专利名称：利用双加氧酶生物转化与化学步骤相结合的茚向无任何立体异构体的(is)－氨基－(2r ...的制作方法
背景技术：
本申请与Merck 18996、1993年5月7日提交的U.S.S.N.08/059，038、18996IA、1994年4月29日提交的U.S.S.N.08/235,576、Merck19251、Merck 19114、Merck 19115及19351相关。
本发明涉及一种合成能抑制人免疫缺陷病毒(HIV)编码的蛋白酶的化合物，尤其是如下面实施例中的化合物J的一些寡肽类似物的中间体的方法。这些化合物对HIV感染的预防，HIV感染的治疗以及由HIV导致的获得性免疫 缺陷综合症(艾滋病)的治疗具有价值。这些化合物也可用于抑制肾素和其它一些蛋白酶。
在此描述的发明是关于茚向(2S)-氨基-(1R)茚满醇的转化，如下面方案I、II和III所示。
方案I
方案II
方案III
已定名为人免疫缺陷病毒(HIV)的一种逆转录病毒是包括免疫系统进行性损伤(获得性免疫缺陷综合症；艾滋病)和中枢和外周神经系统退化在内的复杂疾病的致病因子。这种病毒曾称为LAV、HTLV-III或ARV。逆转录病毒复制的一个普遍特征为前体多蛋白由病毒编码的蛋白酶进行大量的翻译后加工产生病毒的组装和功能所必需的成熟病毒蛋白。这一加工过程的抑制可阻止通常为感染性的病毒的产生。例如，Kohl，N E等，Proc.Natl Acad.Sci.85，4686(1988)中证明HIV编码的蛋白酶的遗传灭活导致了未成熟的、无感染性的病毒颗粒的产生。这些结果表明HIV蛋白酶的抑制可作为治疗艾滋病以及预防或治疗HIV感染的一种可行的方法。
HIV的核苷酸序列显示出在一个开放阅读框中存在一个pol基因〔Ratner，L等，Nature，313，277(1985)〕。氨基酸序列的同源性提供了pol序列编码反转录酶、一种内切核酸酶和一种HIV蛋白酶的证据〔Toh，H.等，EMBO J.4，1267(1985)；Power，M.D.等，Science，231，1567(1986)；Pearl，L.H.等，Nature，329，351(1987)〕。可由本发明的新中间体及方法制得的包括某些寡肽类似物的终产物化合物，为HIV蛋白酶的抑制剂，并公开于1993年5月12日公开的EPO 541,168。参见例如其中的化合物J，该化合物也在下面实施例中说明。
本申请公开了一种制备基本上为立体异构体纯度的下式1(S)-氨基-2(R)-羟基茚满的改良方法
该结构为化合物J的侧链基团，化合物J为HIV蛋白酶的强抑制剂。
以前的合成尝试中从外消旋的茚氧化物产生消旋体1(+/-)-氨基-2(+/-)羟基茚满的效率较低。其它的合成尝试中用真菌卤过氧化物酶将茚生物转化得到占优势的反式-(2S，1S)-溴茚满醇，随后经各种化学步骤将其转化为(1S)-氨基-(2R)-茚满醇。还有一些其它的合成尝试涉及用外消旋环氧化作用作为中间步骤进行化学合成，随后用L-酒石酸拆分。
本发明提供了需要的改良替代方法。在本发明的方法中，通过将底物茚生成顺式(1S，2R)-茚满二醇的立体选择性生物氧化作用与随后的利用手性特异结晶技术对基本上为立体异构体纯的顺式-(1S，2R)-茚满二醇晶体的分离相结合，省去了酒石酸拆分步骤。进一步的化学处理将可得到(1S)-氨基-(2R)-茚满二醇，例如按Ritter反应在含水酸存在下用腈处理，随后再用反离子对抽提或用阳离子交换色谱纯化。
在本发明的方法中，由双加氧酶的作用将茚转化为主要含所需的(1S，2R)立体异构体的顺式茚满二醇的混合物。所需的(1S，2R)立体异构体用纯化步骤分离，例如吸附、抽提、结晶，以产生基本上纯的结晶顺式(1S，2R)-茚满二醇。
对映体过量超过约99％(手性特异结晶作用后从茚到基本上纯的顺式-(1S，2R)-茚满二醇)是本发明方法的典型特征。
发明概述本发明提供了利用双加氧酶的生物转化作用合成顺式-(1S，2R)-茚端二醇的新方法。双加氧酶的胞内表达可用甲苯诱导(甲苯双加氧酶)，或其胞内表达可以是非甲苯依赖型的。随后的化学步骤可形成(1S)-氨基-(2R)-茚满醇，即另一中间体。这些产物化合物是用于合成HIV蛋白酶、肾素和其它蛋白酶的抑制剂的化合物(如化合物J)的中间体。发明详述本发明是关于合成抑制HIV蛋白酶的化合物的中间体的方法。一个所需的中间体为(1S)-氨基-(2R)茚满醇，它基本上不含不需要的立体异构体。另一个所需的中间体为(1S，2R)-茚满二醇，它基本上不含不需要的立体异构体(1R，2S)-茚满二醇。
在本发明中，所描述的合成(1S，2R)-茚满二醇的方法包括以下步骤a)将一定量的甲苯双加氧酶与一定量的茚接触；b)发酵所得混合物；c)获得(1S，2R)-茚满二醇。
所述的合成基本上不含任何立体异构体的(1S，2R)-茚满二醇的另一种方法包括以下步骤a)将一定量的甲苯双加氧酶与一定量的茚接触；b)发酵所得混合物；c)纯化(1S，2R)-茚满二醇；d)对步骤c)的产物进行手性特异结晶；e)得到基本上不含任何立体异构体的(1S，2R)-茚满二醇。
所述的合成(1S，2R)-茚满二醇的另一种方法包括以下步骤a)将一定量的双加氧酶与一定量的茚接触；b)发酵所得混合物；c)得到(1S，2R)-茚满二醇。
所述的合成基本上不含任何立体异构体的(1S，2R)-茚满二醇的另一种方法包括以下步骤a)将一定量的双加氧酶与一定量的茚接触；b)发酵所得混合物；c)纯化(1S，2R)-茚满二醇；d)对步骤c)的产物进行手性特异结晶；e)得到基本上不含任何立体异构体的(1S，2R)-茚满二醇。
所述的合成基本上不含任何立体异构体的(1S)-氨基-(2R)-茚满醇的另一种方法包括以下步骤a)将一定量的甲苯双加氧酶与一定量的茚接触；b)发酵所得混合物；c)纯化(1S，2R)-茚满二醇；d)对步骤c)的产物进行手性特异结晶；e)得到基本上不含任何立体异构体的(1S，2R)-茚满二醇；f)在过量的乙腈中溶解一当量的步骤e)的(1S，2R)-茚满二醇，得到第二种混合物，将第二种混合物维持在约-40℃至约25℃之间；g)混入过量当量的强酸，并将反应液维持在约-40℃至约25℃之间；h)得到基本上不含任何立体异构体的(1S)-氨基-(2R)-茚满醇。
所述的合成基本上不含任何立体异构体的(1S)-氨基-(2R)-茚满醇的另一种方法包括以下步骤a)将一定量的双加氧酶与一定量的茚接触；b)发酵所得混合物；c)纯化(1S，2R)-茚满二醇；d)对步骤c)的产物进行手性特异结晶；e)得到基本上不含任何立体异构体的(1S，2R)-茚满二醇；f)在过量的乙腈中溶解一当量的步骤e)的(1S，2R)-茚满二醇，得到第二种混合物，将第二种混合物维持在约-40℃至约25℃之间；g)混入过量当量的强酸，并将反应液维持在约-40℃至约25℃之间；h)得到基本上不含任何立体异构体的(1S)-氨基-(2R)-茚满醇。
所述的利用生物拆分作用从顺式-(1S，2R)-茚满二醇和顺式-(1R，2S)-茚满二醇的混合物中除去顺式-(1R，2S)-茚满二醇的另一种方法包括以下步骤a)将一定量的二氢二醇脱氢酶与顺式-(1S，2R)-茚满二醇和顺式-(1R，2S)-茚满二醇的混合物接触；b)发酵所得混合物；c)得到基本上不含任何立体异构体顺式-(1R，2S)-茚满二醇的顺式-(1S，2R)-茚满二醇。
还描述了恶臭假单孢菌421-5即ATCC 55687的纯培养物。
(1S)-氨基-(2R)茚满醇的进一步纯化可通过反离子对抽提或阳离子交换色谱完成。
甲苯双加氧酶的一个优选来源是恶臭假单孢菌F1，该菌株保藏于ATCC，保藏号为55688。
非甲苯依赖型的双加氧酶或双加氧酶的一个优选来源是恶臭假单孢菌421-5，该菌株保藏于ATCC，保藏号为55687。
二氢二醇脱氢酶的优选来源是恶臭假单孢菌F1，该菌株保藏于ATCC，保藏号为55688；或恶臭假单孢菌421-5，该菌株保藏于ATCC，保藏号为55687。
在茚向顺式-(1S，2R)-茚满二醇和顺式-(1R，2S)-茚满二醇混合物的生物转化中，任何具有双羟基化作用的酶都是适合的。优选的酶包括那些能获得(1S，2R)立体异构体大大过量的酶，如甲苯依赖型的双加氧酶(也称作甲苯双加氧酶)或非甲苯依赖型的双加氧酶。申请人已分离出一种非甲苯依赖型突变株恶臭假单孢菌菌株421-5，它能组成型表达双加氧酶。这样的菌株可省去酶的甲苯诱导步骤。
申请人也发现在恶臭假单孢菌与茚的发酵中同时发生了立体选择性生物拆分。在二氢二醇脱氢酶的作用下，这种生物拆分作用可降解不需要的立体异构体顺式-(1R，2S)-茚满二醇。因此促使所需的立体异构体顺式-(1S，2R)-茚满二醇的过量。任何能特异降解顺式-(1R，2S)-茚满二醇的酶均适合于立体选择性生物拆分。
