专利名称：制备N－甲酰基－α－L－天冬氨酰－L－苯丙氨酸甲酯的酶促方法
技术领域：
本发明涉及通过N-甲酰基-L-天冬氨酸(下文称为“F-L-Asp”)与L-苯丙氨酸甲酯或D,L-苯丙氨酸甲酯(下文分别称为“L-PM”和“D,L-PM”)之间的缩合反应制备N-甲酰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯(下文称为“F-APM”)的酶促方法。
α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯，即天冬苯丙二肽酯为具有约200倍蔗糖甜度的强的增甜剂，尤其可通过从F-L-Asp与L-PM或D,L-PM的缩合反应而获得的F-APM中除去N-甲酰基保护基来制备。
背景技术：
作为以前通过F-L-Asp与L-PM之间的缩合反应制备F-APM的方法，提出了例如US-A-3,786,039的方法，其中F-L-Asp和L-PM被允许在有机溶剂中反应。
然而，由于产生α-异构体和β-异构体，并且需要分离-纯化以除去无用的β-异构体，因此作为工业方法，该方法不是一种有用的方法。
作为一种改进上面缺点的方法，提出了一些制备F-APM的酶促方法。例如，JP-A-60-164495(本文使用的术语“JP-A”指未审
公开日本专利申请)提供了一个实例，其中通过F-L-Asp与L-PM.HCl之间的缩合反应以及使用嗜热菌蛋白酶作为酶类制备了为白色固体的F-APM.PM(1∶1加成产物)。白色固体漂浮在水上。反应后，通过加入盐酸将水的pH调至1.6，并将由此获得的F-APM萃取至乙酸乙酯中。
然而，甚至在这种方法中，F-APM的产率仅为41％，从此结果可以总结出当反应在水溶液中进行时，极大地限制了F-APM的产率。
作为解决该缺点的一种方法，在JP-A-62-259597中描述了一种新的制备N-保护的-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯(下文称为“N-保护的-APM”)的方法，其中在由N-保护的-L-天冬氨酸和L-PM溶解在其中的有机相和蛋白酶溶解在其中的水相组成的两相反应体系中进行所述缩合反应，并将产生的N-保护的-APM以铵盐或磷鎓盐的形式转移至有机相中。
然而，甚至在该方法中，N-保护的-APM的产率仅为20％，并且没有获得任何足够的效果。对于有机溶剂，仅仅叙述了可使用其中可溶解叔铵盐或叔磷鎓盐的任一有机溶剂；然而，在所述专利申请中没有描述有效的有机溶剂的具体种类。
为了提高N-苄氧羰基-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯(下文称为“Z-APM”)的产率，Nakanishi等提出了一种在两相体系中使用固定化嗜热菌蛋白酶的方法，其中含有N-苄氧羰基-L-天冬氨酸(下文称为“Z-L-Asp”)和PM的有机相被加入到含有固定化嗜热菌蛋白酶的水相中以在水相中产生Z-APM，将产生的Z-APM立即从水相转移至有机相(乙酸乙酯)中(生物技术(BIO/TECHNOLOGY)vol.3,pp.459-464,1985)。
然而，如该文献第460页图2所示，当使用摩尔比为1∶1的PM和Z-Asp时，Z-APM的产率仅为约40％。
除此之外，该文献第461页表1显示了有机溶剂对Z-APM合成的初始比例以及被定义为“水相中的L-PM浓度与有机相中的浓度之比”的L-PM的分配系数的影响。然而，仅研究了三种有机溶剂，即乙酸乙酯、1,2-二氯乙烷和氯仿，没有考虑被定义为有机相中的Z-APM浓度与水相中的浓度之比的产生的Z-APM的任何分配系数，并且在该文献中根本未讨论选择将Z-APM从水相萃取至有机相的有效的有机溶剂的标准。而且，没有描述或建议将该方法用于制备F-APM。
