专利名称：制备抗生素的方法
技术领域：
本发明涉及制备抗生素的方法，其中β-内酰胺核被酰化，抗生素从反应混合物中回收，然后处理剩余母液。
在制备涉及用酰化剂酰化β-内酰胺核的抗生素中，例如，D-苯基甘氨酸的衍生，回收抗生素和处理反应混合物一般比较困难。例如，WO-A-93/12250描述的酰化反应从来没有进行完全并且阻碍了终产物的最后纯化，因为酸/碱比例和存在的其它一些组分(特别是如US-A-4003896中对于制备头孢氨苄中的7-ADCA和苯基甘氨酸)的溶解性与终产物的这些性质差别甚小。结果，发生共沉淀，由此得到不纯的抗生素，即头孢氨苄。在WO-A-93/12250和US-A-4003896中，建议使用络合剂如萘酚。但是，其带来的缺点在于必须加入与方法无关的附加物质。
本发明目的是提供简单、普遍和通用的方法，即使抗生素以纯的形式回收，不使用与该方法无关的有机化合物并且没有大量的经济损失(起始原料)，即β-内酰胺核。
实现本发明在于在处理母液(其中仍含有相对高浓度的抗生素)步骤时进行水解反应，然后至少部分β-内酰胺核例如在酰化反应中再使用。
酰化反应可以用化学法或酶法进行。对于化学酰化及随后的处理，外消旋化一般也导致非常少量的具有不正常侧链对映异构体的酰化产物的形成。如果母液中的酰化产物被循环，可能发生这种副产物的大量积累。使酰化产物和酰化剂(侧链)再进行水解的本发明方法提供了解决该问题的另一优点。
本发明优选用酶进行酰化反应。在先有技术领域的方法中，在酶酰化反应中必须使用大大过量的酰化剂以保证β-内酰胺核抗生素的高产率。其带来的缺点是由于水解发生酰化剂的大量损失或者不得不处理大量的反应混合物(回收固态抗生素后留下的)。
本申请人现在发现一种在酰化反应期间避免使用大大过量的酰化剂而且β-内酰胺核损失有限的方法，即将母液经过水解反应，其中抗生素仍在母液中，该方法将母液分解成起始化合物并且酰化剂也被水解，然后有能力回收或者再循环β-内酰胺核。事实很明显，本发明方法能使方法简化，无需β-内酰胺核的完全转化，同时仅发生少量β-内酰胺核的损失。
令人惊奇地，已经发现β-内酰胺核溶解性受在反应混合物中存在的剩余酰化剂和抗生素的影响，在某种意义上说，酰化剂和抗生素浓度相对高时β-内酰胺核的溶解性出人意料地高。结果发现，通过水解分离抗生素后所得母液(其导致抗生素和酰化剂的水解)以固体状态回收大量β-内酰胺核是可能的。而且发现，回收的固态β-内酰胺核比没有有效进行母液水解的方法中得到的更纯。特别是β-内酰胺核中的α-取代的乙酸的含量显然已经被大大降低，结果，令人惊奇地大大影响了酰化反应速度。具体地，7-ADCA中的苯基乙酸的含量和6-APA中的苯基或苯氧基乙酸明显被大大降低。另外，显然β-内酰胺核晶体中含有少量粘着水分即少量杂质。另外的优点明显在于由于低溶解性的β-内酰胺核催化剂在没有大量损失下也能被洗涤。结果意味着在再循环的抗生素积累中可能存在较少的杂质。
水解反应后得到的β-内酰胺核构成在酶法制备β-内酰胺抗生素中具有特别优点的新组合物。申请人已经发现水解后回收β-内酰胺核中的游离苯基或苯氧基乙酸含量明显低于β-内酰胺核起始原料中的含量，具体地，对于7-ADCAβ-内酰胺核，其中7-ADCA起始原料中游离的苯基乙酸含量为120ppm，水解后得到的7-ADCA中的游离的苯基乙酸含量为69ppm；对于6-APA相应的数字为30ppm和＜15ppm(相对于β-内酰胺核的量计算ppm)。因此，本发明还涉及苯基乙酸小于100，特别是小于80，优选小于70ppm的7-ADCA，以及α-芳基-或芳氧基乙酸，特别是α-苯基或α-苯氧基乙酸小于20，优选小于15ppm的6-APA。
本发明方法的另一个优点是作为一般价值意义上的规律，水解过的酰化剂可被有效地回收。