茚与含双加氧酶的微生物和任选的二氢二醇脱氢酶的发酵作用在茚的由贮液如硅油的存在下进行。茚的油贮液可避免高浓度的茚对细胞的毒性。用于发酵的优选的微生物是恶臭假单孢菌，最优选的是ATCC55688和55687。其它适合的微生物包括用有关的酶的基因转化的大肠杆菌，这些基因包括恶臭假单孢菌甲苯双加氧酶和任选的恶臭假单孢菌二氢二醇脱氢酶的基因。
发酵后，将发酵混合物旋转或离心得到三层，上层为油贮液，通常为硅油；中层为含所需的茚满二醇生物转化产物的水层；底层为细胞和残渣。中层进行进一步的处理。
随后将中层水相与疏水性树脂混合以结合茚满二醇产物。适合的疏水性树脂包括但不限于苯乙烯二乙烯苯树脂、反相C18树脂或无电荷的丙烯酸树脂。
用水或其它合适的水性溶剂洗涤树脂后，用洗脱溶剂洗脱树脂以除掉结合的茚满二醇。洗脱溶剂包括任何有机溶剂，优选乙腈和水的混合液，最优选的为约20％(v/v)乙腈和约80％(v/v)水的混合液。洗脱溶剂与用手性特异结晶的抽提溶剂必须不混溶。
洗脱出的茚满二醇一般经浓缩后进行手性特异结晶。在这个过程中，加入抽提溶剂，与洗脱溶剂中的茚满二醇混合，然后保留抽提溶剂层。经手性特异结晶作用，抽提溶剂层中水的后续去除将结晶出顺式-(1S，2R)-茚满二醇。合适的抽提溶剂包括乙酸异丙酯、甲苯、或许多其它的有机溶剂，优选乙酸异丙酯。抽提溶剂加入后，用真空浓缩法除去水。
手性特异结晶可用于替代立体选择性生物拆分或与之相结合，以增强所需的基本上不含任何立体异构体的产物顺式-(1S，2R)-茚满二醇的立体异构体过量。ATCC保藏在本申请的美国提交日前，微生物MB 5612与MB 5652的样品已保藏于美国典型培养物保藏所(ATCC，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852)。培养物保藏号分别为ATCC 55688和55687。该保藏将在ATCC至少维持30年，并在公开该保藏的专利授权后向公众发放。应当指出，保藏物的可得性并不构成在损害政府授予的专利权的条件下实施本发明的许可。ATCC 55688和55687的一般特征物理特征与分类学，包括形态特征、培养特征、生物学特征和生理特征简述如下MB 5612-(菌株F1)ATCC 55688该培养物以恶臭假单孢菌DSM 6899的连续转移体形式收到。它是游动的、氧化酶阳性、革兰氏阴性杆菌、0.38×0.76mm、两端平整、呈卵圆形。它于28和37℃，在胰胨豆胨琼脂培养基(TSA)、伊红美蓝琼脂培养基(EMB)、MacConkey’s琼脂培养基、绵羊血琼脂培养基和沙氏麦芽糖琼脂培养基(SMA)上观察到良好至极好的生长。在TSB上菌落透明、隆起并具有完整的边缘。菌落质地为奶油状且表面泛光。没有观察到可扩散的色素。有腐烂的气味。在血琼脂培养基上培养物为γ-溶血型。在APIRapid NFT板上观察到的生化反应如下精氨酸二水解酶阳性；对硝酸盐、色氨酸、葡萄糖发酵、脲酶、及七叶苷、明胶和对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷的水解为阴性。对葡萄糖、甘露糖(48h)、萄萄糖酸、癸酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐和乙酸苯酯的氧化利用为阳性。按照指导对上述特征进行评定时，该有机体最可能的鉴定结果是恶臭假单孢菌(p＝0.998)。利用气-液色谱对全细胞脂肪酸(甲酯)进行分析(FAME分析)表明其脂成分与革兰氏阴性细菌的脂成分一致，富含不饱和的、单不饱和的和环丙烷脂肪酸。也发现了低农度的羟化脂肪酸。将这种有机体的色谱图与MIDI数据库进行比较得到与恶臭假单孢菌生物型A的极好匹配(相似生＝0.913，MIDI Clinical Library，Ver 3.6)。
MB 5652-(菌株421-5)ATCC 55687这个培养物以从MB5612衍生的分离株形式收到。在平板(TSA)上观察到两种菌落类型。一种大的亮白色的菌落，具有透明的边缘和隆起的中央，和一种较小的黄褐色的变种，它从透明到不透明，中央隆起，边缘透明。两种菌落变种在其它培养基上也可观察到。两种菌落类型的革兰氏染色表明，大菌落中的细胞为革兰氏阴性杆菌，0.76×1.5-3.4μm，小菌落的细胞也为革兰氏阴性，但似乎在宽度上膨胀并易变(0.76-1.14×1.9-3.4μm)。在API Rapid NFT板上两种菌落变种与其亲本菌株(MB5612)具有实质上一致的生化特征。两种菌落变种的FAME特征彼此基本一致，但与其亲本菌株不同。亲本菌株具有略微升高浓度的17∶0环丙烷(约35％)和略微降低浓度的16∶1 ω7c(约11％)。但是，这些观察到的差异并不导致两种菌落变种鉴定为恶臭假单孢菌生物型A(大小菌落型的相似性分别为0.885和0.895)。培养条件的一般说明营养培养基中的优选碳源为碳水化合物如葡萄糖、木糖、半乳糖、甘油、淀粉、糊精等。其它可能包括的碳源为麦芽糖、鼠李糖、棉子糖、阿拉伯糖、甘露糖、水杨苷、琥珀酸钠等。
优选氮源为酵母抽提物、肉抽提物、蛋白胨、谷蛋白粉、棉籽粉、大豆粉和其他蔬菜粉(部分或全脱脂)、酪蛋白水解物、大豆水解物、以及酵母水解物、玉米浆、干酵母、麦胚、羽毛粉、花生粉、酒糟等，以及无机和有机氮化合物，如铵盐(如硝酸铵、硫酸铵、磷酸铵等)、脲、氨基酸等。
碳源和氮源，尽管联合使用有利，但不必用其纯化形式，因为含微量生长因子和相当量矿质营养的较低纯度的物质也适用。如果需要，可在培养基中加入矿物盐，如碳酸钠或碳酸钙、磷酸钠或磷酸钾、氯化钠或氯化钾、碘化钠或碘化钾、镁盐、铜盐、钴盐等。如果需要，尤其是在培养基发泡严重时，可加入消泡剂，如液体石蜡、脂肪油、植物油、矿物油或硅氧烷。
至于大量生产细胞的条件，优选深层有氧培养条件，对于小量生产，可在摇瓶中摇动培养。而且，当在大罐中进行培养时，需要先用-20-70℃冻存的有机体在相对较小量的培养基上接种，并在该接种后的培养基(也称为“种子培养基”)上培养以得到该有机体的接种物，然后将得到的接种物无菌转移至大罐中。产生接种物的发酵培养基在接种之前通常需要高压灭菌。在高压灭菌前，培养基的pH通常调至约7.0。
培养混合物的搅拌与通气可通过许多途径来实现。搅拌可由叶轮或相似的机械搅拌装置、摇瓶生物反应器、由不同的泵装置或由无菌空气通过培养基来提供。通气可由在发酵混合物中通过无菌空气而实现。
发酵通常在约25℃～37℃间，优选30℃，进行约0.5～5天，优选2天，这些将依发酵条件与规模而变化。优选地，生产培养物在搅拌的生物反应器中，于30℃培养约2天，其中反应器叶轮的速度为约300rpm。
进行发酵所用优选培养/生产培养基包括下面的培养基表1.恶臭假单孢菌F1生物转化茚的培养基组成(Finette等，Journalof Bacteriology 160，1004(1984))。所有数值均为每升中的含量。物质 种子培养基 生产培养基L-精氨酸2.00g 4.00g(NH4)2SO41.00g 2.00gNa2HPO45.24g 10.48gKH2PO42.77g 5.54gMgSO4-7H2O---0.58gCaCl2-2H2O---0.13g(NH4)6Mo7O24-4H2O ---0.36mgFeSO4-7H2O---3.96mg改进的Hutners矿物基质*20mL ---改进的金属44**--- 2.00mL硅油--- 200mL消泡剂 --- 1.00mL用6M硫酸调pH至7.0*改进的Hutners矿物基质EDTA，10g；MgSO4-7H2O，14.45g；CaCl2-2H2O，3.33g；(NH4)6Mo7O24-4H2O，0.009g；FeSO4-7H2O，0.099g；金属44，50mL；加蒸馏水至1升；用6M硫酸调pH至6.6-6.8。**改进的金属44(mg/100mL)EDTA，250；ZnSO4-7H2O，1.095；FeSO4-7H2O，500；MnSO4-H2O，154；CuSO4-5H2O，39.2；CoCl2-6H2O，24.8；Na2B4O2-10H2O，17.7；加约0.400mL6M硫酸防止沉淀。