最近，在1996年9月29至10月2日举行的加拿大工业学会会议(Canadia Industrial Association)上，该发明人提出了通过F-L-Asp与L-PM或D,L-PM之间的缩合反应连续制备F-APM的简易方法，其中在水相中进行所述缩合反应，通过在由有机相和水相组成的两相反应体系中使用萃取剂将产生的F-APM转移至有机相中，其中N-保护的-L-天冬氨酸和L-PM被溶解在有机相中，蛋白酶被溶解在水相中；然而，他没有提供任何详细的结果，尤其是涉及将产生的F-APM从水相有效地萃取至有机相中的适宜有机溶剂的选择的地方。它仅指出在含水/1-丁醇两相体系中获得了极高的转化，但是这种转化仅稍高于80％。
因此，目前没有提出任何通过在两相反应体系中F-L-Asp与L-PM或D,L-PM之间的缩合反应以85％或更高的转化率有效制备F-APM的方法。
而且，当以工业规模生产F-APM时，从操作的效率和简易性角度来看，连续操作比不连续操作更为优选。
如JP-A-3-87195中描述的，该申请的申请人已将连续反应应用于通过Z-L-Asp与L-PM之间的缩合反应制备Z-APM的方法中，其中在含有固定化嗜热菌蛋白酶的水相内柱中产生Z-APM，同时将由此产生的Z-APM转移至外柱中的有机相中，并排出至有机溶剂的容器中。
然而，甚至在这种情况下，基于Z-L-Asp的Z-APM的产率仅为约70％。
Nakanishi等将前面文献(生物/技术vol.3,pp.459-464,1985)中描述的方法应用到该连续操作中，其中将溶解在乙酸乙酯中的含有80mM Z-L-Asp和200mM L-PM以及5mM CaCl2的底物溶液连续加入到含有固定化酶的水相中；然而，在Z-L-Asp与L-PM之间的缩合反应开始185小时后，基于Z-L-Asp的Z-APM的产率逐渐降低至75％。
因此，目前需要一种有效的制备二肽酯，尤其是N-保护的-APM的连续方法，其中可使用比上述方法中所采用的苄氧羰基更为便宜的保护基，并且其中可获得85％或更高的转化率。甲酰基比苄氧羰基更为便宜。
发明内容
通过考虑上述问题来进行本发明，本发明的一个目的是提供一种新的通过F-L-Asp与L-PM或D,L-PM之间的缩合反应有效制备F-APM的酶促方法。
因此，鉴于以上所述，发明人进行了深入细致的研究以解决前面描述的问题，通过这一发现完成了本发明，即通过适当选择水不混溶溶剂可将F-APM有效地从水相萃取至有机相中。
因此，本发明完成了一种新的通过N-甲酰基-L-天冬氨酸与L-苯丙氨酸甲酯或D,L-苯丙氨酸甲酯之间的缩合反应制备N-甲酰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯的酶促方法，它包括将包含在pH=6.0时，如下面公式(1)所描述的N-甲酰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯分配比例DF-APM为10-2或更高的水不混溶溶剂，DF-APM=PF--APM1+10pH-pKF-APM---(1)]]>其中PF-APM=(CF-APM)org/(CF-APM)aq(1a)；KF-APM={(CF-APM-)aq×CH+}/(CF-APM)aq---(1b);]]>(CF-APM)org在F-APM萃取之后，有机相所含有的F-APM的浓度；(CF-APM)aq在F-APM萃取之后，残留在水相中的F-APM的浓度；(CF-APM-)aq在F-APM萃取之后，残留在水相中的F-APM-的浓度；CH+]]>在F-APM萃取之后，残留在水相中的H+的浓度，并含有N-甲酰基-L-天冬氨酸和L-或D,L-苯丙氨酸甲酯的有机相；加入到含有嗜热茵蛋白酶样金属蛋白酶的水相中；在水相中进行缩合反应以产生N-甲酰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯；和将由此产生的N-甲酰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯从水相萃取至有机相中。
