专利名称：乳铁蛋白变体及其应用的制作方法
Ⅰ发明领域本发明总的涉及乳铁蛋白相关的糖蛋白。更具体地，本发明涉及乳铁蛋白变体及其部分、它们的生产以及应用。
Ⅱ发明背景乳铁蛋白是非血红素铁结合糖蛋白中运铁蛋白家族的成员(Aisen等，1980,Ann,Rev.Biochem.49:357-393)，运铁蛋白家族还包括运铁蛋白，血液中主要运输铁的蛋白质(MacGollivray等，1983,J.Biol.Chem.258:3543-3553)；卵运铁蛋白，禽蛋白色蛋白(Jeltesh等，1982,Eur.J.Biochem.122:291-295)；以及黑色素运铁蛋白，该家族的一种膜结合形式见于人体黑色素细胞(Rose等，1986,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:1261-1265)。乳铁蛋白有很广的分布，它不仅存在于充满机体表面的外部分泌物中(Masson等，1971,Comp.Biochem.Physiol.39:119-129；Hemmart等，1991,Am.J.Clin.Nutr.53:32-39；Masson等，1966,clin.chim.Acta.14:735-739；Pentecost等，1987,J.Biol.Chem.262:10134-10139；Yu等，1993,Biochem.J.296:107-111)，还存在于多形核嗜中性白细胞的二级颗粒中，该颗粒可在嗜中性白细胞激活时释放到血液中(Masson等，1969,J.Exp.Med.130:643-658)。乳铁蛋白的功能包括与铁结合并运输到小肠(Fransson等，1980,J.Pediatrics96:380-384；Iyer等，1993,Eur.J.Clin.Nutr.47:232-241；Cox等，1979,Biochem.Biophys.Acta.558:129-141；Hu等，1988,Biochem.J.249:435-441；Gislason等，1995,J.Pediatr.Gastroent,Nutr.21:37-43；Mikogami等，1994,Am.J.Physiol.267:G1-G8；Ward等，1995,Biotechnology13:498-503)；对各类革兰阴性和革兰阳性细菌有抗微生物活性(Oram等，1968 Biochem.Biophys.Acta.170:351-365；Aronld等，1977,Science197:263-265；Ellison等，1988,Infect.Immun.56:2774-2781；Bellamy等，1992,Biochem.biophys.Acta.1221:130-136；Yamauchi等，1993,Infect.Immun.61:719-728)；促进细胞生长(Hashizume等，1983,Infect.Immun.763:377-382；Nichols等，1987,Pediatr.Res.21:563-567)；调节成髓作用(Sawatzki等，1989,Blood Cells15:371-375；Broxmeyer等，1986,Blood Cells13:31-48；Zucali等，1979,Blood54:951-954)；以及免疫调节性能(Machnicki等，1993,Int.J.Exp.Path.74:433-439；Crouch等，1992,Blood80:235-240；Zagulski等，1989,Br.J.Exp.Pathol.70:697-704)。
乳铁蛋白与运铁蛋白家族其它成员有高度的结构同源性。所有这些蛋白质均是分子量约为80kDa的单体糖蛋白。Aisen等，1980,Ann.Rev.Biochem.49:357-393；Metz-Boutique等，1984,Eur.J.Biochem.145:659-676。用X射线晶体学分析已经精确地确定了乳铁蛋白(Anderson等，1989,J.Mol.biol.209:711-734)和运铁蛋白(Lindley等，1988,Biochem.27:5804-5812)的三维结构。蛋白质的氨基和羧基端各一半折叠成球状叶形。该双叶结构的氨基和羧基端各一半之间的保守性约为40％，认为这是由共同的始祖基因的基因内复制而进化成的。Williams等，1982,Trends biochem.Sci.7:394-397。两叶各自可与铁发生高亲和性的可逆结合，并伴随与一个阴离子(通常是碳酸根)结合。Asien等，1980,Ann.Rev.Biochem.49:357-393。乳铁蛋白与铁结合所需的氨基酸在运铁蛋白家族中是高度保守的。Baker等，1992,J.Inorg.Biochem.47:147-160。在乳铁蛋白中，铁原子与氨基端叶结构中的Asp396,Tyr93,Tyr193和His254以及羧基端叶结构中相应的Asp396,Tyr93,Tyr193和His254分别结合。Anderson等，1989,J.Mol.Biol.209:711-734。
