FL01(用Watariet al.，公开的实验室酵母型FL01，Yeast，10，211-225(1994))组成的嵌合基因并研究其絮凝特性。用XhoI和KpnI消化Lg-FL01ORF片段，用Klenow片段制成平整末端，然后克隆到pUC118的HincII位点。在所得的转化体中，筛选含有约2kb插入片段的克隆并确定插入片段的核苷酸序列。以所述结果为基础，合成引物KTF8(5’CGGGATCCATCTGGCAATACCACACTAACA3’)，从Lg-FL01起始密码子3’下游639 bp向5’延伸。用引物KTF7和引物KTF8，并用2μg来自絮状减数分裂分离子菌株KMS004的DNA用LA-PCR试剂盒完成PCR。通过在94℃30秒，在60℃1分钟，在72℃3.5分钟重复30个循环而完成反应。用0.8％琼脂糖电泳反应产物，观察到扩增了约0.7kb片段[图3中(16)]。下文，将PCR片段称为Lg-FL01N-末端片段。将所得的片段克隆到作为PCR产物克隆载体的pT7Blue(Novagen)中。用所得的四个独立的克隆，从两个方向确定其插入片段的核苷酸序列。发现所有四个克隆均含有相同的插入片段。在SEQ ID NO3中列出了所得的核苷酸序列。将其中一个克隆命名为KNTA1。用PCR扩增得自Lg-FL01 N-末端片段，设计所用引物以得到在5’有HindIII和在3’末端有BamHI位点的片段。用HindIII和BamHI消化KNTA1，然后经电泳从凝胶中切出从载体中分离的插入片段，用上述方法纯化，然后克隆到pYES2的HindIII-BamHI位点中以便以有义方向将所述片段插入到GAL1启动子的下游。将含该质粒KNYNS的大肠杆菌EKB707于1995年1月27日保藏在国家生命科学与人类技术协会，工业科学和技术社(1-3，Higashi 1-Chome，Tsukuba City，Ibaragi Pref.，日本)，保藏号为FERM BP-4983。
以实验室酵母型FL01基因(下文称为“Sc-FL01基因”)的核苷酸序列(Watari等公开的)[酵母，10，211-225(1994)]为基础，合成从起始密码子3’下游721bp向3’延伸的引物WtF1N(5’CGGGATCCACTGTAAGTGATGACTTCGAAG3’)和从终止密码子的3’下游58bp向5’延伸的引物FLID4(5’CGGAATTCTCAGCGTATAATTAGCAAAGAA3’)。用这些引物并用来自ABXL-1D菌株的2μg DNA为模板，用LA-PCR试剂盒完成PCR。通过在94℃30秒，在60℃1分钟和72℃3.5分钟重复30个循环而完成反应。用0.8％琼脂糖电泳反应产物，观察到扩增了约3.9kb片段。下文，将该片段称为Sc-FL01C-末端片段。用PCR扩增Sc-FL01C-末端片段，设计所用引物以得到在5’末端含BamHI，在3’末端含EcoRI的片段。用BamHI和EcoRI消化该片段，然后连接到以前构建的KNYES的BamHI和EcoRI之间，以便将所述片段以有义方向插入在Lg-FL01的N-末端片段的下游。结果，构建了编码嵌合FL01蛋白质的基因，其中对应于氨基末端到位置339氨基酸序列的Sc-FL01编码区已经被对应于氨基末端到位置312氨基酸序列的Lg-FL01基因所取代。用锂方法将所述连接反应产物直接导入到所述的KY644菌株中。对来自所得转化体的DNA进行Southern分析。确定导入了嵌合基因的那些菌株，所述嵌合基因由Lg-FL01 N-末端片段和Sc-FL01 C-末端片段组成，将一个菌株命名为KY648菌株。还将在该菌株中的质粒命名为KNWtC3。