附图简要说明
图1显示F-APM形成的起始速率与pH之间的相互关系。图2显示在水相(.)和有机相(o)中产生的F-APM的浓度随时间的变化。图3显示用于连续生产F-APM的反应器，其中数字表明下面含义1反应器的主体2水套管3搅拌页片4,5进料含有F-APM和L-PM的底物溶液的供应泵6pH控制器7进料5N-NaOH以调节pH的供应泵8pH电极9沉降器图4表明当磷酸三丁酯被用作有机溶剂时，产生的F-APM(o)以及底物F-L-Asp(□)和L-PM(Δ)在有机溶剂中的浓度随时间的变化，实施发明的最佳方式通过由下面方案1描述的下面的F-APM的分配模型获得公式1中描述的PF-APM和KF-APM。
进一步，通过下面公式(3)描述的相互关系获得上面的公式(1)。DF-APM=(CF-APM)org(CF-APM)aq+(CF-APm-)aq]]>=(CF-APM)org(CF-APM)aq×11+(CF-APm-)aq/(CF-APM)aq]]>=PF-APM1+(KF-APM×CH+)-1=PF-APM1+10pH-pKF-APM---(3)]]>而且，由于大量的F-L-Asp可分布在水相中，在pH=6.0时，由下面公式(2)描述的其中F-L-Asp(DF-L-Asp)的分配比例为10-4或更小的有机溶剂适宜于加大对F-APM的转化率DF-L-Asp=PF-L-Asp1+10pH-PKF-L-Asp1+102pH-pKF-L-Asp1-pKF-L-Asp2---(2)]]>其中PF-L-Asp=(CF-L-Asp)org/(CF-L-Asp)aq(2a)；KF-L-Asp1={(CF-L-Asp-)aq×CH+}/(CF-L-Asp)aq---(2b);]]>KF-L-Asp2={(CF-L-Asp2-)aq×CH+}/(CF-L-Asp-)aq---(2c);]]>(CF-L-Asp)org在萃取F-APM之后，有机相所含有的F-L-Asp的浓度；(CF-L-Asp)aq在萃取F-APM之后，残留在水相中的F-L-Asp的浓度；(CF-L-Asp-)aq在萃取F-APM之后，残留在水相中的F-L-Asp-的浓度；CH+]]>在F-APM萃取之后，残留在水相中的H+的浓度，(CF-L-Asp2-)aq在萃取F-APM之后，残留在水相中的F-L-Asp2-的浓度。
DF-L-Asp表明抑制F-L-Asp从水相的转移(萃取)的能力。
通过下面方案2描述的F-L-Asp的分配模型获得PF-L-Asp、KF-L-Asp1和KF-L-Asp2。
进一步，通过下面公式(4)获得上面的公式(2)。DF-L-Asp=(CF-L-Asp)org(CF-L-Asp)aq+(CF-L-Asp-)aq+(CF-L-Asp2-)aq]]>=(CF-L-Asp)org(CF-L-Asp)aq×11+{(CF-L-Asp-)aq+(CF-L-Asp2-)aq}/(CF-L-Asp)aq]]>=PF-L-Asp1+(KF-L-Asp1/CH+)+(KF-L-Asp1/CH+)/(KF-L-Asp2/CH+)]]>=PF-L-Asp1+10pH-pKF-L-Asp1+102pH-pKF-L-Asp1-pKF-L-Asp2---(4)]]>另一方面，在其中被用作原料之一的L-PM或D,L-PM的水解速率高的有机溶剂不是优选的，水解速率与有机溶剂和水之间的相互溶解性密切相关。即，在水中溶解性大的有机溶剂不是优选的，因为在这些有机溶剂中L-PM或D,L-PM的水解速率高。因此，优选水不混溶的有机溶剂被用作本发明的溶剂。
这种水不混溶有机溶剂优选选自磷酸三丁酯、正戊醇、甲基乙基酮、异丁醇和三戊基醇的溶剂，因为在该溶剂中对F-APM的转化率高。
而且，可使用萃取剂以提高产生的F-APM的萃取效率，优选选择具有强萃取能力、为相转移催化剂的铵盐和磷鎓盐作为萃取剂。