在发酵期间操作发酵罐的优选条件包括下列参数表2.发酵罐条件过程变量 设置点温度 30℃pH 7.0搅拌 300RPM气流 20升/分钟压力 0.3巴发酵后步骤除硅油将全培养液从发酵罐转移至收获罐，并至少沉降4小时。通常沉降过夜。沉降后，含顺式-茚满二醇和发酵固体的下层水相移至柱式进料罐。弃去上面的有机层。膨胀床吸附随后将水相泵入密度大于1.1的溴化苯乙烯二乙烯苯树脂柱的底端并从顶端泵出。膨胀床操作使顺式-茚满二醇吸附到树脂上而发酵固体物不滞留地过柱。加样后，用去离子水以上流方向洗涤树脂以置换残存的发酵固体物及用过的水性料液。用一倍柱体积的20％v/v乙腈/80％v/v水洗脱液以上流方向洗涤树脂，然后用20％v/v乙腈/80％v/v水洗脱液以下流方向洗脱顺式-茚满二醇。流出液部分收集并分别用HPLC检测顺式-茚满二醇的浓度。真空浓缩/乙酸异丙酯抽提汇集的含～80％顺式-茚满二醇的流出液洗脱部分真空浓缩以减小体积并降低乙腈含量。在浓缩液中加入等体积的乙酸异丙酯并至少搅拌5分钟。至少2小时后由于重力沉降作用各相分层。移去上层有机相，而后下层水相用等体积的乙酸异丙酯再抽提三次。真空浓缩/手性特异结晶这一结晶步骤具有两个关键目的。一个目的是通过除去其它的茚代谢物，如起始分离步骤过程中夹带的茚酚和2，3-二氢-1-茚酮，提高化学纯度。另一个目的是通过除去母液中的不需要的1R，2S立体异构体提高手性纯度。结晶过程如下合并的乙酸异丙酯抽提物真空浓缩至～30g顺式-茚满二醇/升，随后用中孔隙率的玻璃滤器过滤以除去所有的颗粒物质。过滤后的抽提物进一步浓缩至终浓度为200g顺式-茚满二醇/升。在最后的浓缩过程中顺式-茚满二醇开始结晶，冷却至5-10℃并陈化至少8小时后结晶完全。过滤晶体，用乙酸异丙酯/己烷(1∶1)，随后用己烷洗涤，并真空干燥。从全培养液到顺式-茚满二醇的典型产率为45％，大于99.5％立体异构体过量的是1S，2R立体异构体形式。产物回收产物顺式-(1S，2R)-茚满二醇存在于培养基的水相中，因而可用常规的方法分离纯化，如水相的离心或重力澄清、减压浓缩、用常规溶剂如乙酸异丙酯等抽提、调整pH、用常规树脂(如阴离子或阳离子交换树脂、非离子性树脂等)处理、用常规吸附剂(如活性炭、硅胶、纤维素、氧化铝等)处理、结晶、重结晶等。
方法的优选顺序包括水相澄清、产物吸附到树脂上并用水性溶剂混合物洗脱、减压条件下富级分的浓缩、产物的溶剂抽提、减压条件下溶剂浓缩和结晶。顺式-(1S，2R)-茚满二醇向顺式-(1S)-氨基-(2R)-茚满醇的转化顺式-(1S，2R)-茚满二醇与乙腈的反应，紧接着在水存在下的水解，快速完成。将一当量的固体顺式-(1S，2R)-茚满二醇溶于过量的乙腈，加或不加有机溶剂。典型的溶剂为二氯甲烷。由于二醇与乙腈的混合是放热的，因此在与强酸接触前通常要进行冷却。
随后将顺式-(1S，2R)-茚满二醇与乙腈的混合物与过量的强酸如三氟乙酸、甲磺酸或硫酸接触。通常加入约2当量的强酸。约1或2小时后，加入过量的水。残余的乙腈通过蒸馏或回流除去，得到Ritter溶液。
得到的顺式-(1S)-氨基-(2R)-茚满醇基本上不含反式氨基茚满醇立体异构体。通常，在随后的步骤中不需要拆分。顺式-(1S)-氨基-(2R)-茚满醇的纯化Ritter溶液可经不同的处理除去酸污染物。
A反离子对抽提加入碱以中和酸，并将pH升至约12或更高，得到碱化的Ritter溶液。这个碱化的Ritter溶液用对顺式氨基茚满醇有适合的溶解度的任何有机溶剂如二氯甲烷、乙酸乙酯或1-丁醇(优选1-丁醇)进行抽提。然后可弃去水相。
在含顺式-氨基茚满醇的有机层中加入超过顺式-氨基茚满醇当量的适合的酸。适合的酸将与顺式-氨基茚满醇形成盐复合物，使顺式-氨基茚满醇更易于溶于水溶液。这样的适合酸包括但不限于L-酒石酸、D-酒石酸、内消旋酒石酸、抗坏血酸、丙二酸、柠檬酸、甲酸、HCl、优选L-酒石酸。
在有机溶剂中得到的盐随后用水溶液如水抽提，得到一水抽提物。用碱滴定水抽提物，当pH约8-9时开始结晶。在用碱滴定至pH达到约11-12时通常完成结晶。得到的(1S)-氨基-(2R)-茚满醇基本上为纯品。
B.阳离子交换色谱另外，Ritter溶液也可通过阳离子交换色谱除去酸污染物。任何阳离子交换树脂均适合，但通常包括苯乙烯二乙烯苯树脂，其上接有酸基团，如磺酸或羧酸。
将树脂与Ritter溶液混合，然后用水或其它水性溶剂洗涤除去不需要的酸。加入碱的步骤(升高pH以保持顺式-氨基茚满醇可溶)洗脱出结合的顺式-氨基茚满醇，接着用许多溶剂如甲醇、乙腈或THF水溶液中的任何一种洗脱。碱化-洗脱循环可重复几次以定量地从树脂上洗脱顺式-氨基茚满醇。得到的(1S)-氨基-(2R)-茚满醇基本上为纯品。制剂由本发明的中间体合成的产物化合物可以含常规无毒药物可接受的载体、助剂及赋形剂的单位剂型，通过口服、非肠道给药(包括皮下注射、静脉注射、肌内注射、胸骨内注射或输注技术)、吸入喷雾或直肠给药方式给药。
本发明的方法和中间体适用于制备用于抑制HIV蛋白酶、预防或治疗人免疫缺陷病毒(HIV)感染、及治疗由此导致的病理状况如艾滋病的终产物化合物。治疗艾滋病或预防或治疗HIV感染定义为包括但不限于治疗广泛的HIV感染状况艾滋病、ARC(艾滋病 相关综合症)，无论有症状还是无症状，以及实际上的或潜在的与HIV的接触。例如，可由本发明的方法和中间体制备的终产物化合物用于治疗过去与HIV有可疑接触后的HIV感染，例如由于输血、器官移植、体液交换、蚊虫叮咬、意外的针刺、或在外科手术时染上患者的血液。
终产物HIV蛋白酶抑制剂也用于准备和进行抗病毒化合物的筛选试验，包括用作对照。例如，终产物化合物用于分离作为更有效的抗病毒化合物的极好筛选工具的酶突变体。而且，这种化合物适用于建立或确定其它抗病毒剂对HIV蛋白酶的结合位点，例如通过竞争性抑制。用本发明的方法和中间体制备的终产物化合物为用于这些目的而出售的工业产品。
终产物HIV蛋白酶抑制剂化合物J具如下结构或其药物可接受的盐或水合物。
化合物J命名为N-(2(R)-羟基-1(S)-茚满醇)-2(R)-苯甲基-4(S)-羟基-5-(1-(4-(3-吡啶基甲基)-2(S)-N′-(叔丁基甲酰氨基)-哌嗪基))-戊酰胺；〔1S-〔1α〔αS*，γR*，δ(R*)〕，2α〕-N-(2，3-二氢-2-羟基-1H-茚-1-基)-2-〔〔(1，1-二甲基乙基)氨基〕羰基〕-γ-羟基-α-(苯甲基)-4-(3-吡啶基甲基)-2-哌嗪戊酰胺；或N-(1(S)-2，3-二氢-2(R)-羟基-1H-茚基)-4(S)-羟基-2(R)-苯甲基-5-〔4-(3-吡啶基甲基)-2(S)-叔丁基氨甲酰基)-哌嗪基〕戊酰胺。
可用本发明的中间体和方法制备的HIV蛋白酶抑制剂化合物公开于EPO 541,168。HIV蛋白酶抑制剂化合物可以含药物载体及治疗有效量的该化合物或其药物可接受的盐的药物组合物形式给予需要这种治疗的患者。EPO 541,168公开了合适的药物制剂、给药途径、盐形式及该化合物的剂量。
本发明的化合物可能具有不对称中心，因而可为外消旋体、外消旋混合物和个别的非对映体或立体异构体，所有异构体形式都包括在本发明中。立体异构体混合物包括1∶1混合物，以及任何其它混合物，如1∶4、4∶3、2∶1。
采用新方法的典型实验步骤详述如下。这些步骤只为举例说明而不是对本发明的新方法的限制。
实施例1恶臭假单孢菌F1的方案A.底物和产物的反相分析将两份异丙醇(IPA)加入一份全培养液中。将混合物摇动1分钟后以5000rpm离心15分钟以沉淀细胞并从IPA/水相(上层)中分离油(底层)。将一等分上层液注射到与HPLC系统相连的C18反相HPLC柱(250×4.6mm)中。
B.顺式-1，2-茚满二醇的手性测定使全培养液相分离后(重力沉降～10分钟)，将5mL水相(底层)加入10mL乙酸乙酯(EthAc)中。将5mL的EthAc层(上层)在氮气吹扫下干燥。EthAc抽提出的化合物随后重新悬浮于95％己烷5％乙醇溶液。注入与HPLC系统相连的手性柱(250×4.6mm)中。
C.种母培育本实施例中C-E部分为23升发酵罐设计。在装有500mL种子培养基(表1，上文)的2升无挡板摇瓶中接种1mL起子培养物。将种子摇瓶放在200RPM旋转摇床中在30℃培养。当培养物长至对数中期时(约8小时)，将50mL移至生产容器中。
D.诱导在装有15升生产培养基(表3)的搅拌容器中加入甲苯(75g)。降一LEL计与废气管相连以测定发酵罐发出的蒸汽是否低于甲苯的爆炸下限(LEL)。刚加入甲苯后测量值约为甲苯LEL的30％，为整个过程的最高读数。立即从50mL C部分的种子摇瓶中取50mL接种入发酵罐。除pH外所有的发酵罐参数在诱导和生物转化阶段的整个过程中部保持不变(表4)。诱导过夜后(约12-14小时)，培养液为淡黄色，可加入茚。表3.用于在23升搅拌的生物反应器中由恶臭假单孢菌F1使茚生物转化的培养基组成(Finette等，Journal of Bacteriology 160，1004(1984))的改良)。所有值均为每升。
用6M硫酸调pH至7.0表4.发酵罐条件E.生物转化将茚直接加入容器中至终浓度1.0g/L，开始生物转化。以30-60分钟间隔监测发酵的总产物形成量及顺式-1，2-茚满二醇的旋光活性。顺式1，2-茚满二醇在约4小时内浓度达到平台区的约200