溶液中β-内酰胺核可任意被再循环至水解后的酰化反应中。而且，例如，优选通过降低pH和分离固体状态的β-内酰胺核沉淀回收β-内酰胺核。水解后的酰化剂可以在整个方法的各个阶段回收，例如，在水解反应后，回收β-内酰胺核后或者浓缩反应后。
水解优选在适当的酶存在下进行。用于酶水解反应的适当的酶是例如，用于β-内酰胺核制备和酶酰化反应中的酶，例如酰胺酶或酰化酶，特别是青霉素酰胺酶或者酰化酶。这些酶例如J.G.Shewale等人在ProcessBiochemistry，1989年8月，第146-154页及Process BiochemistryInternational，1990年6月，第97-103页中所述。合适的酶的实例是由醋酐菌属(Acetobacter)，特别是巴斯得氏醋杆菌(Acetobaeterpasteurianum)，气单孢菌属(Aeromones)，产碱杆菌属(Alcaligenes)，特别是粪产碱杆菌(Alcaligene faecalis)，Aphanocladium，芽孢杆菌属(Bacillussp.)，特别是巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，头孢属(Cephalosporium)，埃希氏杆菌属(Escherichia)，特别是大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)，黄杆菌属(Flavobacterium)，Kluyvera，枝动菌属(Mycoplana)，鱼精蛋白杆菌属(Protaminobacter)，假单孢菌属(Pseudomonas)，黄单孢菌属(Xanthomonas)，特别是柑橘单孢菌(Xanthomonas citri)衍生的酶。
优选使用固定化酶，因为这种酶容易被分离并且被重复使用。适合的固定化技术如EP-A-222462中所述。另一种适合的技术为将青霉素G酰化酶固定在含有凝胶剂，例如明胶，和具有游离氨基的聚合物，例如藻酸胺，脱乙酰壳多糖或聚乙烯亚胺的载体上。如果除了固定化酶外，其它固体物质也存在，则用WO-A-9212782所述方法进行分离可得到好的结果。这种固定化酶是已知的并且为商品。
适合酶水解反应的酶显然是由巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)或粪产碱杆菌(Alcaligene faecalis)得到的青霉素-G酰化酶，如EP-A-453047所述。其它适宜的酶是从Boehringer Mannheim Gmbh得到的大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)，其是名称为“Enzygel”的商品，从大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)得到的并且利用上述技术固定化的青霉素-G酰化酶，及从Recordati得到的固定化青霉素-G酰化酶。
回收抗生素的适合的方法是例如酰化后使所得反应混合物的pH降低，pH可为5-10，特别是6-10，优选6-9，特别优选7-8.5，结果引起抗生素的选择性沉淀；首先，任意将反应混合物的pH值调至5-10，特别是6-10，优选6-9，特别优选7-8.5，和/或除去固体。
回收抗生素的最佳pH取决于混合物的组分，并选择最佳分离β-内酰胺核及抗生素。实际上，最佳pH一方面受回收抗生素的高纯度(如果抗生素以相对高的pH回收，那么抗生素仍部分保留在溶液中，而β-内酰胺核完全保留在溶液中)的影响，另一方面，受其高产率的影响(如果以相对低pH回收抗生素，那么抗生素已经完全彻底地沉淀，同时部分β-内酰胺核也已经沉淀)。本领域技术人员很容易根据给定情况确定最佳pH。