进一步，任何商购的嗜热菌蛋白酶样金属蛋白酶，例如thermoase(商品名，由Daiwa Kasei有限公司生产)可用作用于本发明的酶。如本文所采用的，嗜热菌蛋白酶样金属蛋白酶包括“由nprM编码的野生型嗜热菌蛋白酶样中性金属蛋白酶，其中nprM为一种从嗜热脂肪芽孢杆菌克隆的蛋白酶基因(Kubo,M.等普通微生物学杂志，134:1883-1892(1988))或来自嗜热脂肪溶蛋白芽孢杆菌(Bacillusstearothermoproteolyticus)的基因(Endo,s.发酵技术杂志40:346-353(1962))，以及在其天然产生的序列中通过用其它氨基酸置换一个或多个氨基酸或通过缺失或插入一个或多个氨基酸而获得的任何突变体。这里包括的所有这类突变体能选择性地形成(N-保护的)-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯。该突变体的实例为具有上面“野生型嗜热菌蛋白酶样中性金属蛋白酶”的氨基酸序列的修饰中性蛋白酶，其中至少一个选自第144位残基亮氨酸、第150位残基天冬氨酸、第187位残基谷氨酸以及第227位残基天冬酰胺的氨基酸被非所述氨基酸的氨基酸残基置换(EP0616033A1)，尤其是其中第150位残基天冬氨酸被色氨酸置换(WO95/16029)的突变体，以及存在于第144位残基亮氨酸、第149位残基苏氨酸、第240位残基丙氨酸、第270位残基丙氨酸以及第288位残基丙氨酸中的电子密度腔体被通过用一个或多个疏水和/或多个大的氨基酸残基置换至少一个氨基酸残基来填充所述腔体的至少一部分，或通过影响限制电子密度腔的氨基酸残基而获得的突变体(WO97/21804)。例如如美国专利4,116768,EP0616033A1、WO95/16029和WO97/21804中所描述的，所有这些金属蛋白酶被用于为天冬氨酰苯丙氨酸甲酯前体的Z-APM的合成中。
F-L-Asp和L-PM或D,L-PM可首先被包含在水不混溶溶剂中，并可将由所述水不混溶溶剂组成的有机相加入到水相中，或将固体F-L-Asp和固体L-PM或D,L-PM分别加入到有机相和/或水相中。
从反应动力学理论的角度来看，水相中pH范围为6.0-6.5是最优选的，然而，这种pH范围不总是必需的，因为产生的F-APM进入有机相中的萃取速率为速率决定性的。例如，如果降低pH，由于L-PM或D,L-PM的溶解性增加，F-APM的转化率提高。因此，低于6.0-6.5的pH，例如pH为约5.0是优选的，应考虑产生的F-APM的萃取速率以及对F-APM的转化率之间的平衡来选择水相中的pH。
并且，不连续操作和连续操作均是有效的，但从操作的效率和简易角度看，连续操作是优选的，并且本发明的方法可用于连续操作。即连续操作是可能的，其中将含有F-L-Asp和L-PM或D,L-PM原料的有机相(具有如本文描述的N-F-APM分配比例)连续加入到嗜热菌蛋白酶样金属蛋白酶溶解在其中的水相中，将产生的F-APM从水相转移至有机相中，连续分离含有F-APM的有机相。
在本发明中，可通过本发明的方法有效地制备F-APM，其中含有水不混溶溶剂的有机相(具有如本文描述的N-F-APM分配比例)加入到水相中，在水相中进行L-Asp与L-PM或D,L-PM的缩合反应，将产生的F-APM有效地转移至特定的有机相中，并且本发明的方法可用于从操作效率和简易角度来看为优选的连续操作中。
实施例下面将通过实施例和比较实施例来说明本发明。然而，应注意本发明决不被这些实施例所限制。实施例1有机溶剂的选择将10ml用水饱和的有机溶剂和10ml用有机溶剂饱和的水溶液加入到样品试管中，并将50mM F-L-Asp溶解在用水饱和的所述有机溶剂中，将50mM F-APM溶解在用有机溶剂饱和的所述水溶液中。
对于表明有机溶剂从水相萃取F-APM能力的值，使用由公式(1)描述的DF-APM。
对于表明抑制F-L-Asp从水相转移至有机相能力的值，使用由公式(2)描述的DF-L-Asp。