mg/L。即便从茚到顺式-1，2-茚满二醇的生物转化已停止，顺式-1S，2R-茚满二醇的立体异构体过量EE也继续从小于60％提高至大于98％。在发酵过程中容器中的溶解氧浓度下降，最低测量值达到40％饱和。8小时生物转化期后，52％的茚被利用，以产物的旋光纯度计算达到39％的转化率。以30-60分钟间隔监测发酵的总产物生成量及顺式-1，2-茚满二醇的旋光活性。8小时生物转化期后，62％的茚被利用，达到35％的转化率。在水层澄清前将发酵罐冷却至15℃。
实施例2F1的方案规模升至70升发酵罐A.种母培育在装有500mL种子培养基(表1)的2升无挡板摇瓶中接种1mL起子培养物。将摇瓶放在200RPM旋转摇床中在30℃培养。培养8小时后，培养物达到光密度(600nm)0.6～0.7，可移至生产容器中。
B.诱导在装有50升生产培养基(表1)的搅拌容器中加入甲苯(250g)。如同用较小的发酵罐，一LEL计与废气管相连以测定发酵罐发出的蒸汽是否低于甲苯的LEL。加入甲苯后马上开始测量再次得到约30％的甲苯LEL，为整个过程中的最高读数。立即将种子摇瓶中的全部成分接种入发酵罐(部分C)。除pH外，发酵罐参数在诱导和生物转化两个阶段都保持不变(表2)。诱导过夜后(约12～14小时)，培养液为淡黄色，可加入茚。
C.生物转化直接将茚加入容器中至终浓度2.5g/L，开始生物转化。茚纯度(工业级90％或试剂级99+％)似乎对产物的旋光纯度影响极小或无影响。以30-60分钟间隔监测发酵的总产物生成量及顺式-1，2-茚满二醇的旋光活性。在约6小时内顺式-1S，2R-茚满二醇浓度达到平台区的500-700mg/L。顺式-1S，2R-茚满二醇的EE继续从小于60％升至近80％。尽管没有对pH进行控制，在所述条件下这种规模下的pH从未降至6.5以下或升至7.5以上。如同用23升发酵罐，在发酵过程中溶解氧浓度下降，但不低于40％饱和溶解氧(DO)。8小时生物转化期后，62％的茚被利用，达到35％转化率。在水层澄清前，将发酵罐冷却至15℃。
D.水层澄清停止发酵罐的搅拌器，沉降各成分至少4小时。下层水层接入瓶中。水层的体积与顺式茚满二醇的浓度分别为37升和0.45g/L。在发酵罐中加入去离子(DI)水(19升)搅拌10分钟，随后沉降过夜。第二次的下层水层也接入瓶中。第二次水层的体积与顺式茚满二醇的浓度分别为21升和0.05g/L。硅油层接入瓶中供处理。在400mL瓶中离心分离水层中的细胞。离心在5℃以8000rpm进行45分钟。
E.树脂吸附澄清的第一次水层以～25mL/分加入柱中。该柱装有260mL苯乙烯二乙烯苯型树脂(床高21.5英寸)。加入水层直至流出液中的产物浓度等于入口产物浓度的25％。在头10升流出液中没有可检测的产物，而在后2升流出液中产物浓度迅速增至0.1g/L。加入的总水层为48倍床体积(12.9升)。用2倍床体积(450mL)的DI水洗柱。洗出液中含0.12g产物(～2％)。随后用3.3倍床体积(900mL)的20％乙腈/80％水洗脱柱，收集0.20倍体积(50mL)的分部洗脱液。柱用～5倍床体积的乙腈洗涤后再生，再用几倍床体积的DI水洗涤而重新平衡。
F.乙酸异丙酯抽提在实验室的旋转蒸发仪中将合并的富级分从700mL真空浓缩至350mL。在浓缩液中加入等体积的乙酸并丙酯并混合5分钟。重力沉降至少30分钟分离液相。再重复抽提两次以回收合并富级分中94％的产物。最终合并的乙酸异丙酯体积为1.05升。
G.用乙酸异丙酯进行手性特异结品在实验室旋转蒸发仪中将乙酸异丙酯抽提物真空浓缩至25mL(二醇浓度约为200g/L)。将浓缩液加热至60℃以溶解所有的固体，冷却至55℃，并用0.025g(～0.5％)二醇晶体接种。在4小时以上的时间里将该批物料缓慢冷却至35℃。冷却至5℃并老化过夜。用烧结玻璃滤器真空过滤晶体，用5mL冷(5℃)乙酸异丙酯洗涤，再用10mL己烷洗涤。不加热情况下真空干燥。母液中产率损失约为20％。
实施例3外消旋顺式-1，2-茚满二醇的生化拆分恶臭假单孢菌F1将外消旋顺式-1，2-茚满二醇生化拆分成旋光活性的1S，2R-茚满二醇的能力，通过在两个23升反应器中培养该有机体并用甲苯诱导过夜而利用。将茚加入其中一个反应器中开始生物转化，当这个反应器中的生物转化停止时(约3小时)，使两个反应器中的细胞沉淀并重悬于没有加入茚的反应器中用过的培养基中，再转入已加入200mg/L外消旋顺式-1，2-茚满二醇的2升无挡板摇瓶中。由没有加入茚的培养物得到的用过的培养基和无菌种子培养基加20％油作为对照。所有的摇瓶都放在往复式摇床(每分钟200次摇动)中在30℃培养。间隔测量EE直至26小时(表5)。样品也用反相HPLC分析以检测不需要的顺式-1，2-茚满二醇立体异构体的表观生化转化中生成的任何可能的代谢物。培养26小时后，装有细胞的摇瓶中测到的EE大于98％为1S，2R立体异构体，而无论培养物中是否加入了茚。而在无细胞的摇瓶中仍为外消旋的顺式-1，2-茚满二醇。
表5.拆分研究总结
这种拆分作用在23升规模中进一步证实，当重复前面的步骤时得到最终的EE为93％。在这批中也得到了所需1S，2R-茚满二醇的极好EE(98％)，并证明了本方法的可重复性。
实施例4F1的大规模方案发酵A.种子驯化(seed tram)所用的有机体为恶臭假单孢菌F1(野生型)。采用单步种子驯化。种子培养基含30g/l胰胨豆胨培养基并无需调pH。培养物的冻干管在室温解冻，取0.5ml量用于接种2.8升摇瓶中的500ml种子培养基。种子在旋转摇床上以220rpm、2″摆幅于30℃培养8小时。含并两个摇瓶(得到种子总体积为1升)，并用于接种入生产发酵罐。
B.生产阶段对于四个实验的每一个，往三个200加仑发酵罐中加去离子水至工作体积630升。直接往每个罐中加入培养基成分(见表6)。用硫酸或氢氧化钠调pH至7.0。培养基在121-123℃灭菌35分钟。
表6生产培养基含下列成分(每升)成分 农度磷酸氢二钠10.5g磷酸二氢钾 5.5g精氨酸 4.0g硫酸铵 2.0g七水硫酸镁 0.6gCaCl2·2H2O130mgZnSO4·7H2O 22mgFeSO4·7H2O 14mgEDTA5mgMnSO4·H2O 3mgCuSO4·5H2O0.8mgCoCl2·6H2O0.5mg(NH4)2MoO4·4H2O0.36mgNa2B4O7·10H2O 0.35mg消泡剂 1mg硅油 100gC.发酵条件发酵先在30℃进行，反压0.5巴，气流100slpm，搅拌速度100rpm。在发酵过程中反压、气流、及搅拌速度自动升高以维持溶解氧强度处于或超过一个大气压下空气在培养基中的饱和值的50％。用25％硫酸和50％氢氧化钠溶液将pH控制在6.8～7.4间。
D.诱导及生物转化在4-8小时时，用Chemap针、合成橡胶管和一蠕动泵将20升硅油中的3.25kg甲苯和1.63kg茚的溶液加入发酵培养基中。
E.收获监测每批发酵中的氧利用率(OUR)。约24小时后，OUR降至低于1mmol/l/h。OUR下降后6-10小时收获一批。在此期间，发生不需要的异构体的降解(导致立体异构体过量从约60％升至大于97％)。每比平均值为330mg/l。
实施例5前面实施例中F1发酵产物的方案I.分离A.通过重力沉降作用除硅油将发酵培养液收获至1500加仑的不锈钢容器中。使全培养液沉降过夜。将含产物和发酵细胞的下层水层装入两个200加仑罐中。废硅油层和中间层装入55加仑的桶中供处理。B.膨胀床吸附准备一装有～85升溴化苯乙烯二乙烯苯树脂的玻璃柱(12英寸直径×96英寸长度)。水性培养液以1.5～2.5gpm流速从柱底部进样口进样。用过的培养液流出液从柱顶端移出并收集在55加仑的桶中。如果在用过的料液中用HPLC检测不到产物，则将其泵入化学污物管中。如果在用过的料液中检测到产物则保留桶内容物并在下一批开始时重新吸附到柱上。当所有的水性培养液均上样到柱中后，用去离子水向上洗柱，从柱中除去残留的培养液和固体。水洗过后用100加仑的95％水/5％乙腈向上洗柱。含水乙腈和水洗出液收集在55加仑的桶中。在下一批开始时含水乙腈和水洗出液中的任何产物都重吸附到树脂上。停止流动使树脂再沉降。用泵从柱顶端除去树脂上面的液体。产物用100加仑20％乙腈/80％水洗脱，流出液收集于5加仑瓶中。树脂用50加仑乙腈洗涤再生并用几倍床体积的去离子水洗涤重新平衡。C.富级分的浓缩/乙酸异丙酯抽提产物富级分在50加仑玻璃衬反应器中真空浓缩。富级分连续进样使液体量维持在最大工作体积直至加入所有富级分。浓缩至终体积为25加仑。这一过程有助于将含水浓缩物中的泡沫和乙腈降至最低。利用残留的真空将等体积的乙酸异丙酯加入水层中。内容物搅拌5分钟，重力沉降至少1小时后液相分层。下层残留水相装入55加仑桶中，上层有机抽提物也装入一个55加仑桶中。任何乳浊液层总随着水层一起移出。水层再装入50加仑反应器中，用等体积的乙酸异丙酯再抽提三次，在合并的富级分中回收95％以上的产物。贫抽提物(3和4)保留下来用于下一批的初抽提以减少溶剂用量。D.乙酸异丙酯浓缩/结晶在50加仑玻璃衬反应器中将乙酸异丙酯抽提物部分真空浓缩至7-10加仑。浓缩物移至5加仑瓶中。随后将浓缩物通过一中孔隙度的线滤器(line filter)加入一20升旋转蒸发仪中，除去一些褐色颗粒物质。抽提物进一步浓缩至约200克顺式-茚满二醇/升。在最后的浓缩过程中顺式-茚满二醇开始结晶，冷却至5-10℃并老化过夜后结晶完成。在一烧结玻璃滤器上真空过滤晶体并用冷(5℃)的乙酸异丙酯、乙酸异丙酯/己烷(1∶1)和己烷洗涤晶体。在不加热条件下真空干燥晶体。