根据本发明可以用几种方法降低pH，例如，可通过化学方法即加入酸进行，例如，加入无机酸或羧酸，特别是硫酸，盐酸，硝酸，乙酸或甲酸。也可以使用另一种的方法，例如，如果D-苯基甘氨酰胺(PGA)已经用作酰化反应的酰化剂或者如果已经使用D-苯基甘氨酸的酯(PGM)作为酰化剂并且pH已经在酰化反应期间通过与氨研磨保持常数，在这种情况下可以用物理方法除去氨降低pH。适宜的物理脱除法包括例如蒸汽或惰性气体脱除；减压(蒸汽)蒸馏，特别是薄膜蒸发；喷雾塔中蒸发；气体膜分离或电透析。
进行水解反应的温度没有特别限制并且优选0-50℃，特别是5-40℃，优选15-30℃。
对进行水解反应的pH没有特别限制，优选6-9，特别是7-8。
本发明方法可被用于制备β-内酰胺抗生素，例如头孢氨苄，氨苄西林，阿莫西林，头孢克洛，头孢拉定，头孢羟氨苄，头孢噻肟和头孢唑林等。
可以用于本发明的适合β-内酰胺核的实例是各种青霉素酸衍生物，例如6-氨基青霉素酸(6-APA)，和头孢菌素酸衍生物，例如有或没有3-位取代基的7-氨基头孢菌素酸(7-ACA)，例如7-氨基脱乙酰氧基头孢菌素酸(7-ADCA)和7-氨基-3-氯头孢菌素酸(7-ACCA)。
在(酶)酰化反应中，酰化剂可以是例如活化形式的苯基甘氨酸，优选酰胺或者酯，例如，甲基酯；适合的苯基甘氨酸有例如取代的或者非取代的苯基甘氨酸，特别是苯基甘氨酸，对-羟基苯基甘氨酸，二氢苯基甘氨酸。
酶酰化反应通常在温度低于40℃，优选0-35℃之间进行。进行酶酰化反应的pH一般为5-10，特别是6-10，优选6-9之间，特别是6.5-9之间。
实际中(酶)酰化反应及进一步处理反应混合物通常在水中进行。反应混合物中也任选含有有机溶剂或有机溶剂的混合物，优选小于30％(体积)。可以使用的有机溶剂的实例是具有1-7个碳原子的醇类，例如单醇，特别是甲醇或乙醇；二醇，特别是乙二醇或三醇，特别是甘油。
本发明方法的一个实例，即涉及从7-ADCA和D-苯基甘氨酰胺(PGA)制备头孢氨苄的方法详细描述如下。在该实例中，对酶酰化反应后所得pH介于8-10并且含有头孢氨苄，7-ADCA，PGA和D-苯基甘氨酸(PG)的反应混合物进行处理以分离其所含主要由固定化酶和可能有PG组成的固体。然后将剩余液体混合物的pH降低至6-8，特别是6.5-7.5，结果形成主要含有头孢氨苄的沉淀，之后回收固体头孢氨苄。在该优选实例中将剩余液体混合物经过酶水解，结果将剩余的溶解的头孢氨苄及剩余的PGA水解成7-ADCA和PG水解成PG；PG沉淀彻底完全并可例如用过滤分离。如果需要，可以在水解反应期间通过悬浮于反应器外的过滤器循环(部分或完全)除去PG。然后可以从剩余的混合物中分离7-ADCA，例如进一步降低pH后引起7-ADCA沉淀；然后可将其分离，例如通过过滤或离心，并再用于酰化反应中。
在本发明范围内各种组分可以游离形式或者盐形式存在。在所有情况下所述pH值在室温用pH刻度电极测定。
本发明进一步用下列实施例说明，但是这些实施例并不限制本发明。缩写AMOX＝阿莫西林三水合物AMPI＝氨苄西林三水合物CEX ＝头孢氨苄CEX.H2O＝头孢氨苄一水合物6-APA ＝6-氨基青霉素酸7-ADCA ＝7-氨基脱乙酰氧基头孢菌素酸PGA ＝D-苯基甘氨酰胺PG ＝D-苯基甘氨酸HPGA＝D-对羟基苯基甘氨酰胺HPG ＝D-对羟基苯基甘氨酸HPG-Me＝D-对羟基苯基甘氨酸甲酯实施例IPGA和PEX对7-ADCA溶解性的影响制备下列合成的混合物，最终pH为4.5。混合物1水中3％(m/m)7-ADCA混合物2水中3％(m/m)7-ADCA和0.4％(m/m)PG混合物3水中3％(m/m)7-ADCA，0.4％(m/m)PG和1.5％(m/m)PGA混合物4水中3％(m/m)7-ADCA，0.4％(m/m)PG，1.5％(m/m)PGA和3.0％(m/m)CEX.H2O混合物5水中3％(m/m)7-ADCA和3.0％(m/m)CEX.H2O将样品在一个振动细菌培养器(20℃)中培养2小时后取出并且测定每种组分的溶解浓度。<