尽管它们的结构相似，但是乳铁蛋白比其在血清中的对应物运铁蛋白表现出高得多的铁结合亲合性。特别是，乳铁蛋白的铁释放比运铁蛋白表现出更高的pH稳定性，后者在约6-4的pH范围内释放铁，而前者在约4-2的pH范围内释放出铁。Mazuier等，1989,Biochem.Biophys.Acta.629:399-408。曾经提出，乳铁蛋白特有的铁结合性能赋予了该蛋白质一些不同的功能活性。对参与乳铁蛋白特有铁结合性能的结构和功能特性的描述，使我们得以模仿并生成性能改进的乳铁蛋白变体，这些变体包括，但不局限于，对铁有较高的亲和性、抗微生物活性改进的乳铁蛋白变体；对铁亲和性较低、铁释放性能改进的乳铁蛋白变体、或对铁释放的pH依赖性有所修饰的乳铁蛋白变体。
本发明申请者曾报道过在丝状真菌(包括曲霉属(Aspergillus))中高水平生产重组人乳铁蛋白及其特点。Ward等，1995,Biotechnology 13:498-503；美国专利No.5,571,896,5,571,619和5,571,697，其内容均纳入本文作参考。尽管它有特殊而独特的糖组成，但是该重组蛋白质显示与人乳中乳铁蛋白在生理活性(包括与铁和受体的结合以及抗微生物活性)方面没有区别。因此，现在该表达系统可用来生产足够量的乳铁蛋白变体，以说明该蛋白质的结构/功能，从而生成性能改进的变体。
Ⅲ发明概述本发明涉及编码乳铁蛋白变体或其部分的核酸序列，其中该部分包括乳铁蛋白至少一个铁结合位点的对应序列。与野生型乳铁蛋白相比乳铁蛋白变体或其部分的还有比改进的铁结合性能进一步得到明确。
通过定点诱变，本发明解释了两叶结构对乳铁蛋白特有的铁结合性能的作用。使人乳铁蛋白cDNA在该蛋白质一叶或两叶中参与铁结合的两个酪氨酸残基选择性突变，将获得的三个铁结合缺陷型变体在泡盛曲霉(Aspergillus awamori)中表达，并纯化。采用39FeCl3作铁结合分析表明，两叶中任一叶参与铁结合的两个酪氨酸残基的突变将使突变叶选择性地失去铁结合性。另外，pH依赖型铁释放研究证明，乳铁蛋白两叶的铁结合稳定性不同，氨基端叶比羧基端叶更具酸不稳定性。更重要的是，本发明表明，功能性铁结合羧基端叶是氨基端叶与铁结合pH稳定性所必需的，这是野生型乳铁蛋白的特性。这些结果支持这样一个结论乳铁蛋白两叶之间的相互协同作用产生了该蛋白质特有的铁结合性能。
因此，本发明提供指南来生产性能改进(如变化的铁结合性质，如增强或减弱对铁的亲和性，改变铁结合的pH或温度需求或范围)的乳铁蛋白变体。而且，本发明还提供指南来设计具有其它改进性质(如在保持铁结合活性的同时有治疗耐受性能)的乳铁蛋白变体。
第二方面，本发明还涉及包括编码乳铁蛋白变体或其部分的核酸的载体，该载体适于在真核细胞中表达乳铁蛋白变体或其部分。较佳的，质粒适于在真菌细胞中表达，这些真菌细胞包括米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(aspergillusniger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)以及泡盛曲霉(Aspergillus awamori)。
本发明的第三方面还涉及制备这些载体和包含这些载体的转染细胞的方法。另外也提供在各种真核细胞或原核细胞中生产乳铁蛋白及其变体的方法。最后，本发明涉及用本发明方法制得的乳铁蛋白及其变体。因此，本发明提供了一种经济有效地生产重组乳铁蛋白及其变体以及乳铁蛋白相关多肽的方法。
Ⅳ附图简述
图1A和1B显示了经纯化的铁结合缺陷型乳铁蛋白变体的Western免疫印迹分析和银染分析结果。
图1A表示对纯化的重组人乳铁蛋白(Rec hLF)、氨基端没有铁结合性(MN-2Y)、羧基端没有铁结合性(MC-2Y)、氨基和羧基端均没有铁结合性(MNC-4Y)的乳铁蛋白变体样品各200ng的Western免疫印迹分析。
图1B是对纯化的Rec hLF、MN-2Y、MC-2Y和MNC-4Y(各1gμ)的银染SDS聚丙烯酰胺凝胶分析的结果。
图2A、2B、2C和2D表示铁结合缺陷型乳铁蛋白变体与生物素化的重组乳铁蛋白变体竞争结合人肠细胞。
图2A。在浓度渐增的未标记铁饱和重组乳铁蛋白(Fe-Rec hLF)或脱辅基(即不含铁)重组乳铁蛋白(Apo-Rec hLF)存在或不存在下，使铁饱和的生物素化重组人乳铁蛋白(0.4μm)与Caco-2膜(300ng)一起培育。用生物素/亲和素微量滴定测定法(Ward等，1995,Biotechnology13:498-503)测定生物素化乳铁蛋白与Caco-2膜结合受抑制的情况。
图2B、2C和2D。在浓度渐增的未标记Apo-Rec hLF或MN-2Y(图2B)、MC-2Y(图2C)或MNC-4T(图2D)的存在或不存在下，使脱辅基生物素化的重组人乳铁蛋白(0.4μm)与Caco-2膜(300ng)一起培育。用生物素/亲和素微量滴定测定法测定生物素化乳铁蛋白与Caco-2膜结合受抑制的情况。数据用均值±平均标准差来表示。
图3表示乳铁蛋白氨基端(MN-2Y)、羧基端(MC-2Y)、氨基羧基端(MNC-4Y)铁结合缺陷型变体的铁饱和分析结果。如实验步骤中所述的，用铁使不含铁的重组人乳铁蛋白(Rec hLF)、MN-2Y、MC-2Y和MNC-4Y饱和。用液体闪烁计数法测定与样品结合的59Fe量，确定Fe/蛋白质的摩尔比。数据用均值±标准差表示。