实施例6421-5的方案种母发育一装有300ml种子培养基的2升无挡板摇瓶用于准备用于23升生产容器的种子培养物。种子培养基由3％胰胨豆胨培养液(TSB)组成。种子培养基就地高压灭菌20分钟。将装有421-5培养物的冻干管解冻，并在种子摇瓶冷却至室温后将300μl解冻的培养物无菌条件下移至种子摇瓶中。摇瓶在30℃于摇床中以200-250RPM培养14小时，然后用种子摇瓶中的全部内容物接种23升发酵罐。发酵/生物转化(23升规模)将表8所列的化学确定的培养基加入23升生产容器中，工作体积为15升。表7中列出了发酵的过程变量。
表7
在23升发酵罐中加入所有的盐和大豆油并就地灭菌1小时。葡萄糖单独灭菌并在开始时一次加入批量中。用全部300ml接种物接种该批量，并在表7所列过程变量条件下培养至28小时。
表8用于恶臭假单孢菌421-5发酵的半确定培养基的组成成分浓度1.葡萄糖#20mM2.(NH4)2SO410g/l3.K2HPO46g/l4.FeSO4·7H2O 0.03g/l5 MgSO4·7H2O 1.2g/l6.EDTA*0.0167g/l7.大豆油 20％(v/v)8.A-9溶液90ml#初浓度，其后以控制的速率加入葡萄糖。
*只有用葡萄糖时才加入。开始时以2.5g/l加入茚(试剂级，99+％)，10小时后的下一个10小时内每小时分批补充0.3g/l，下8小时内每2小时分批补充0.6g/l。开始用NaOH将pH控制在7.2，后来(约10小时)用NH4OH控制以避免氮不足。发酵6小时后，葡萄糖以4g/L/hr连续加入。连续加6-8小时后停止加入。在该批的整个过程中用搅拌和气流以级联方式将溶解氧控制在45％以上。当搅拌速度达到最大值750RPM后气流控制开始。用这种方案，发酵20小时后达到茚满二醇的峰值2g/L(80％EE)。
实施例7甲苯双加氧酶突变体的分离A.培养方法恶臭假单孢菌F1(DSM 6899)及其突变体用胰胨豆胨琼脂(TSA)或胰胨豆胨培养液(TSB)培养并维持。所有培养物在30℃培养。平板培养物于4℃贮存2-4周，用作转化实验的接种物源。液体培养物用20％(v/v)甘油1∶1稀释并于-70℃分等分贮存。在培养基配方中补入20g/L琼脂制备固体培养基。为了在甲苯蒸汽存在下培养固体培养基培养物，将含选择的固体培养基的100×15mm玻璃培养皿与15ml玻璃试管中的3-5ml甲苯一起放置在一玻璃干燥器中，并在合适的温度下培养。
B.茚向顺式-1S，2R-茚满二醇的转化-摇瓶规模含柠檬酸盐的基本盐培养基(MMC)或不含碳源的基本盐培养基(MM)用于茚向顺式-1S，2R-茚满二醇的转化，其组成如下(g/l)3-〔N-吗啉代〕-丙烷磺酸(MOPS)，20.9；二水柠檬酸钠，2.94；K2HPO4，2；(NH4)2SO4，1；MgSO4·7H2O，0.4；FeSO4·7H2O，0.010；A9溶液，2.5ml；pH，7.2。A9溶液组成如下(mg/L)H3BO3，300；ZnCl2，50；MnCl2·4H2O，30；CoCl2，200；CuCl2·2H2O，10；NiCl2·6H2O，20；NaMoO4·2H2O，30。在上面的配方中补入20g/l琼脂制备固体培养基。20ml基本盐培养基加5ml大豆油或硅油在250ml三挡板锥形瓶中灭菌。灭菌并冷却后，按需要在瓶中加入茚或甲苯。
当洗涤后的细胞用于转化实验时，使25ml过夜培养物在TSB上生长，随后离心并重悬于20ml MM培养基中。与2.5ml硅油和1g/l茚(按全部培养物体积计)一起，将细胞悬液移至一250ml三挡板锥形瓶中。培养物于30℃，180RPM旋转搅拌培养24小时，之后取出一份培养上清液(水性)用反相HPLC分析顺式-1S，2R-茚满二醇的浓度。
另外，茚向顺式-1S，2R-茚满二醇的转化通过摇瓶培养物中的活跃代谢细胞进行。一装有20ml MMC培养基、5ml大豆油和2.5g/l茚(按全部培养物体积计)的250ml三挡板锥形瓶用0.2ml过夜TSB培养物接种。生产摇瓶如上培养，每个摇瓶适当地抽提以确定顺式-1S，2R-茚满二醇量及立体异构体纯度。对于时间过程实验，每次培养的几个摇瓶均接种，在每个时间点上抽提全部摇瓶以确定顺式-1S，2R-茚满二醇的量及立体异构体纯度。
C.非甲苯依赖的培养物的分离方法两种突变和筛选方法用于产生在培养基中不需甲苯即能将茚转化成顺式-1S，2R-茚满二醇的恶臭假单孢菌F1突变体。两种筛选方法的核心是许多利用芳烃的微生物将吲哚转化为靛蓝(蓝色颜料)的能力(Ensley等，Science，222，167(1983)；Clarke P.H.等，FEMS Microbiol.Lett.24，109(1984))。甲苯双加氧酶将吲哚转化成顺式-吲哚-2，3-二氢二醇(Clarke等，1984年)。水的自发去除形成吲哚酚，随后被空气氧化产生靛蓝(Ensley等，上文，1983年)。
培养在甲苯蒸汽上的恶臭假单孢菌F1菌落在18-24小时内变为深蓝色，而培养在正常空气条件下(在培养基中含非诱导碳源)的菌落需要长达36小时才获得蓝色。因此吲哚向靛蓝的转化可作为双加氧酶活性的有用的生化标志，并可用于在甲苯不存在时检测双加氧酶活性。
在方法1中，细胞在TSB中于30℃培养过夜并用磷酸缓冲液(100mM，pH 7.2)稀释10-4。含3ml MMC培养基加0(对照)、10、20、30、40、50、75、或100mg/l ICR 191的若干18×150mm试管用0.1ml稀释接种物接种。试管培养物在暗处30℃以220RPM搅拌培养。培养16-18小时后，30mg/l ICR 191培养物仅有微量生长，而20mg/l ICR 191培养物具有近似于对照一半的生长水平。ICR 191浓度超过30mg/l完全抑制生长，而10mg/l浓度对生长没有可检测到的影响。离心收获20mg/l ICR 191培养物中的细胞，用磷酸缓冲液洗涤两次。
D突变株42l-5的分离在一选出的管中进行活细胞计数后，将1ml适合的稀释液(从而观察不到菌落融合)涂布到含改良的矿物质培养基(0.040g/l FeSO4)并含1mM吲哚作为双加氧酶活性指示剂的培养皿(24.5cm×24.5cm)中。于30℃培养约36小时后，几个平板显示出几个深蓝色菌落的存在。将总共16个菌落从平板上无菌挑出并再铺到相同的培养基上。再培养36小时后，这些分离株的每一个均接种到装有5ml胰胨豆胨培养液的管中。于30℃培养18小时后，每个管中加入1ml无菌硅油和5μl茚。各管再在相同的培养条件下培养24小时。离心后，用反相HPLC检测上清液中茚满二醇的存在。在这种非诱导条件下，发现分离株421-5产生约426mg/l茚，而其亲本培养物为100mg/L。在分离出突变体421-5(a.k.a.MB 5652)前，我们检查了约200,000个菌落。
对于方法2，离心收获一份TSB过夜培养物并用柠檬酸缓冲液(100mM，pH 5.5)洗涤两次。加入N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)至终浓度50mg/l，并于室温不时地搅拌培养。培养30分钟后，细胞用磷酸缓冲液洗涤两次并适当稀释。
将若干等份的突变群(0.1ml)涂布到1.00×15mm玻璃培养皿中的固体吲哚指示剂培养基上，并在甲苯存在下于30℃培养。挑出白色菌落(无靛蓝产生，双加氧酶和甲苯阴性)到TSA上。将单个双加氧酶阴性菌落接种到装有含硅油作为第二相并不含柠檬酸盐的基本培养基的250ml三挡板锥形瓶中。在硅油相中的培养物中加入甲苯至终总浓度5g/l。在30℃以180RPM旋转摇动培养48-72小时内，自发的甲苯阳性回复突变株开始长出。分离这些回复突变株培养物的菌落，并测定在摇瓶发酵过程中茚向顺式-1S，2R-茚满二醇的非甲苯依赖的转化。用这种方式分离的一个这样的培养物是419-11R3。
实施例8A.顺式-1S，2R-茚满二醇向顺式-1S-氨基-2R-茚满醇的转化实验