此外，合成引物FLID1(5’CCCCAAGCTTTCGTTTGATGTAAGCTCTCT3’)，从Sc-FL01起始密码子的5’上游69bp向3’方向延伸。用引物FLID1和引物FLID4并用来自ABXL-1D菌株的2μg DNA为模板，用LA-PCR试剂盒完成PCR。通过在94℃ 30秒，在60℃ 1分钟， 并在72℃ 3.5分钟重复30个循环完成反应。用0.8％琼脂糖电泳反应产物，观察到扩增了约4.8kb片段。下文，将该片段称为Sc-FL01ORF片段。用PCT扩增Sc-FL01 ORF片段，设计所有引物得到在5’有HindIII和在3’有EcoRI的片段。用HindIII和EcoRI消化该片段，然后连接在pYES2的HindIII和EcoRI之间，以便以有义方向将所述片段插入GAL01启动子的下游。用锂方法将所得载体直接导入到所述KY644菌株中。对来自所得转化体的DNA进行Southern分析。确定导入了Sc-FL01 ORF片段的菌株，将一个菌株命名为KY647菌株，并用于絮凝特性的比较。将在该菌株中所含的质粒命名为YESWt1。
关于KY647菌株和以前描述的KY649菌株，在20℃于表1所示的培养基中，将其振荡培养到达静止期后，用以前描述的方法完成絮凝特性的表征。为了检测通过糖对絮凝的抑制作用。结果列在表4中。
表4导入了GAL1启动子控制的Lg-Sc嵌合FL01基因的酵母菌株的絮凝特性菌株 KY648 KY649(对照) KY647(比较)无糖 + - +甘露糖 - - -葡萄糖 - - +麦芽糖 - - +半乳糖 + - +果糖 - - +“+”表示絮状，“-”表示非絮状尽管在任何条件下，KY649菌株均不表现出絮凝特性，但是在不加入糖时，在絮凝测量缓冲液中，含由Lg-FL01 N-末端片段和Sc-FL01 C-末端片段组成的嵌合基因的KY648菌株和含Sc-FL01RF片段的KY647菌株表现出絮凝特性。与KY650的相似，KY648的絮凝特性受甘露糖，葡萄糖和麦芽糖的抑制，有一点受果糖的抑制，但不受半乳糖的抑制。另一方面，KY647的絮凝特性只受甘露糖的抑制，而不受葡萄糖，麦芽糖果糖或半乳糖的抑制。换句话说，尽管Sc-FL01ORF片段赋予实验室酵母型絮凝特性，但用嵌合基因赋予的絮凝特性被转变成啤酒酵母型，所述嵌合基因是通过用从起始密码子向3’延伸639 bp的Lg-FL01部分代替从起始密码子向3’延伸720 bp的Sc-FL01片段而制备的。从这些结果可以得出结论，与啤酒酵母型絮凝特性非常有关的是在Lg-FL01ORF片段中的Lg-FL01 N-末端片段，即在序列表SEQ ID NO3中所示的序列。
实施例4评价Lg-FL01受损的啤酒酵母(1)制备破坏Lg-FL01的质粒按图6和7制备破坏Lg-FL01的质粒。简而言之，用KpnI消化质粒pUC18，然后自我连接用Klenow片段补平的的DNA片段由此制备质粒pUC18ΔK。用HincII消化该质粒，然后将KpnI接头(GGGTACCC)插入到其中由此制备质粒pUC18±K。在该质粒的EcoRI和BamHI位点之间，插入来自质粒KF14的0.9kb EcoRI-BamHI片段，从而制备质粒pKF5B1。
从质粒pKF3HP得到1.7kb的BamHI和KpnI片段，然后将其插入到质粒pKF5B1的BamHI和KpnI位点之间由此制备质粒pKF53-1，质粒pKF3HP是通过将1.7kb的HincII-PvuII片段(含3’侧区)插入到pUC118的SmaI位点而制备的。
用SmaI消化质粒pSY114P(日本未审查专利公开No.2-265488)，然后将HindIII接头(CAAGCTTG)与其相连，所述质粒pSY114P含有来自酵母DGP(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因的启动子区(1.0kb)和来自酵母PGK(磷酸甘油酸激酶)基因的终止子区(0.4kb)。随后，用HindIII消化所述质粒，然后自我连接， 由此制备质粒pSY114H。将含杀稻瘟菌素S抗性基因的pSV2bsr(Funakoshi)的0.5kb HindIII片段插入到该质粒的HindIII位点以制备质粒pGPDBSR。用SaII消化该质粒，然后用Klenow片段补平，由此得到1.9 kb的DNA片段。将该DNA片段与通过用BamHI消化质粒pKF53-1然后Klenow片段补平而得到的DNA片段相连。