图4表示乳铁蛋白氨基端(MN-2Y)和羧基端(MC-2Y)铁结合缺陷型变体的pH依赖型59Fe释放结果。对59Fe饱和的重组人乳铁蛋白(Rec hLF)、MN-2Y和MC-2Y用pH范围为7-2的缓冲液透析。用液体闪烁计数法测定与样品结合的59Fe量，确定Fe/蛋白质的摩尔比。数据用均值±标准差表示。
Ⅴ定义本文所用的术语大都与本领域中通常采用的一致。本文中所用的下列术语有下列通用含义术语“乳铁蛋白变体”指天然存在的乳铁蛋白在至少一个氨基酸位置上发生突变而生成的多肽。
术语“载体”指质粒、粘粒、噬菌体、病毒、逆转录病毒或其它用来插入、增殖和/或表达编码乳铁蛋白变体或其部分的核酸的载体。
术语“宿主细胞”指可以使乳铁蛋白表达的任何细胞。
术语“启动子”指控制乳铁蛋白cDNA转录的调控DNA序列。
术语“转化”指插入细胞使得细胞能表达异源核酸序列。
术语“铁结合性能”指与Fe结合的能力。功能齐全的人乳铁蛋白每分子乳铁蛋白可结合两分子铁原子。
术语“生物活性/有生物活性”指乳铁蛋白的生物活性，根据它与铁结合的能力、杀死微生物、或阻抑微生物生长的能力，或铁转运蛋白功能来衡量。
Ⅵ发明详述A综述本发明的基础部分在于确定了乳铁蛋白多肽中对蛋白铁结合性能有作用的那些结构功能域、序列和结构。因此，本发明提供指南来生产性能有所改进的乳铁蛋白变体，这些改进的性能例如有变化的铁结合性质(如增强或减弱的铁结合能力)、或改变铁结合的pH或温度需求或范围。而且，本发明还提供指南来设计有其它改进性质(如在保持铁结合活性的同时有治疗耐受性、抗降解稳定性或免疫反应性)的乳铁蛋白变体。
因此，本发明涉及编码乳铁蛋白变体及其部分的重组核酸，以及包含所述重组核酸的载体。本发明还涉及制备该载体以及包含该载体的转染细胞的方法。另外也提供了在各种真核细胞或原核细胞中生产乳铁蛋白变体及其部分的方法。最后，本发明涉及本发明的核酸编码的和/或用本发明的方法生产的乳铁蛋白变体及其部分。因此本发明提供了指南来设计性能改进的乳铁蛋白变体或其部分，并提供了一种经济而有效的生产这些乳铁蛋白变体及其部分的方法。
B乳铁蛋白的双叶结构对其特有的铁结合性能的作用在本发明中，用定点诱变方法来研究乳铁蛋白的双叶结构对该蛋白特有的铁结合性能的作用。
更具体地是，为生成三种铁结合缺陷型变体，使乳铁蛋白一叶或两叶结构中参与铁结合的两个酪氨酸突变成相应的丙氨酸残基。如以前关于野生型蛋白的描述，使这些乳铁蛋白变体在泡盛曲霉中表达并纯化。美国专利No.5,571,896；Ward等，1995,Biotechnology13:498-503。用银染法、Western免疫印迹法和肠受体结合测定法对这些乳铁蛋白变体的大小、免疫反应性和功能活性进行测定，结果与野生型重组人乳铁蛋白相似，这表明氨基酸的取代对蛋白质没有不利影响。用59FeCl3的铁饱和分析表明，当羧基端铁结合叶结构完整的乳铁蛋白变体以预计的1∶1(铁∶蛋白质)比值饱和时，但是氨基端铁结合功能完整的变体的饱和比值始终低于1∶1，这表明该乳铁蛋白变体在pH7.0下的铁结合稳定性有所降低。另外，铁结合的研究证明，两叶中酪氨酸残基的突变均有效地破坏了整个蛋白质的铁结合性能。参见Ⅶ.A.,Ⅶ.C.和Ⅶ.D.。
如本文所公开的，对非突变的叶的pH依赖性铁释放研究表明，乳铁蛋白的氨基端和羧基端叶结构的铁结合稳定性是不同的。羧基端铁结合功能完整的乳铁蛋白变体的铁的释放与天然乳铁蛋白中所见相似。相反，氨基端铁结合位点完整的乳铁蛋白变体酸不稳定性高得多，在pH7-5内会释放出所有的结合铁。因此，尽管这两叶之间有总体结构同源性(40％)，但已证明，乳铁蛋白的氨基端和羧基端叶在其铁结合的pH稳定性方面是不同的。另外，已经证明，需要有功能性铁结合羧基端叶才能使氨基端叶具有铁结合稳定性，这是野生型蛋白质所特有的。
乳铁蛋白氨基端和羧基端叶的铁结合不等价性以前已有描述。Mazuier等，1989,Biochem.Biophys.Acta.629:399-408；Day等，1992,J.Biol.Chem.167:13857-13862；Shimazaki等，1993,J.Dairy Sci.76:946-955。用克隆的人乳铁蛋白氨基端片段(Day等，1992,J.Biol.chem.167:13857-13862)和对牛乳铁蛋白用蛋白酶解获得的羧基端片段(Shimazaki等，1993,J.Dairy Sci.76:946-955)的研究表明，如同本发明所报道的，在铁结合pH依赖性方面呈现相似的差异。然而，由于以前的报道没有指出羧基端或其部分是氨基端叶结构铁结合功能稳定化所必需的，因此这些研究是有局限性的，它们仍有待来确定羧基端叶的结构存在或功能性羧基端铁结合活性是否是氨基端叶结构铁结合性能稳定化所必需的。本发明延伸了这些研究，并且证明两叶间的相互协同作用(主要是由功能性羧基端叶结构引起)是铁结合稳定化所必需的。