将顺式-1S，2R-茚满二醇(100g，0.66摩尔)于25℃加入乙腈(633mL)中，然后冷却至-25～-30℃。加入20％的发烟硫酸溶液(66.2mL，1.33摩尔)，保持温度低于-10℃。全部加入后使混合物升温至20℃，老化1.5小时，然后加入水(1000mL)。蒸馏乙腈溶剂直至内部温度达到近100℃，将混合物在此温度下老化4.5小时。将溶液浓缩至100克氨基茚满醇/升。产率86.7％，大于99％ee。B.从二醇开始用Ritter溶液的反离子对抽提后处理分离(-)顺式-氨基茚满醇
往装有温度计和顶部搅拌器的2升圆底烧瓶中加入548.7g Ritter溶液(50.0g步骤A的顺式-氨基茚满醇)和167ml 1-丁醇。开始加入50％NaOH，同时用水浴保持温度低于40℃。持续加入直至pH高于12。总共加入了103ml 50％NaOH。在加NaOH过程中混合物颜色变深。
将混合物置于分液漏斗中分层。然后用2×167mL 1-丁醇抽提水层。合并三个有机层并用溶于250mL水中的60.0g L-酒石酸(1.2摩尔当量)溶液抽提。分层后有机层进一步用3×125mL水抽提。合并的水层然后真空浓缩至220mL。一些固体已开始沉淀。
将浓缩物用30mL水淋入一装有温度计和顶部搅拌器的500mL圆底烧瓶中。开始加入50％NaOH。在加入过程中，用水浴将温度维持在45℃以下。在pH 8～9间顺式-氨基茚满醇开始结晶。持续加入NaOH至pH高于12。总共加入了42mL 50％NaOH。将混合物缓慢冷却至0-5℃，老化2小时，过滤(缓慢过滤)并用150ml 0～5℃水洗涤。在真空烘箱中用氮气吹，45℃干燥18小时。(-)顺式-氨基茚满醇的产量45.74g(96.6wt％)；2.1％反式-氨基茚满醇。C.从二醇开始用Dowex 50×8树脂柱对Ritter溶液进行后处理分离(-)-顺式-氨基茚满醇实验
准备一500mL Dowex 50×8(100目)树脂柱。用水先正洗后反洗柱。以1.5倍床体积/小时的流速将二醇Ritter溶液(550mL步骤A产物中的50.0g顺式-氨基茚满醇)上样到柱中。然后用600mL水洗柱。漏过率小于1％。
首先，试着用NaCl洗脱但效率不高。总共回收了12.3g顺式-氨基茚满醇。用500mL 20％MeCN水溶液洗柱后再用下面的NaOH洗脱。
在250mL 20％MeCN水溶液中溶解20.3g 50％NaOH。将该溶液向上泵入柱中。然后用100mL 20％MeCN淋洗。放置1.75小时。开始以1.5-2倍床体积流速洗脱柱。当溶剂到达树脂床时，用750mL 20％MeCN水溶液洗脱。洗脱出的顺式氨基茚满醇总量为16.7g。
在250mL 20％MeCN水溶液中溶解11.5g 50％NaOH。将该溶液向上泵入柱中。然后用100mL 20％MeCN连续淋洗。放置1.75小时。开始以1.5-2倍床体积流速洗脱柱。当溶剂到达树脂床时，用750mL 20％MeCN水溶液洗脱。洗脱出的顺式-氨基茚满醇总量为16.7g。
在250mL 20％MeCN水溶液中溶解2.7g 50％NaOH。将该溶液泵入柱中。开始以1.5-2倍床体积流速洗脱柱。当溶剂到达树脂床时，用500mL 20％MeCN水溶液洗脱。洗脱出的顺式-氨基茚满醇总量为3.0g。
用浓HCl将头两次洗脱的合并洗脱液的pH调至2.95。然后将该溶液真空浓缩至228mL。这个溶液随后用于不同的结晶实验。
用NaCl和NaOH洗脱的顺式-氨基茚满醇的总回收量为48.7g。
实施例9酰胺9的制备
将一装有热电偶探头、机械搅拌器和氮气入口连接器和打泡器的50L圆底烧瓶中的17.8L无水THF(KF＝55mg/mL)(KF代表Karl Fisher水滴定法)和三乙胺(868mL，6.22mol)中的(-)-顺式-1-氨基茚满-2-醇(884g，5.93mol)溶液，冷却至15℃。然后在75分钟时间里加入3-苯基丙酰氯(1000g，5.93mol)，同时用冰水冷却浴将内部温度保持在14-24℃间。加完后，混合物在18-20℃间老化30分钟，用HPLC分析检查(-)-顺式-1-氨基茚满-2-醇的消失。
反应进程用高效液相色谱(HPLC)分析监测25cm Dupont C8-RX柱，60∶40乙腈/10mM(KH2PO4/K2HPO4)，1.0mL/分，上样体积＝20mL，检测波长＝200nm，样品＝500倍稀释液。近似保留时间
保留时间(分钟)签定结果6.3 顺式-氨基茚满醇反应液用对甲苯磺酸吡啶鎓盐(241g，0.96mol，0.16当量)处理并搅拌10分钟(用等体积水稀释1mL样品后的混合物的pH在4.3-4.6间)。然后，加入2-甲氧基丙烯(1.27L，13.24mol，2.2当量)并将反应液在38-40℃加热2小时。将反应混合物冷却至20℃并用乙酸乙酯(12L)和5％NaHCO3水溶液(10L)分配。搅拌混合物并使之分层。用5％NaHCO3水溶液(10L)和水(4L)洗涤乙酸乙酯抽提物。乙酸乙酯抽提物利用常压蒸馏干燥并将溶剂换成环己烷(总体积约30L)。在蒸馏和浓缩结束时(20％体积百分比的乙酸乙酯抽提物)，使热环己烷溶液缓慢冷却至25℃结晶出产物。将所得的浆液进一步冷却至10℃并老化1小时。过滤分离产物并用冷(10℃)环己烷(2×800mL)洗涤湿滤饼。洗涤后的滤饼于40℃真空(26″Hg)干燥，得到1.65kg丙酮化合物9(86.4％，HPLC98％峰面积)。1H NMR(300.13MHz，CDCl3，主旋转异构体)δ7.36-7.14(m，9H)，5.03(d，J＝4.4，1H)，4.66(m，1H)，3.15(m，2H)，3.06(宽s，2H)，2.97(m，2H)，1.62(s，3H)，1.37(s，3H)；13C NMR(75.5MHz，CDCl3，主旋转异构体)δC168.8，140.9，140.8，140.6，128.6，128.5，128.4，127.1，126.3，125.8，124.1，96.5，78.6，65.9，38.4，36.2，31.9，26.5，24.1。元素分析计算值C21H23NO2C，78.47；H，7.21；N，4.36。实测值 C，78.65；H，7.24；N，4.40。
实施例10环氧化物11制备的甲苯磺酸酯法
装有热电偶、机械搅拌器、加液漏斗和氮气入口连接器的一50L四颈圆底烧瓶中的15.6L THF(KF＝22mg/ml)中的丙酮化物9(1000g，3.11mol)和2(S)-甲苯磺酸缩水甘油酯10(853g，3.74mol，1.2当量)溶液通过真空氮气吹扫抽气三次，并冷却至-56℃。然后在2小时时间里加入六甲基二硅氮化锂(LiN[(CH3)3Si]2)(2.6L，1.38M，1.15当量)，同时保持内部温度在-50～45℃之间。反应混合液于-45～-40℃搅拌1小时，然后在1小时时间内升温至-25℃。混合物在-25～22℃间搅拌4小时(或直至起始丙酮化物为3.0％峰面积)。
反应进程用HPLC分析监测25cm×4.6nm Zorbax硅胶柱，20％乙酸乙酯的己烷溶液，2.0mL/分，上样量＝20mL，检测波长＝254nm，样品＝100倍稀释液。近似保留时间保留时间(分钟) 鉴定结果5.5 酰胺96.5 甲苯磺酸缩水甘油酯1013.5环氧化物11反应混合物用-15℃的去离子水(6.7L)骤冷并用乙酸乙酯(10L)分配。搅拌混合物并使之分层。用1％NaHCO3水溶液(5L)和饱和NaCl(0.5L)的混合液洗涤乙酸乙酯抽提物。乙酸乙酯抽提物(28.3L)用真空蒸馏(28″Hg)浓缩并另加入乙酸乙酯至全部溶剂换成乙酸乙酯(终体积＝11.7L)。乙酸乙酯浓缩物进一步更换溶剂为MeOH以结晶产物，并浓缩至终体积3.2L。加入10L甲醇并收集10L蒸馏液以除去残留的乙酸乙酯溶剂。得到的浆液于22℃搅拌1小时，然后冷却至5℃并老化0.5小时。过滤分离产物并用冷甲醇(2×250mL)洗涤湿滤饼。洗涤后的滤饼于25℃真空(26″Hg)干燥得到727g环氧化物11(61.2％，HPLC分析占主要环氧化物面积的98 7％)。13C NMR(300MHz，CDCl3)171.1，140.6，140.5，139.6，129.6，128.8，128.2，127.2，126.8，125.6，124.1，96.8，79.2，65.8，50.0，48.0，44.8，39.2，37.4，36.2，26.6，24.1。
实施例11倒数第二个化合物14的制备
装备有机械搅拌器、回流冷凝器、蒸气浴、涂有特氟隆的热电偶和氮气入口的一72升四颈圆底烧瓶中异丙醇(2-丙醇，18.6L)中的2(S)-叔丁基羧酰胺-4-N-Boc-哌嗪12(1950g，6.83mol，＞99.5％ee)(ee＝立体异构体过量)和环氧化物11(2456g，97.5∶25的4S.R环氧化物混合物，6.51mol)的浆液加热回流(内部温度为84-85℃)。40分钟后，获得均一溶液。混合物加热回流28小时。