(2)啤酒酵母的转化通过电穿孔完成啤酒酵母的转化。在200ml YPD培养基中培养絮状啤酒酵母直到OD600达到大约7，用无菌水将其洗涤两次，再用1M山梨醇洗涤两次，然后重悬在1ml1M的山梨醇中。向50μl该酵母悬浮液中加入2.7μg用EcoRI消化质粒pKF53BRS而得到的DNA片段和10μg鲑精(DNA)(Sigma)，然后放5分钟。接着用0.2cm的Gene Pulser(Bio Rad)细胞，施加1.5KV，25μF和200Ω的电脉冲。向所得的悬浮液中加入1ml1M的山梨醇和400μl的YPD，然后在30℃振荡培养4小时。此后，将悬浮液放在含50μg/ml杀稻瘟菌素S(Funakoshi)的YPD培养基中，在30℃培养3天。将所得的转化体进行Southem分析，结果确定Lg-FL01基因受损。评价由此所得的Lg-FL01受损的啤酒酵母的絮凝特性，发现已经被转变成非絮状的。
实施例5推导的Lg-FL01和Sc-FL01 N-末端区的氨基酸序列的比较实施例3已经表明啤酒酵母型絮凝特性受Lg-FL01 N-末端区中213个氨基酸残基序列的控制。比较Lg-FL01和Sc-FL01该区推导的氨基酸序列。结果，如图8所示，在两种序列之间观察到下列差异。1)在Lg-FL01中，缺失了对应于Sc-FL01中从位置84位置110的27个氨基酸残基。2)基于Sc-FL01的位置123以前，Sc-FL01和Lg-FL01之间的同源性相当低。3)基于Sc-FL01的位置124和此后，Sc-FL01和Lg-FL01之间的同源性很高。
以这些结果为基础，制备由Sc-FL01和Lg-FL01以及修饰的Sc-FL01基因组成的嵌合基因，所述修饰的Sc-FL01基因缺失了从位置84至位置110的27个氨基酸残基。用在PCR试验手册[M.A.Inniset al.，(eds)，Takashi Saito编辑和翻译，HBJ Shuppan Co.，Ltd.(1991)第155-160页上描述的重组PCR方法制备这些修饰的FL01基因的N-末端。将修饰的FL01基因T-末端区的片段以有义方向连接在质粒KNWt3(在实施例3中描述的)的HindIII和BamHI位点之间(即GAL1启动子和Sc-FL01 C-末端片段)，然后导入到酵母KY644菌株中。基本上按实施例3中所述完成所得转化体的培养和絮凝特性的评价。含有嵌合FL01基因的那些菌株(KY707，KY708和KY709)与含有Sc-FL01的菌株(KY706)相似，表现出强的实验室酵母型絮凝作用，所述嵌合FL01基因直到位置46，68或83(以Sc-FL01为基础)的氨基酸残基的Lg-FL01-衍生的部分和在上述部分后Sc-FL01衍生的部分组成。另一方面，与在实施例3中的KY648和KY646相似，含有嵌合FL01基因的菌株表现出弱的啤酒酵母絮凝作用，所述嵌合FL01基因由以Sc-FL01为基础在位置124(以Lg-FL01为基础位置97)的氨基酸残基之前的Lg-FL01衍生的部分和在上述部分后Sc-FL01衍生的部分组成。此外，含有修饰的FL01基因的KY711有弱的实验室酵母型絮凝作用，所述修饰的FL01基因缺失了Sc-FL01从位置84到位置110的27个氨基酸。从这些结果看出，与啤酒酵母型有关的Lg-FL01部分是对应于Lg-FL01从位置84到位置97的14个氨基酸残基，即在序列表SEQ ID NO4中所示，编码SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的序列。
工业实用性根据本发明，提供了具有赋予酵母以啤酒酵母型絮凝特性的活性的Lg-FL01蛋白质，以及编码所述蛋白质的Lg-FL01 DNA链。通过将本发明的DNA作为外源DNA导入酵母，即将该DNA作为核外基因和/或核基因导入到酵母细胞中，可以赋予酵母以啤酒酵母型絮凝特性或增强酵母中的所述特性。相反，通过将经破坏本发明DNA而得到的DNA导入到酵母细胞中，或抑制本发明DNA的表达，可以将絮状酵母菌株转变为非絮状酵母菌株或降低絮凝特性。