在运铁蛋白家族的进化中双叶结构的选择偏性是未知的。本公开为乳铁蛋白的这种选择提供了功能上的合理解释。因此，本发明表明两叶结构的进化赋予了乳铁蛋白特有的铁结合性能，该性能成为该蛋白特有的功能活性。有趣的是，运铁蛋白与乳铁蛋白不同，因为已经证明，运铁蛋白的pH依赖型铁释放性能和蛋白酶解衍生获得的氨基端片段的性能相似。Mazuier等，1989,Biochem.Biophys.Acta.629:399-408；Lineback-Zins等，1980,J.Biol.Chem.255:708-713。这些发现可以说明，运铁蛋白两叶之间缺少协同性可能是导致该蛋白质铁结合稳定性较弱的一个关键因素。将上述研究结合起来，认为乳铁蛋白和运铁蛋白铁结合性能的差别可能是由于(或至少部分由于)乳铁蛋白的羧基端铁结合叶的进化增强了酸稳定性，并且与氨基端叶的协同赋予了氨基端叶pH稳定性，这是双叶结构蛋白质的特性。
C乳铁蛋白变体根据对乳铁蛋白多肽中对该蛋白铁结合性能有作用的那些结构域、序列和结构的鉴定，本发明提供指南来设计并生产新的铁结合能力改进的乳铁蛋白变体或其部分。本发明的性能改进的乳铁蛋白变体通常包括，但不局限于，对铁的亲和力较高、抗微生物活性改进的乳铁蛋白变体；对铁亲和力较低、铁释放性能改进的乳铁蛋白变体；或铁结合和/或释放时对pH或温度需求或范围有所改变的乳铁蛋白变体。另外，本发明还可以设计有其它改进性能(如在保持铁结合能力的同时有治疗耐受性、生物半衰期长或免疫反应性)的乳铁蛋白变体。
本发明的乳铁蛋白变体可从各类哺乳动物的野生型乳铁蛋白衍生获得，这些野生型乳铁蛋白包括，但不局限于，人、小鼠、大鼠、牛和猪的乳铁蛋白。野生型乳铁蛋白可用本领域通常已知的各种方法来进行突变。参见其它文献，Sambrook等，1990,Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold Spring HarbourLaboratory Press,New York；Kunkel等，1987,Meth.Enzymol.154:367-382；Kunkel,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-492。
在一个较佳的实例中，乳铁蛋白变体包含至少一个突变，该突变对至少一个铁结合位点有影响。与野生型乳铁蛋白相比，该铁结合位点的铁结合性能可能有变化。例如，对铁的亲和力可以增加或减少。另外，对铁的亲和性会表现出pH范围特性的改变。或者，铁结合位点的改变可使得乳铁蛋白变体或其部分完全不与铁结合。
在另一个实例中，乳铁蛋白变体包括至少一个突变，该突变影响乳铁蛋白的治疗耐受性、生物稳定性或免疫耐受性，而仍保留其生物活性。
D乳铁蛋白变体的表达和产生编码乳铁蛋白变体的本发明的核酸序列可插入一个适合在真核细胞中表达的载体，从而使得乳铁蛋白变体表达。或者，编码本发明乳铁蛋白变体一部分的核酸序列可插入载体，使它们在真核细胞中表达。较佳的，乳铁蛋白变体的此部分应至少包含一个经过修饰的铁结合位点。
在较佳的实例中，乳铁蛋白是在重组表达系统中制得的。参见其它文献，Ward等，1992,Biotechnology 10:784-789；Ward等，1995,Biotechnology 13:498-503。出于此目的，可将编码所需乳铁蛋白形式的核酸(参见例如美国专利5,571,691，其内容全部结合入本文作参考)表达型掺入细胞宿主中，然后在适于该特定肽或蛋白质表达的条件下进行培育。用各种基因表达系统实现该目的，通常是靠所选宿主细胞天然自用的表达控制来表达所需的基因。
由于本发明的乳铁蛋白变体与天然存在的乳铁蛋白一样，需要进行翻译后的修饰(如在几个氨基酸残基上糖基化)，因此大多数乳铁蛋白变体或其部分需要在真核宿主中生产。在较佳的实例中，乳铁蛋白产物由曲霉属表达体系生产，如Ward等，1992,Gene,122:219-223；美国专利No.5,571,896和5,571,697中所述，这些文献的内容均结合入本文作参考。
如果要生成非糖基化形式的乳铁蛋白变体或其部分，那么它们的生产可方便地在细菌宿主(如大肠杆菌)中实现。对于这种生产，编码所选乳铁蛋白变体或其部分的核酸可放在表达控制系统(如大肠杆菌的lac、trp或PL基因)后。
另一种表达编码乳铁蛋白变体或其部分核酸的方法是，使宿主以融合蛋白形式表达乳铁蛋白产物，该融合蛋白中乳铁蛋白产物以可释放形式与便于表达产物分离和稳定的载体蛋白连接。
还有一种方法是，可用有机合成方法来生成乳铁蛋白变体或其部分。特别当打算生产乳铁蛋白变体的部分(如约20-50个氨基酸长度的肽)时，宜采用已经建立的自动化肽合成技术，这些技术在下列文献中有所描述例如J.M.Stewart和J.D.Young,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd Edition,1984,Pierce chemicalCompany,Rochford,Illinois；M.Bodanszky和A.Bodanszky,The Practice of PeptideSynthesis,1984,Springer-Verlag,New York；Applied Biosystems 430A UsersManual,1987,ABI Inc.,Foster City,California；Solid Phase Peptide Synthesis-APractical Approach,by:E.Atherton&R.C.Sheppard,IRL Press,Oxford(1989)。在这些技术中，乳铁蛋白变体蛋白质从其C端开始生长，然后采用Fmoc或tBoc方案依次加入适当的保护氨基酸来形成与树脂交联的残基。