在回流过程中内部温度为84-85℃。反应进程用HPLC分析监测25cm Dupont C8-RX柱，60∶40乙腈/10mM(KH2PO4/K2HPO4)，1.0mL/分，检测波长＝220nm，上样量＝2μl，反应混合液用乙腈稀释至1mL。近似保留时间为
保留时间(分钟)鉴定结果4.8 哌嗪128.9 环氧化物1115.2 偶联产物1328小时后，剩余的环氧化物11和偶联产物13(HPLC分析)分别为1.5％峰面积和91-93％峰面积。将混合物冷却至0-5℃并加入20.9L 6N HCl，此过程中温度保持在15℃以下。加完HCl后将混合物升温至22℃。此时观察到有气体放出(异丁烯)。将混合物在20-22℃老化6小时。
反应进程用HPLC分析监测条件同上。近似保留时间为保留时间(分钟) 鉴定结果7.0 顺式-氨基茚满醇11.9倒数第二个化合物1415.1偶联产物13将混合物冷却至0℃并缓慢加入7.5L 50％NaOH将混合物pH调至pH＝11.6。在此过程中温度保持在25℃以下。混合物用乙酸乙酯(40L)和水(3L)分配。搅拌混合物并使之分层。将有机相(60L)减压(29″Hg)浓缩并将溶剂换为DMF并浓缩至终体积10.5L(KF＝.1.8mg/mL)。HPLC测定乙酸乙酯中14的产率为86.5％。DMF中的倒数第二个化合物14未经进一步纯化直接用于下一步实验。对于分离的1413C NMR(75.4MHz，CDCl3)δ175.2，170.5，140.8，140.5，139.9，129.1，128.5，127.9，126.8，126.5，125.2，124.2，73.0，66.0，64.8，62.2，57.5，49.5，47.9，46.4，45.3，39.6，39.3，38.2，28.9。
实施例12化合物J一水合物的制备
化合物J前一步中溶于DMF(10.5L，KF＝10mg/mL)的14溶液加入8L筛干的DMF(KF＜30mg/L)，并将混合物在30″Hg真空下蒸气浴加热，主要蒸除水和/或所有残存的异丙醇或乙酸乙酯溶剂。最终浓缩物体积为13.5L(KF＝1.8mg/mL)，然后在25℃的溶液中加入三乙胺(2.86L，20.51mol)，再加入3-甲基吡啶氯化物盐酸盐(96％，1287g，7.84mol)。所得浆液加热至68℃。
反应进程用HPLC分析监测，条件同前步。近似保留时间为保留时间(分钟) 鉴定结果2.7 DMF4.2 3-甲基比啶氯化物4.8 化合物J9.1 倒数第二个化合物14混合物于68℃老化直至残余的倒数第二个化合物14用HPLC分析显示小于0.3％峰面积。
混合物于68℃搅拌4小时，然后冷却至25℃并用乙酸乙酯(80L)和24L饱和NaHCO3水溶液和蒸馏水(14L)的混合液分配。混合物于55℃搅拌并使之分层。乙酸乙酯层于55℃用水(20L)洗涤三次。洗过的乙酸乙酯层在大气压力下浓缩至终体积30L。在大气压下浓缩结束时，在热溶液中加入水(560mL)并将混合物冷却至55℃。用化合物J单水合物接种。将混合物冷却至4℃，过滤收集产物。用冷乙酸乙酯(2×3L)洗涤产物，并于25℃真空罩中干燥，得到2905g(70 7％)化合物J一水合物白色固体。
实施例13吡嗪-2-叔丁基羧酰胺17
2-吡嗪甲酸(8) 3.35kg(27mol)草酰氯3.46kg(27.2mol)叔丁胺(KF＝460μg/ml) 9.36L(89mol)EtOAc(KF＝56μg/ml) 27LDMF 120mL1-丙醇30L将羧酸16悬浮于在N2下机械搅拌的72L三颈烧瓶中的27L EtOAc和120mL DMF中，并将悬浮液冷却至2℃。加入草酰氯，同时将温度保持在5～8℃间。
在5小时内加完草酰氯。在放热的加入过程中放出CO和CO2。形成的HCl大部分留在溶液中。出现的沉淀可能为吡嗪酰氯的HCl盐。通过用叔丁胺骤冷反应中的无水样品进行酰氯形成的测定。反应结束后剩余的酸16小于0.7％。
酰氯形成完成的测定是很重要的，因为不完全的反应将导致双叔丁基草酰胺杂质的形成。
该反应可用HPLC监测25cm Dupont Zorbax RXC8柱，1mL/分流速，检测波长为250nm；30分钟时用98％0.1％H3PO4水溶液和2％CH3CN到50％H3PO4水溶液和50％CH3CN的线性梯度洗脱。保留时间酸16＝10.7分，酰胺17＝28.1分。
反应混合物于5℃老化14时。所得浆液冷却至0℃并加入叔丁胺，加入速度要保持内部温度低于20℃。
加完需6小时，因为反应是非常放热的。一小部分产生的盐酸叔丁铵从反应液中析出，为蓬松的白色固体。
将混合物于18℃再老化30分钟。过滤移出沉淀的铵盐。滤饼用12LEtOAc洗涤。合并的有机相用6L 3％NaHCO3和2×2L饱和NaCl水溶液洗涤。有机相用200g Darco G60活性炭处理并用Solka Folk过滤。滤饼用4L EtOAc洗涤。
活性炭处理有效地去除了产物中的一些紫色。
17的EtOAc溶液于10毫巴浓缩至原体积的25％。加入30L 1-丙醇，继续蒸馏至终体积为20L。
这时，EtOAc已低于1H NMR的检测限(＜1％)。在这一溶剂改变中内部温度低于30℃。3的1-丙醇/EtOAc溶液于大气压力下回流几天时是稳定的。
一份试样蒸发后得到一黄褐色固体，熔点87-88℃。13C NMR(75MHz，CDCl3，ppm)161.8，146.8，145.0，143.8，142.1，51.0，28.5。
实施例14外消旋2-叔丁基羧酰胺哌嗪18
材料2.4kg(13.4mol)吡嗪2-叔丁基羧酰胺17的1-丙醇溶液12L20％Pd(OH)2/C 16％(重量)水144g。
将吡嗪-2-叔丁基羧酰胺17的1-丙醇溶液放入5加仑高压釜内。加入催化剂，混合物在40psi(3大气压)H2中于65℃氢化。
24小时后反应已吸收了理论量的氢气，GC(气相色谱)表明17小于1％。冷却混合物并用N2吹扫，用Solka Floc过滤移出催化剂。催化剂用2L温1-丙醇洗涤。
发现在洗涤滤饼时用温1-丙醇提高了过滤效果并减小了滤饼中产物的损失。
反应用GC监测30m Megabore柱，以10℃/分速率从100℃升温至160℃，保持5分钟，然后以10℃/分升温至250℃，保留时间17＝7.0分，18＝9.4分。反应也可用TLC(薄层层析)监测，以EtOAc/MeOH(50∶50)作为溶剂，茚三酮作为展开剂。
试样蒸干后表明酰胺化和氢化的总产率为88％，18的浓度为133g/L。
试样蒸干后得到的18为白色固体，熔点为150-151℃；13C NMR(75MHz，D2O，ppm)173.5，59.8，52.0，48.7，45.0，44.8，28.7。
实施例15(S)-2-叔丁基羧酰胺哌嗪双(S)-樟脑磺酸盐(S)-19
材料外消旋-2-叔丁基羧酰胺哌嗪184.10kg(22.12mol)的1-丙醇溶液 25.5kg溶剂(S)-(+)-10-樟脑磺酸10.0kg(43.2mol)1-丙醇 12L乙腈 39L水 2.4L
将胺18的1-丙醇溶液加入一连有批量浓缩器的100L烧瓶中。将溶液于10毫巴低于25℃浓缩至约12L。
这时产物已从溶液中沉淀出来，但当混合物加热至50℃时产物又溶于溶液中。
均一试样分析表明18的浓度为341g/l。浓度由HPLC测定25cmDupont Zorbax RXC8柱，流速1.5mL/分，检测波长为210nm，(98/2)CH3CN/0.1％H3PO4水溶液无梯度洗脱。18的保留时间2.5分。
加入乙腈(39L)和水(2.4L)后得到澄清的微棕色溶液。
KF滴定测定的水含量和1H NMR积分测定的CH3CN/1-丙醇比表明CH3CN/l-丙醇/H2O比例为26/8/1.6。溶液中的浓度为72.2g/L。
用30分钟时间于20℃分4批加入(S)-10-樟脑磺酸(CSA)。加完CSA后温度升至40℃。几分钟后形成厚厚的白色沉淀。将白色浆液加热至76℃以溶解所有固体，然后令微棕色溶液于8小时内冷却至21℃。
产物于62℃沉淀。产物未在21℃老化即过滤，用5L CH3CN/l-丙醇/H2O 26/8/1.6溶剂混合物洗涤滤饼。将其于35℃真空炉中用N2吹扫干燥，得5.6kg(39％)19，为白色晶状固体，熔点288-290℃(分解)，[α]D25＝18.9°(c＝0.37，H2O)。13C NMR(75MHz，D2O，ppm)222.0，164.0，59.3，54.9，53.3，49.0，48.1，43.6，43.5，43.1，40.6，40.4，28.5，27.2，25.4，19.9，19.8。