序列表SEQ ID NO 1的资料序列特征长度 213个氨基酸类型 氨基酸拓扑结构 线性分子类型 肽序列描述SEQ ID NO1Met Thr Ile Ala His His Cys Ile Phe Leu Val Ile Leu Ala Phe Leu1 5 10 15Glu Leu Leu Asn Val Ala Ser Gly Ser Thr Gln Ala Cys Leu Pro Val20 25 30Gly Ser Arg Lys Asn Gly Met Asn Val Asn Phe Tyr Lys Tyr SerLeu35 40 45Gln Asp Ser Thr Thr Tyr Ser Asp Pro Gln Tyr Met Ala Tyr LysTyr50 55 60Ser Asp Thr Lys Lys Leu Gly Ser Val Ser Gly Gln Thr His LeuSer65 70 75 80Ile Tyr Tyr Gly Pro Asn Thr Ala Phe Trp Asn Thr Ala Ser TrpSer85 90 95Ser Asp Leu Phe Gly Phe Tyr Thr Thr Pro Thr Asn Val Thr ValGlu100105 110
Met Thr Gly Tyr Phe Leu Pro Pro Gln Thr Gly Ser Tyr Thr PheLys115 120 125Phe Ala Thr Val Asp Asp Ser Ala Ile Leu Ser Val Gly Gly SerIle130 135 140
Ala Phe Glu Cys Cys Ala Gln Glu Gln Pro Pro Ile Thr Ser ThrAsp145 150 155 160Phe Thr Ile Asn Gly Ile Lys Pro Trp Asp Ala Ala Ala Pro ThrAsp165 170 175Ile Lys Gly Ser Thr Tyr Met Tyr Ala Gly Tyr Tyr Tyr Pro IleLys180 185 190Ile Val Tyr Ser Asn Ala Lys Val Leu Ala Arg Leu Pro Val SerVal195 200 205Val Leu Pro Asp Gly210SED ID NO2的资料序列特征长度14个氨基酸类型氨基酸拓扑结构线性分子类型肽序列描述SEQ ID NO2Gly Pro Asn Thr Ala Phe TrP Asn Thr Ala Ser Trp Ser Ser1 5 10SED ID NO3的资料序列特征长度697个碱基对类型核酸链型双链拓扑结构线性分子类型基因组DNA来源种啤酒酵母菌株KMS004特征名称/关键词CDS位置59..697鉴定方法E序列描述SEQ ID NO3GCTCTGCAGT AAATTCCGCA AATGATTTTC TTTAAATTGA TTAGCACCAC TAAAAAAA 58ATG ACA ATT GCA CAC CAC TGC ATA TTT TTG GTA ATC TTG GCC TTT CTG 106Met Thr Ile Ala His His Cys Ile Phe Leu Val Ile Leu Ala Phe Leu1 5 10 15GAG CTA CTT AAC GTA GCA TCA GGA AGT ACA CAA GCA TGC CTG CCA GTG 154Glu Leu Leu Asn Val Ala Ser Gly Ser Thr Gln Ala Cys Leu Pro Val20 25 30GGC TCG AGG AAA AAT GGG ATG AAT GTC AAC TTT TAT AAA TAC TCA TTA 202Gly Ser Arg Lys Asn Gly Met Asn Val Asn Phe Tyr Lys Tyr Ser Leu35 40 45CAG GAT TCA ACA ACG TAT TCC GAC CCG CAA TAT ATG GCC TAT AAA TAC 250Gln Asp Ser Thr Thr Tyr Ser Asp Pro Gln Tyr Met Ala Tyr Lys Tyr50 