E应用本发明的乳铁蛋白变体可用于各类应用。
例如，铁结合能力改进的乳铁蛋白变体或其部分可用于抗微生物应用，包括治疗感染、作为人或动物食品中的添加剂、滴眼药、滴耳药、接触眼晶状体和其它眼科保健液、表皮护理产品、漱口剂、口香糖和牙膏中的添加剂。
pH或温度需求改变的乳铁蛋白变体或其部分也可用于上述应用。它们还可用作增强或改变铁输送传递的治疗添加剂。
乳铁蛋白变体和其部分的其它应用包括治疗炎性皮肤疾病，如待审查临时申请(代理案卷号8206-041-88,1997年4月1日提交)中所述的，其内容全部结合入本文作参考。
对于上述许多应用只应理解为本发明作的列举，具有改进的治疗耐受性、改变的生物稳定性或免疫耐受性的乳铁蛋白变体和其部分是特别佳的例子。
F药物配方和给药途径对于治疗用途，所选的乳铁蛋白变体或其部分可作为单独的治疗剂，或治疗剂组合，以常规方法联同其它药物给药。它可以单独给药，但是通常是与药物载体一同给药，该载体根据所选的给药途径和标准药物服用方法来选择。本发明的药物组合物可以口服、非肠胃给药、表皮给药或直肠给药，或是作为吸入剂，并且可以单位剂量形式和药学领域技术人员熟知的方式来进行给药。非肠胃给药包括，但不局限于，皮下注射、静脉注射、腹腔内注射或肌内注射。
可在待治疗疾病(如感染或皮肤病(牛皮癣、接触性皮炎等))明确后任何时刻用活性组分进行治疗。可以诊断UV引起的炎症、婴儿尿布皮疹、哮喘、关节炎等。治疗最好是预防性的或是在疾病早期进行，首先防止大范围感染或发炎。治疗通常将持续到疾病痊愈。慢性疾病如牛皮癣、哮喘或关节炎，或持续暴露在过敏原下时，可能需要在症状痊愈后继续治疗一段时间。
当然，给药的剂量将根据已知的因素而不同，这些因素例如是(1)具体乳铁蛋白产品的药物动力学特征及其给药方式和途径；(2)接受者的年龄、健康状况、身高和体重；(3)症状的性质和程度；(4)同时采用的治疗的类型；(5)治疗的频率和(6)所希望的效果。该领域技术人员可根据上述因素来决定活性组分的日常剂量。
活性组分可表面给药，用作吸入剂，或注射入发炎的关节或软骨中。然而，乳铁蛋白变体还可以固体或半固体药剂形式(如硬的或软的明胶胶囊、片剂或粉剂)或液体药剂形式(如酏剂、糖浆或悬浮剂)口服。它也可以无菌液体药剂形式进行非肠胃给药。其它药剂形式如补片、软膏或透皮给药也是可行的。
本发明的乳铁蛋白变体也可配制成缓释放的植入材料来延长和维持乳铁蛋白产品的给药。这些缓释配方包括生物相容性聚合物组分，如聚(乳酸)、聚(乳酸-共-乙醇酸)、甲基纤维素、透明质酸、胶原等。在几篇出版物(包括A.Domb等，Polymers for Advanced Technologies 3:279-292,1992)中评述了在药物运载体中可降解聚合物的结构、选择及其应用。在M.Chasin和R.Langer(eds.)＂Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems,＂Vol.45 of＂Drugs and thePharmaceutical Science,＂M.Dekker,New York.1990的文章中可发现在药物配方中选择和使用聚合物的其它指南。也可用脂质体来提供乳铁蛋白变体或其部分的缓释。关于怎样使用和制备感兴趣的脂质体药物配方的详细情况在其它文献中有所描述，它们包括美国专利No.4,944,948；5,008,050；4,921,706；4,927,637；4,452,747；4,016,100；4,311,712；4,370,349；4,372,949；4,529,561；5,009,956；4,752,442；4,737,323；4,920,016。当需要提供局部(如在关节炎的关节处，或在局部皮肤发炎处等)高浓度乳铁蛋白变体时，缓释配方是特别佳的。
明胶胶囊或液体填充的软明胶胶囊可以含有活性组分和粉末载体或液体载体(如乳糖、卵磷脂淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸煤、硬脂酸等)。可用类似的稀释剂来制成压成型片剂。片剂和胶囊均可制成缓释产品，以在几个小时内持续释放药剂。压缩片剂可用糖衣包裹或用薄膜包裹以遮盖令人讨厌的味道并使片剂与空气隔开，或包有肠溶衣使其选择性地在肠胃道中消化。口服给药的液体药剂形式可含有着色剂和/或调味剂，以使患者能够接受。
合适的药物载体还在Remington′s Pharmaceutical Scienes,17th ed.,MackPublishing Company,Easton,PA(1990)中有所描述，该文是该领域内标准的参考文献，其内容全部结合入本文作参考。