根据下面的手性HPLC检测，物料中的ee为95％将一份19试样(33mg)悬浮于4mL EtOH和1mL Et3N中。加入Boc2O(11mg)，使反应混合液老化1小时。于真空中除去全部溶剂，残余物溶于约1mLEtOAc中。经一含SiO2的巴氏滴管过滤，用EtOAc作洗脱剂，蒸干的各产物级分重新溶解于己烷，约1mg/ml。在Daicel Chiracell AS柱上分离立体异构体，用己烷/IPA(97∶3)溶剂体系，流速1mL/分，检测波长228nm。保留时间S对映体＝7.4分，R＝9.7分。
实施例16由盐19制备(S)-2-叔丁基羧酰胺-4-叔丁氧羰基哌嗪12
材料(S)-2-叔丁基羧酰胺哌嗪双(S)-(+)-CSA盐19，95％ee 5.54kg(8.53mol)二碳酸二叔丁基酯1.86kg(8.53mol)Et3N 5.95L(42.6mol)EtOH Punctilious 200 proof 55LEtOAc 2L往一具有加样漏斗的100L三颈烧瓶中的(S)-CSA盐19中于N2下加入EtOH，然后于25℃加入三乙胺。在加入Et3N后固体很容易溶解。将Boc2O溶于EtOAc并加到加样漏斗中。加入Boc2O EtOAc溶液的速率使温度保持在25℃以下。加样持续3小时。加完Boc2O溶液后使反应混合物老化1小时。
反应可用HPLC监测25cm Dupont Zorbax RXC8柱，流速1mL/分，检测波长为228nm；用NaOH调pH＝6.8的(50/50)CH3CN/0.1M KH2PO4无梯度洗脱。12的保留时间＝7.2分。用与前一步相同的系统进行手性测定。反应也可用TLC监测，以100％的EtOAc作为溶剂(Rf＝0.7)。
在一10毫巴真空的批量型浓缩器中，在内部温度低于20℃条件下将溶液浓缩至约10L。缓慢加入20L EtOAc并重浓缩至约10L完成溶剂转换。用60L EtOAc将反应混合液洗入一提取器中。用16L 5％Na2CO3水溶液、2×10L去离子水和2×6L饱和氯化钠水溶液洗涤有机相。用20L EtOAc反抽提合并的水相洗涤物并用2×3L水和2×4L饱和氯化钠水溶液洗涤有机相。合并的EtOAc抽提物在10毫巴真空，内部温度低于20℃的100L批量型浓缩器中浓缩至约8L。缓慢加入约20L环己烷并重浓缩至约8L使溶剂换成环己烷。向浆液中加入5L环己烷和280mL EtOAc，当所有试剂均溶解后加热回流。冷却溶液并于58℃加入晶种(10g)。在4小时内将浆液冷却至22℃，在22℃老化1小时后过滤分离产物。用1.8L环己烷洗涤滤饼，并于真空炉中35℃ N2吹扫干燥，得到1.87kg 12(77％，HPLC分析结果大于99.9％峰面积，R-异构体低于检测水平)，为微黄褐色粉末。[α]D25＝22.0°(c＝0.20，MeOH)，熔点107℃；13C NMR(75MHz，CD3Cl3，ppm)170.1，154.5，79.8，58.7，50.6，46.6，43.6，43.4，28.6，28.3。
实施例17外消旋的茚氧化物的制备将茚(95％，122mL)溶于甲醇(812mL)和乙腈(348mL)，然后过滤。滤液用0.05M二碱价磷酸钠(116mL)稀释，然后用1M氢氧化钠水溶液调至pH 10.5。过氧化氢水溶液(35％，105mL)用水(53mL)稀释，并用3小时时间加入，此过程中保持温度处于25℃，并用1M氢氧化钠水溶液(共120mL)保持内部pH为10.5。
6小时后，加入1M偏亚硫酸氢钠水溶液(26mL)，此过程中加入1M NaOH水溶液(39mL)保持pH高于8.3。加入水(700mL)并用二氯甲烷(580mL和300mL)抽提混合物。将含茚氧化物(117g)的合并的有机抽提物浓缩至600mL。
实施例18微生物表达的HIV蛋白酶抑制测定大肠杆菌表达的蛋白酶与肽底物〔Val-Ser-Gln-Asn-(β萘基)Ala-Pro-Ile-Val，反应开始时为0.5mg/mL〕反应的抑制研究在50mM乙酸钠，pH 5.5中于30℃进行1小时。将溶于1.0μlDMSO的不同浓度的抑制剂加入25μl肽水溶液中。加入15μl溶于0.133M乙酸钠pH 5.5和1％牛血清白蛋白溶液的0.33nM蛋白酶(0.11ng)启动反应。反应用160μl 5％磷酸终止。反应产物用HPLC分离(VYDAC宽孔5cm C-18反相柱，乙腈梯度，0.1％磷酸)。反应的抑制程度由产物的峰高确定。独立合成的产物的HPLC作为定量标准并作为产物组成的证明。化合物J的IC50约为0.6nM。
尽管前面的说明书介绍了本发明的原理，也提供了旨在举例说明的实施例，应当理解本发明的实施包括所有一般的变更、修正和改进，它们均在下面的权利要求书及其等同物范围之内。
权利要求
1.一种合成(1S，2R)-茚满二醇的方法，该方法包括以下步骤a)使一定量的甲苯双加氧酶与一定量的茚接触；b)发酵所得混合物；c)获得(1S，2R)-茚满二醇。
2.一种合成基本上不含任何立体异构体的(1S，2R)-茚满二醇的方法，该方法包括以下步骤a)使一定量的甲苯双加氧酶与一定量的茚接触；b)发酵所得混合物；c)纯化(1S，2R)-茚满二醇；d)对步骤c)产物进行手性特异结晶；e)得到基本上不含任何立体异构体的(1S，2R)-茚满二醇。
3.一种合成(1S，2R)-茚满二醇的方法，该方法包括以下步骤a)使一定量的双加氧酶与一定量的茚接触；b)发酵所得混合物；c)得到(1S，2R)-茚满二醇。
4一种合成基本上不含任何立体异构体的(1S，2R)-茚满二醇的方法，该方法包括以下步骤a)使一定量的双加氧酶与一定量的茚接触；b)发酵所得混合物；c)纯化(1S，2R)-茚满二醇；d)对步骤c)的产物进行手性特异结晶；e)得到基本上不含任何立体异构体的(1S，2R)-茚满二醇。
5.一种合成基本上不含任何立体异构体的(1S)-氨基-(2R)-茚满醇的方法，该方法包括以下步骤a)使一定量的甲苯双加氧酶与一定量的茚接触；b)发酵所得混合物；c)纯化(1S，2R)-茚满二醇；d)对步骤c)的产物进行手性特异结晶；e)得到基本上不含任何立体异构体的(1S，2R)-茚满二醇；f)将一当量的步骤e)的(1S，2R)-茚满二醇溶于过量的乙腈中得到第二种混合物，将第二种混合物保持在约-40℃～25℃间；g)向其中混入过量当量的强酸，并将反应保持在约-40℃～25℃间；h)得到基本上不含任何立体异构体的(1S)-氨基-(2R)-茚满醇。
6.一种合成基本上不含任何立体异构体的(1S)-氨基-(2R)-茚满醇的方法，该方法包括以下步骤a)使一定量的双加氧酶与一定量的茚接触；b)发酵所得混合物；c)纯化(1S，2R)-茚满二醇；d)对步骤c)的产物进行手性特异结晶；e)得到基本上不含任何立体异构体的(1S，2R)-茚满二醇；f)将一当量的步骤e)的(1S，2R)-茚满二醇溶于过量的乙腈中得到第二种混合物，将第二种混合物维持在约-40℃～25℃间；g)向其中混入过量当量的强酸，并将反应维持在约-40℃～25℃间；h)得到基本上不含任何立体异构体的(1S)-氨基-(2R)-茚满醇。
7.一种从顺式-(1S，2R)-茚满二醇和顺式-(1R，2S)-茚满二醇的混合物中除去顺式-(1R，2S)-茚满二醇的生物拆分方法，该方法包括以下步骤a)使一定量的二氢二醇脱氢酶与顺式-(1S，2R)-茚满二醇和顺式-(1R，2S)-茚满二醇的混合物接触；b)发酵所得混合物；c)得到基本上不含立体异构体顺式-(IR，2S)-茚满二醇的顺式-(1S，2R)-茚满二醇。
8.恶臭假单孢菌421-5即ATCC 55687的纯培养物。
9.权利要求5或6的方法，该方法进一步包括以下附加步骤i)对步骤h)的产物进行反离子对抽提；j)得到基本上纯的(1S)-氨基-(2R)茚满醇。
10.权利要求5或6的方法，该方法进一步包括以下附加步骤i)对步骤h)的产物进行阳离子交换色谱；j)得到基本上纯的(1S)-氨基-(2R)茚满醇。
11.权利要求1、2或5中任一项的方法，其中甲苯双加氧酶来自恶臭假单孢菌F1，也称ATCC 55688。
12.权利要求3、4或6中任一项的方法，其中双加氧酶来自恶臭假单孢菌421-5，也称ATCC 55687。
13.权利要求7的方法，其中二氢二醇脱氢酶来自恶臭假单孢菌F1，也称ATCC 55688，或恶臭假单孢菌421-5，也称ATCC 55687。
全文摘要
公开了一种将茚生物转化为基本上不含任何立体异构体的(1S)－氨基－(2R)－茚满醇的方法,该方法先通过双加氧酶的作用,再通过几个化学步骤,例如,手性特异结晶作用、在乙腈存在下用强酸处理。
文档编号C07C35/00GK1194006SQ96196419
公开日1998年9月23日 申请日期1996年6月14日 优先权日1995年6月20日
发明者B·C·布克兰德, M·M·查尔特莱, N·C·肯诺斯, F·P·盖利奥特, R·L·格雷斯哈姆, C·Y·李, R·C·奥勒温斯基, P·J·雷德尔, F·E·罗伯特, C·H·瑟纳纳雅克, T·R·维尔霍文 申请人:麦克公司