<p>该表说明仅PG，PGA和CEX结合时才对7-ADCA的溶解性有显著地影响。实施例IIPGA和AMPI对6-APA溶解性的影响制备下列合成的混合物，最终pH为4.5。混合物1水中3％(m/m)6-APA混合物2水中3％(m/m)6-APA和0.4％(m/m)PG混合物3水中3％(m/m)6-APA，0.4％(m/m)PG和1.5％(m/m)PGA混合物4水中3％(m/m)6-APA，0.4％(m/m)PG，1.5％(m/m)PGA和3.0％(m/m)AMPI将样品在一个振动细菌培养器(20℃)中培养2小时后取出并且测定每种组分的溶解浓度。结果
该表说明仅混合物4对6-APA的溶解性有显著地影响。实施例IIIHPGA/HPG-Me和AMOX对6-APA溶解性的影响制备下列合成的混合物，最终pH为4.5混合物1
水中3％(m/m)6-APA混合物2水中3％(m/m)6-APA和0.5％(m/m)HPG混合物3水中3％(m/m)6-APA，0.5％(m/m)HPG和1.5％(m/m)HPGA混合物4水中3％(m/m)6-APA，0.5％(m/m)HPG和2.0％(m/m)HPG-Me混合物5；水中3％(m/m)6-APA，0.5％(m/m)HPG，1.5％(m/m)HPGA和3.0％AMOX混合物6水中3％(m/m)6-APA，0.5％(m/m)HPG，2.0％(m/m)HPG-Me和3.0％AMOX将样品在一个振动细菌培养器(20℃)中培养2小时后取出并且测定每种组分的溶解浓度。
该表说明仅混合物5和6对6-APA的溶解性有显著地影响。比较实施例A通过酸化从CEX母液中回收7-ADCA将1850g含有12.0％(m/m)7-ADCA和7.2％(m/m)PGA的浆液装入含有150g Enzygel的筛底反应器(孔径40μm)中。在7-ADCA中苯基乙酸的含量为120ppm。起始pH为7.8并且保持温度为5℃(用N2连续冲洗，以500r.p.m.速率搅拌)。
保温3小时后，将反应混合物(最终pH8.4)经过筛底分离并且用185g水洗涤剩余的酶。
合并两种流体得到含有11.5％CEX.H2O，4.5％7-ADCA，1.5％PGA和0.6％PG的澄清溶液。然后通过选择性结晶回收CEX.H2O。为了达到此效果，将H2SO4(25％(m/m))和所述溶液同时装入结晶容器(pH7.0，30℃)中。重结晶30分钟后离心分离CEX.H2O结晶，先后用水和丙酮/水(80∶20)混合物洗涤。干燥后得到168g CEX.H2O。母液及CEX.H2O洗液合并后具有下列组分CEX.H2O2.6％(m/m)，7-ADCA4.2％(m/m)，PGA1.4％(m/m)，PG0.5％(m/m)。
当再用25％H2SO4酸化上述溶液时，大部分有用的β-内酰胺核可以结晶，分离和再循环。所得母液具有下列组分1.8％(m/m)CEX.H2O，0.28％(m/m)7-ADCA，1.4％(m/m)PGA和0.5％(m/m)PG。实施例IV通过酶水解CEX母液然后酸化，从CEX母液中回收7-ADCA用NH4OH将CEX.H2O母液及CEX.H2O洗液(如比较实施例A所述得到)调节至pH为7.6并且温度为30℃。然后将该溶液装入含有200g从Recordati得到的固定化青霉素-G酰化酶的筛底反应器(孔径40μm)中。反应3小时后(500r.p.m.)将含有固体形式的PG反应混合物排出并且用水洗涤酶和固体形式的PG以减少β-内酰胺核的损失。如果两种溶液已经合并可过滤分离PC结晶。所得滤液具有下列组分4.2％(m/m)7-ADCA，0.04％(m/m)CEX.H2O，0.01％(m/m)PGA和0.54％(m/m)PG。