下述实施例将更详细地描述本发明。下列制备方法和实施例的给出是为了使本领域技术人员更清楚地了解并实施本发明。然而，应当理解，列举的实例只是用来描述本发明的一个方面，本发明不局限于列举实例的范围，而功能上等价的方法均包括在本发明范围内。实际上，除了本文所述的那些以外，本发明的各类变化对于本领域技术人员来说显然可以从前述描述及附图明显得出。这些变化均认为是落在本文所附权利要求的范围内。
Ⅶ实施例A材料和方法通用泡盛曲霉表达载体pPLF-26的构建。用于在泡盛曲霉中生产乳铁蛋白的表达载体pPLF-19的构建已有描述。Ward等，1995,Biotechnology 13:498-503；美国专利No.5,571,896。为了构建含有编码乳铁蛋白变体的克隆化cDNA上特有位点的表达载体，先制成pPLF-26。简要地说，用SphⅠ消化pPLF-18(Ward等，1995,Biotechnology 13:498-503)，生成3.3kb和4.4kb两个片段。将含有乳铁蛋白cDNA的3.3kb SphⅠ片段亚克隆入SphⅠ消化的pALTER(Promega,Madison,WI)中，生成pLF18sp.Alt。将4.4kb SphⅠ片段重新连接生成PR18.2。用商业上购得的pALTER试剂盒(Promega,Madison,WI)进行体外诱变，在pLF18Sp.Alt的成熟乳铁蛋白cDNA起始处引入NotⅠ限制性酶位点，生成pNot.9。用于诱变的5′磷酸化寡核苷酸如下5′AGCGC GGCCG CAGGA GAAGGA 3′[SEQ ID NO:1]。用EcoRⅠ消化PR18.2，得到的两个片段用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段修复，并以正确方向再联接。获得的pΔE12用SphⅠ消化，并与pNot.9的3.3kb SphⅠ片段连接，生成pPLF-25。用EcoRⅠ消化PL03(在β-微管蛋白启动子控制下可编码腐草霉素抗性基因)(Gatignol等，1987,Mol.Gen.Gener.207:342-348)，用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段修复获得的片段，并以正确定向再连接。用HindⅢ消化获得的载体PLO3ΔR1，将得到的2.3kb片段亚克隆入HindⅢ消化的pPLF-25中与乳铁蛋白cDNA相同的定向，生成pPLF-26。
铁结合缺陷型乳铁蛋白变体MN-2Y、MC-2Y和MNC-4Y的构建。合成有5′EcoRⅠ/BamHⅠ末端的5′磷酸化寡核苷酸，以便将NotⅠ位点引入pALTER中。寡核苷酸的序列如下。顶链5′GATCCA TGCGG CCGCATG 3′[SEQ ID NO:2]。底链5′AATTCA TGCGG CCGCATG 3′[SEQ ID NO:3]。使该寡核苷酸退火连接到EocRⅠ/BamHⅠ消化的pALTER上，生成pALTLink。用NotⅠ/EcorⅠ消化pPLF-26，将获得的含人乳铁蛋白cDNA的2.1kb片段亚克隆入NotⅠ/EocRⅠ消化的pALTLINK中。将获得的质粒pALThLF用于后续诱变实验。用pALTER试剂盒进行体外诱变，将乳铁蛋白氨基端叶(Tyr93、Tyr193)、羧基端叶(Tyr436、Tyr529)、以及氨基端和羧基端叶结构中参与铁结合的酪氨酸残基(Tyr93、Tyr193、Tyr436和Tyr529)变成相应的丙氨酸残基。用于诱变的5′磷酸化寡核苷酸如下Tyr93-Ala93:5′CACAG CCACG GCATA AGCGT GAGTT CGTG GCTG 3′[SEQ ID NO:4]Tyr193-Ala193:5′CTTGAA GGCACC AGAGG CGCTG AAGTA CGGTTC 3′[SEQ ID NO:5]Tyr436-Ala436:5′CACCGCC ACAGCA AGGGC TCCTT CCACA GGTCT 3′[SEQ ID NO:6]Tyr529-Ala529:5′CCGGAAA GCCCCA GTGGC GCCGT AGTAT CTCTC 3′[SEQ ID NO:7]用NotⅠ/EcoRⅠ消化获得的质粒pALTMN-2Y、pALTMC-2Y和pALTMNC-4Y，并亚克隆入NotⅠ/EcoRⅠ消化的pPLF-26中，生成适于在曲霉属真菌细胞中表达的质粒即分别为p26MN-2Y、p26MC-2Y和p26MNC-4Y。用市售的Sequenase Version2.0试剂盒(United States Biochemical Corporation,Cleveland OH)对所有的寡核苷酸序列和构建物接头进行测序。
MN-2Y、MC-2Y和MNC-4Y的表达和纯化。将泡盛曲霉表达载体p26MN-2Y、p26MC-2Y和p26MNC-4Y转化入泡盛曲霉中，使获得的转化体如已有文献所述培育7天。Ward等，1995,Biotechnology 13:498-503。用ELISA测定法筛选培养基中的铁结合变体。Vilja等，1985,J.Immunol.Meth.76:73-83。阳性培养物(＞50mg/l)在2升摇瓶中培育7天，用CM-sephadex离子交换层析纯化乳铁蛋白变体。Ward等，1995,Biotechnology 13:498-503。用0.1M柠檬酸对此蛋白质进行透析，然后再以H2O和5mM,pH7.5的磷酸钠(3g)进行大量透析。