55 60TCC GAT ACA AAG AAG TTA GGT TCC GTT AGC GGA CAG ACC CAT CTC TCC 298Ser Asp Thr Lys Lys Leu Gly Ser Val Ser Gly Gln Thr His Leu Ser65 70 75 80ATA TAC TAT GGC CCA AAT ACT GCC TTT TGG AAT ACT GCC TCT TGG AGT 346Ile Tyr Tyr Gly Pro Asn Thr Ala Phe Trp Asn Thr Ala Ser Trp Ser85 90 95TCT GAT CTT TTT GGT TTC TAT ACT ACT CCA ACT AAT GTA ACT GTG GAA 394Ser Asp Leu Phe Gly Phe Tyr Thr Thr Pro Thr Asn Val Thr Val Glu100 105 110ATG ACA GGG TAC TTT TTA CCA CCA CAG ACG GGT TCT TAC ACA TTC AAG 442Met Thr Gly Tyr Phe Leu Pro Pro Gln Thr Gly Ser Tyr Thr Phe Lys115 120 125TTT GCT ACA GTT GAC GAC TCT GCA ATT TTA TCG GTT GGT GGT AGC ATT 490Phe Ala Thr Val Asp Asp Ser Ala Ile Leu Ser Val Gly Gly Ser Ile130 135 140GCG TTC GAA TGT TGT GCA CAA GAA CAA CCT CCT ATC ACA TCA ACG GAT 538Ala Phe Glu Cys Cys Ala Gln Glu Gln Pro Pro Ile Thr Ser Thr Asp145 150155 160TTC ACT ATT AAC GGT ATT AAA CCA TGG GAC GCA GCT GCA CCT ACC GAC 586Phe Thr Ile Asn Gly Ile Lys Pro Trp Asp Ala Ala Ala Pro Thr Asp165 170 175ATA AAG GGG TCA ACG TAC ATG TAC GCC GGT TAC TAT TAC CCG ATC AAA 634Ile Lys Gly Ser Thr Tyr Met Tyr Ala Gly Tyr Tyr Tyr Pro Ile Lys180 185 190ATT GTT TAT TCA AAT GCT AAA GTC TTG GCT AGG CTT CCT GTT AGT GTG 682Ile Val Tyr Ser Asn Ala Lys Val Leu Ala Arg Leu Pro Val Ser Val195 200 205GTA TTG CCA GAT GGA 697Val Leu Pro Asp Gly210SED ID NO4的资料序列特征长度42个碱基对类型核酸链型双链拓朴结构线性分子类型基因组DNA来源种啤酒酵母菌株KMS004特征名称/关键词CDS位置1..42鉴定方法EGGC CCA AAT ACT GCC TTT TGG AAT ACT GCC TCT TGG AGT TCT 42Gly Pro ASn Thr Ala Phe Trp Asn Thr Ala Ser Trp Ser Ser1 5 10
权利要求
1.一种蛋白质，其含有具有基本上如序列表SEQ ID NO1中所示的氨基酸序列的多肽并具有赋予酵母以啤酒酵母型絮凝特性的活性。
2.一种蛋白质，其含有具有基本上如序列表SEQ ID NO1所示氨基酸序列中从位置25到位置213氨基酸残基的部分序列的多肽并具有赋予酵母以啤酒酵母型絮凝特性的活性。
3.一种蛋白质，其含有具有基本上如序列表SEQ ID NO1所示氨基酸序列中从位置25到位置97氨基酸残基的部分序列的多肽并具有赋予酵母以啤酒酵母型絮凝特性的活性。