用H2SO4(25％)酸化上述母液至pH4.5，使7-ADCA结晶。离心分离7-ADCA晶体后，得到β-内酰胺核含量非常低的母液0.04％(m/m)CEX.H2O，0.08％(m/m)7-ADCA。在7-ADCA中苯基乙酸的含量为69ppm。实施例V将水解反应后得到的7-ADCA用于酶酰化反应。
酰化反应以实施例IV(或比较实施例A)相同的方式进行，除了使用一半7-ADCA与实施例IV相同外，另一半由实施例IV水解后得到的7-ADCA组成，保温时间为2小时。所得处理液体流的组成基本上相同并且得到相同产率的头孢氨苄。
权利要求
1.一种制备抗生素的方法，其中β-内酰胺核被酰化，抗生素从反应混合物中回收，然后处理剩余母液，其特征在于在处理步骤中母液经过酶水解反应然后至少部分β-内酰胺核被再使用。
2.根据权利要求1的方法，其中进行酶酰化反应。
3.根据权利要求1或2的方法，其中水解反应在选自粪产碱杆菌(Alcaligenefaecalis)，大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)和柑橘单孢菌(Xanthomonascitri)酶存在下进行的。
4.根据权利要求1-3之一的方法，其中酶是以固定化形式被使用的。
5.根据权利要求1-4之一的方法，其中水解反应是在pH为6-8.5之间进行的。
6.根据权利要求1-5之一的方法，其中抗生素通过降低pH被回收。
7.根据权利要求1-6之一的方法，其中水解反应后通过调节得到的混合物的pH，然后分离形成的沉淀来回收β-内酰胺核。
8.根据权利要求1-7之-的方法，其中头孢氨苄是通过用D-苯基甘氨酰胺或者D-苯基甘氨酸的酯酰化7-氨基脱乙酰氧基头孢菌素酸制备的。
9.根据权利要求1-7之一的方法，其中阿莫西林是通过用D-对羟基苯基甘氨酰胺或D-对羟基苯基甘氨酸酰化6-氨基青霉素酸制备的。
10.根据权利要求1-7之一的方法，其中氨苄西林是通过用D-苯基甘氨酰胺或D-苯基甘氨酸的酯酰化6-氨基青霉素酸制备的。
11.根据权利要求1-7之一的方法，其中头孢克洛是通过用D-苯基甘氨酰胺或D-苯基甘氨酸的酯酰化7-氨基-3-氯头孢菌素酸制备的。
12.根据权利要求1-7之一的方法，其中头孢拉定是通过用D-二氢苯基甘氨酰胺或D-二氢苯基甘氨酸的酯酰化7-氨基脱乙酰氧基头孢菌素酸制备的。
13.根据权利要求1-7之一的方法，其中头孢羟氨苄是通过用D-对羟基苯基甘氨酰胺或D-对羟基苯基甘氨酸的酯酰化7-氨基脱乙酰氧基头孢菌素酸制备的。
14.游离的苯基乙酸含量小于100，特别是小于80，更优选小于70ppm的7-氨基脱乙酰氧基头孢菌素酸。
15.游离的苯基乙酸或苯氧基乙酸含量的小于20，特别是小于15ppm的6-氨基青霉素酸。
全文摘要
本发明涉及制备抗生素,特别是头孢氨苄,氨苄西林,阿莫西林,头孢克洛,头孢拉定,头孢羟氨苄,头孢噻肟等的方法,其中β－内酰胺核被酰化,抗生素从反应混合物中回收,剩余母液经过水解反应,反应中存在于母液中的抗生素分解为其起始化合物,特别是β－内酰胺核,并且酰化剂被水解。然后β－内酰胺核可以被大量回收或者再循环到酰化反应中。这是因为已经发现在酰化剂和抗生素的浓度相当高时β－内酰胺核的溶解性出人意料的高。
文档编号C07D501/12GK1207742SQ96199571
公开日1999年2月10日 申请日期1996年12月6日 优先权日1995年12月8日
发明者W·H·J·伯斯坦, W·J·J·范·登·特维尔, R·M·德克斯 申请人:吉斯特·布罗卡迪斯股份有限公司