受体结合测定法。用生物素/亲和素微量滴定平板测定法(Rejman等，1994,Int.J.Biochem.26:201-206)进行受体结合测定法，方法基本如文献中所述的，采用8天龄Caco-2增溶膜(300ng)。Ward等，1995,Biotechnology 13:498-503。
乳铁蛋白变体的铁饱和性和铁结合的pH稳定性。使MN-2Y、MC-2Y和MNC-4Y(5mg)与4倍过量的FeCl3∶59FeCl3∶NTA(400∶1∶8)共育。Ward等，1995,Biotechnology 13:498-503。样品室温培育30分钟。使样品通过NAP-10柱(Pharmaica,Piscataway,NJ)进行纯化，然后用0.05M Tris/HCl、0.2M NaCl、pH7.0透析12小时，除去与乳铁蛋白变体非特异性结合的铁。用液体闪烁计数法对透析后与乳铁蛋白变体结合的铁进行定量分析。每个乳铁蛋白变体的铁结合pH稳定性的测定如前所述。Ward等，1995,Biotechnology 13:498-503。
B实施例1乳铁蛋白氨基和羧基端结构域中铁结合缺陷型变体的表达和纯化为了测定两个结构域的结构对乳铁蛋白特有的铁结合性能的作用，采用定点诱变方法在人乳铁蛋白cDNA中产生突变，使cDNA编码的蛋白质的一叶或两叶缺失铁结合能力。
具体说，使Tyr93、Tyr193突变成Ala93、Ala193，从而生成乳铁蛋白氨基端一半不能结合铁的一个变体(MN-2Y)。乳铁蛋白羧基端一半相应的酪氨酸残基Tyr436、Tyr529变成丙氨酸残基，致使羧基端结构域失去铁结合功能(MC-2Y)。乳铁蛋白中所有参与铁结合的四个酪氨酸残基(即Tyr93、Tyr193、Tyr436和Tyr529)都突变成相应的丙氨酸残基，生成乳铁蛋白的两叶均不能结合铁的一个变体(MNC-4Y)。
如重组人乳铁蛋白中所述，在泡盛曲霉中表达这些乳铁蛋白并纯化。Ward等，1995,Biotechnology 13:498-503，美国专利No.5,571,896。对纯化蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后作weastern免疫印迹分析或银染分析。参见图1。采用抗人乳铁蛋白的特异性多克隆IgG的western免疫印迹分析检测到，三种乳铁蛋白变体各自在对应于野生型重组乳铁蛋白分子大小处有免疫反应条带，如图1A中泳道1-4所示。对两份凝胶进行银染分析，结果表明这些乳铁蛋白变体纯度在95％以上，每种蛋白质在预计分子量80kDa处见有单一条带。参见图1B泳道1-4。因此，乳铁蛋白变体的大小和免疫反应性与野生型重组乳铁蛋白没有区别。
C实施例2铁结合缺陷型乳铁蛋白变体有着与野生型重组人乳铁蛋白相似的肠受体结合性能根据丙氨酸和酪氨酸的相似性，可以推定，铁结合乳铁蛋白变体中从酪氨酸到丙氨酸的单氨基酸取代只会引起很小的蛋白质结构变化。因此，铁结合缺陷型变体除铁结合性能外的活性，应当与野生型重组人乳铁蛋白的活性相似。申请人以及其它研究者以前就已经指出，在人肠细胞中有特异性和可饱和的铁饱和乳铁蛋白受体存在。Iyer等，1993,Eur.J.Clin.Nutr.47:232-241；Cox等，1979,Biochem.Biophys.Acta.558:129-141；Hu等，1988,Biochem.J.249:435-441；Gislason等，1995,J.Pediatr.Gastroent,Nutr.21:37-43；Mikogmi等，1994,Am.J.Physiol.267:G1-G8；Ward等，1995,Biotechnology 13:498-503。因此，用竞争性受体结合测定乳铁蛋白变体的先决条件是必须先建立不含铁的重组乳铁蛋白对铁饱和重组乳铁蛋白的相对受体结合动力学实验方法。
竞争性受体结合测定法如已有文献所述进行。Ward等，1995,Biotechnology13:498-503。在0-20倍摩尔过量的未标记的脱辅基或铁饱和重组人乳铁蛋白存在下，使生物素化铁饱和重组人乳铁蛋白(0.4μM)与人肠Caco-2细胞膜一起培育，并进行生物素/亲和素微量滴定试验。Ward等，1995,Biotechnology 13:498-503。该测定结果见图2A。令人惊奇的是，脱辅基的和铁饱和的乳铁蛋白均表现出相同的代替生物素化铁饱和乳铁蛋白与人肠Caco-2细胞膜结合的能力，这表明两种形式的乳铁蛋白与乳铁蛋白肠受体的亲和性是相似的。曾经提出过乳铁蛋白通过这些受体将铁输送给肠细胞，但是不含铁和铁饱和的乳铁蛋白这种相似的对相应受体结合的亲和性提示，乳铁蛋白通过这些受体输送铁的能力主要取决于肠腔内铁饱和的与不含铁的乳铁蛋白的相对量。