4.一种多肽，其具有赋予酵母以啤酒酵母型絮凝特性并含有基本上如序列表SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列。
5.一段DNA，其含有编码具有基本上如序列表SEQ ID NO1所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
6.一段DNA，其含有编码具有基本上如序列表SEQ ID NO1所示氨基酸序列中从位置25到位置213部分序列的多肽的核苷酸序列。
7.一段DNA，其含有编码具有基本上如序列表SEQ ID NO1所示氨基酸序列中从位置25到位置97部分序列的多肽的核苷酸序列。
8.一段DNA或其cDNA，所述DNA含有编码具有赋予酵母以啤酒酵母型絮凝特性的活性的蛋白质的核苷酸序列，并含有序列表SEQID NO3的核苷酸序列中从位置59到位置697的碱基的部分序列。
9.一段DNA或其互补DNA，所述DNA含有编码具有赋予酵母以啤酒酵母型絮凝特性的活性的蛋白质的核苷酸序列，并含有序列表SEQ ID NO3的核苷酸序列中从位置131到位置697的碱基的部分序列。
10.一段DNA或其互补DNA，所述DNA含有序列表SEQ ID NO3中的核苷酸序列中从位置131到位置349的碱基的部分序列。
11.一段DNA，其含有序列表SEQ ID NO4所示的核苷酸序列并编码具有赋予酵母以啤酒酵母型絮凝特性的活性的多肽。
12.一段DNA，其插入到质粒KTYT2，YESKT2或KNWtC3中并含有编码具有赋予酵母以啤酒酵母型絮凝特性活性的蛋白质的核苷酸序列。
13.权利要求12的DNA，其插入到质粒KTYT2中并且是具有下列限制图谱的约9kb的DNA片段 其中Bm＝BamHI，Pt＝PstI，S1＝SalI，Sp＝SpeI，Sh＝SphI和Xb＝XbaI。
14.一段DNA，其插入到质粒KNYES中并含有编码具有赋予酵母以啤酒酵母型絮凝特性的活性的蛋白质的核苷酸序列。
15.含有权利要求5至14任一权项中的DNA的质粒。
16.生产啤酒酵母型絮凝特性已经被赋予或增强的酵母菌株的方法，其特征在于导入权利要求5至14任一权项中的DNA。
17.生产啤酒酵母型絮凝特性已经被消除或减弱的酵母菌株的方法，其特征在于导入一段DNA，该DNA能表达一种具有赋予啤酒酵母型絮凝特性之活性的蛋白质的能力已通过破坏权利要求5或14的DNA而被消除或减弱。
18.通过抑制权利要求5至14任一权项中的DNA的表达而消除或减弱酵母中啤酒酵母型絮凝特性的方法。
19.用权利要求16或17的方法生产的酵母菌株。
20.生产酿造产品的方法，其包括培养权利要求1 9的酵母菌株。
21.用权利要求20的方法生产的酿造产品。
全文摘要
本发明涉及酵母絮凝基因和其用途。更具体地说，本发明涉及具有赋予酵母以啤酒酵母型絮凝特性的活性的蛋白质，编码所述蛋白质的DNA，含所述DNA的质粒，利用所述DNA赋予或增强了啤酒酵母型絮凝特性的酵母菌株的生产方法，利用所述DNA消除或降低了啤酒酵母型絮凝特性和酵母菌株的生产方法，以及通过抑制所述DNA的表达而消除或降低啤酒酵母型絮凝特性的方法。本发明还涉及通过上述方法已经被赋予、增强、消除或降低了啤酒的酵母型絮凝特性的酵母菌株。此外，本发明涉及酿造产品的方法，包括培养上述酵母菌株以及用所述方法得到的酿造产品。根据本发明，提供了具有赋予酵母啤酒酵母型絮凝特性的Lg-F101蛋白质和编码所述蛋白质的Lg-FL01DNA链。用遗传工程技术，通过将本发明上述DNA作为外源基因导入到酵母细胞中，即将所述DNA作为核外基团和(/或)核基因导入到酵母细胞中，可以赋予酵母啤酒酵母型絮凝特性或增强酵母中的该特性。相反，将通过破坏本发明的DNA而得到的DNA导入到酵母细胞中，或通过抑制本发明DNA的表达，可以将絮状酵母菌株转变为非絮状菌株或降低絮凝特性。
文档编号C07H21/04GK1150457SQ9619028
公开日1997年5月21日 申请日期1996年1月31日 优先权日1995年2月1日
发明者小林统, 曾根秀隆, 林伸之 申请人:麒麟麦酒株式会社