在确定了脱辅基乳铁蛋白对其肠受体的亲和性之后，如上所述进行乳铁蛋白变体的竞争性受体结合测定法，与野生型乳铁蛋白比较它们的功能活性。该分析结果见图2B、2C和2D。所有三个铁结合缺陷型变体在特异性抑制无铁生物素化乳铁蛋白与Coao-2膜结合能力上，与野生型蛋白相比没有明显区别(＜2倍差)。这些结果表明，酪氨酸残基的突变不破坏该蛋白的铁非依赖型受体结合功能活性。
D实施例3乳铁蛋白氨基和羧基端叶结构中参与铁结合的酪氨酸残基突变将选择性地破坏蛋白突变叶的铁结合性能为了确认乳铁蛋白一或两叶中的两个酪氨酸残基突变足以破坏突变叶结构的铁结合能力，用59FeCl3进行铁饱和分析。
分析结果如图3所示。在4倍过量的铁存在下，野生型重组乳铁蛋白如预计的那样在铁/蛋白质摩尔比为2∶0时饱和。当羧基端铁结合功能完整的MN-2Y在摩尔比1∶1处饱和时，氨基端完整的MN-2Y在摩尔比低于1∶1处饱和，这表明在pH7.0时，该乳铁蛋白变体可能损失一些铁。因此，乳铁蛋白氨基端或羧基端各半中参与铁结合的酪氨酸残基的破坏只选择性地破坏突变叶的铁结合能力。另外，该分析的结果表明，乳铁蛋白中参与铁结合的所有四个酪氨酸残基的突变会有效地消除该蛋白质的铁结合能力。
E实施例4乳铁蛋白的氨基端和羧基端叶结构之间的协同性对该蛋白质特有的铁结合稳定性有作用经分子大小、免疫反应性和受体结合分析测定，确定铁结合缺陷型乳铁蛋白变体与野生型重组乳铁蛋白相似后，分析这些乳铁蛋白变体的pH依赖型铁释放情况，以确定两叶结构对乳铁蛋白的铁结合稳定性的作用。
用59FeCl3使乳铁蛋白变体饱和，并用pH7-2的缓冲液、4℃对其透析48小时。用液体闪烁计数法测定仍与乳铁蛋白变体结合的铁的量。该分析结果见图4。含有完整羧基端铁结合叶的MN-2Y的铁释放曲线与重组乳铁蛋白的铁释放曲线相似(铁释放在pH5.0时开始，在pH2.0时结束)。相反，含有完整氨基端铁结合叶的MC-2Y的pH依赖性铁释放是明显不同的。该变体的铁释放在pH7.0时开始，这与MC-2Y低于1∶1铁饱和度一致(图4)。另外，MC-2Y的铁释放在pH5.0时结束。这些结果表明，乳铁蛋白的氨基端叶和羧基端叶结构在铁结合pH稳定性上不同的，而野生型蛋白质的特点是需要有功能性铁结合羧基端来赋予氨基端结构域增强的pH稳定性。根据这些结论，可以得出结论，即乳铁蛋白的两个半部之间的相互协同作用(主要由羧基端叶驱动)形成了该蛋白质特有的铁结合pH稳定性。
本说明书中引用的所有的文献均结合入本文作为参考。
权利要求
1．一个编码乳铁蛋白变体或其部分的核酸序列，其中所述部分包括乳铁蛋白至少一个铁结合位点的对应序列，且其中乳铁蛋白变体或其部分有改进的铁结合性能。
2．一个编码选自MN-2Y、MC-2Y和MNC-4Y的乳铁蛋白变体的核酸序列。
3．一个重组载体，该载体包括(a)一个启动子；(b)权利要求1所述的编码乳铁蛋白变体或其部分的DNA；和(c)转录和翻译起始和终止序列；其中所述载体可生产乳铁蛋白变体并以加工蛋白形式表达乳铁蛋白变体。
4．一种适合在真核细胞中表达乳铁蛋白变体或其部分的载体，其中所述载体包括权利要求1所述的编码乳铁蛋白变体或其部分的DNA，以及所述DNA在所述细胞中表达所必需的调控元件。
5．一个载体，该载体包括(a)权利要求1所述的编码乳铁蛋白变体或其部分的核酸；和(b)一个启动子，以及转录和翻译的起始和终止序列；其中所述载体用来在真核细胞中表达人乳铁蛋白。
6．一个选自p26MN-2Y、p26MC-2Y和p26MNC-4Y的载体。
7．一种包含权利要求5所述的载体的转化的真核细胞。
8．根据权利要求7所述的真核细胞，其中所述细胞选自真菌、哺乳动物和昆虫细胞。
9．根据权利要求8所述的真核细胞，其中所述真核细胞是选自米曲霉、黑曲霉、构巢曲霉和泡盛曲霉的真菌细胞。
10．一种包含权利要求6所述的载体的转化的真核细胞。
11．根据权利要求10所述的真核细胞，其中所述细胞选自真菌、哺乳动物和昆虫细胞。
12．根据权利要求11所述的真核细胞，其中所述真核细胞是选自米曲霉、黑曲霉、构巢曲霉和泡盛曲霉的真菌细胞。
13．一种制备权利要求1所述的乳铁蛋白变体或其部分的方法，该方法包括下列步骤(a)用含有ⅰ)权利要求1所述的核酸；和ⅱ)一个启动子，以及转录和翻译起始和终止序列的载体转化真核细胞，其中所述载体适合在真核细胞中表达乳铁蛋白变体或其部分；和(b)在合适的营养培养基中培育所述转化的真核细胞，直至生成乳铁蛋白变体蛋白分泌入营养培养基中，然后将其从培养基中分离出来。
14．权利要求1所述的核酸编码的乳铁蛋白变体或其部分。
15．一种选自MN-2Y、MC-2Y和MNC-4Y的乳铁蛋白变体。
全文摘要
本发明涉及编码铁结合能力改进的乳铁蛋白变体或其部分的重组核酸以及包含所述重组核酸的载体。本发明还涉及生产这些载体以及含有这些载体的转化细胞的方法。也提供在各种真核或原核细胞中生产乳铁蛋白变体及其部分的方法。最后,本发明涉及由本发明核酸编码、用本发明方法生产的乳铁蛋白及其变体。因此,本发明提供一种经济有效的生产重组乳铁蛋白变体和其部分的方法。
文档编号C07K14/79GK1224359SQ97196156
公开日1999年7月28日 申请日期1997年6月2日 优先权日1997年6月2日
发明者O·M·康尼利, P·P·沃德 申请人:贝勒医学院