40℃下，进行这些PF-APM和PF-L-Asp的测定。
多种有机溶剂的DF-APM值示于表1中，其中甲基异丁基酮、甲酸正丁酯和乙酸丁酯被显示作为比较实施例，多种有机溶剂的DF-L-Asp值示于表2中。
表1DF-APM有机溶剂 PF-APMPKF-APMpH=5 pH=6 pH=7磷酸三丁酯 13.0 4.01 1.200.130.0133正戊醇 3.70 4.22 0.527 0.0604 0.0061叔戊醇 6.89 4.21 0.866 0.107 0.0111甲基乙基酮 2.14 4.61 0.556 0.087 0.0087甲基异丁基酮 0.80 4.01 0.074 0.0080 0.00082甲酸正丁酯 0.64 4.17 0.083 0.0091 0.0012乙酸丁酯 0.47 4.02 0.045 0.0049 0.00049
表2DF-L-Asp(×10-4)有机溶剂PF-L-AspPKF-L-Asp1pKF-L-Asp2pH=5 pH=6 pH=7磷酸三丁酯 0.558 3.184.4418.2 0.226 0.00231正戊醇 0.166 2.954.171.90.0216 0.00021叔戊醇 0.498 3.164.6321.4 0.294 0.00305甲基乙基酮 0.296 3.434.4316.0 0.201 0.00206异丁醇 0.356 3.114.449.90.123 0.00125从这些表中清楚可见选自磷酸三丁酯、正戊醇、叔戊醇、甲基乙基酮和异丁醇的水不混溶溶剂是优选的，因为在pH=6.0时的DF-APM值为1×10-2或更高，在pH=6.0时的DF-L-Asp值为1×10-4或更低。水相最优选pH的确定分别制备含有1g/l thermoase(商品名，Daiwa Kasei有限公司生产)的水溶液和其中溶解了70mM F-L-Asp和100mM L-PM的底物溶液并保存在40℃。
在通过加入1N NaOH水溶液调节所述底物溶液的pH后，将5ml由此获得的底物溶液与1g/l thermoase混合，F-L-Asp和L-PM之间的缩合反应开始。
用HPLC分析F-L-Asp、L-PM和F-APM的浓度。
图1表明pH与F-APM最初形成速率之间的相互关系。坐标轴显示针对6.4处的F-APM初始形成速率的相对值(V6.4=0.0060mM/Min)。
很清楚水相最优选的pH为约6.4实施例2在水相和有机相的双相体系中通过不连续操作完成本实施例。
分别制备含有1.131g/l thermoase,0.1M缓冲剂(MES)和0.01M CaCl2的酶水溶液(pH=6.5)和含有88.15mM F-L-Asp和120.97mM L-PM的底物磷酸三丁酯溶液，并保存在40℃。将各5ml两种溶液混合，F-L-Asp和L-PM之间的缩合反应开始。用HPLC分析F-L-Asp、L-PM和F-APM的浓度。
图2显示在水相和有机相中F-L-APM的浓度与时间的关系。
显然所有产生的F-APM被转移至有机相中，任何F-APM不存在于水相中，基于F-L-Asp的从F-L-Asp转化为F-APM的转化率为约12.6％。比较实施例1进行与实施例1类似的方法，但不使用有机溶剂。
F-L-Asp转化为F-APM的转化率仅为约3.7％。实施例3预先将含有20g/l thermoase(商品名，Daiwa Kasei有限公司生产)的酶水溶液倒入300ml反应器中，并通过使用图3描述的反应装置，将含有约5mM F-L-Asp和约130mM L-PM的各种有机溶剂的底物溶液以0.5ml/分钟连续加入到该反应器中(在反应器中的停留时间为10小时)。
将起始原料F-L-Asp和L-PM从有机相萃取至水相中，让其在含有游离酶的水相中反应，将产生的F-APM从水相萃取至有机相中，连续分离出F-APM。由于其强的疏水特性，游离酶不必从水相中萃取出来，这些酶可以连续使用。
通过使用具有3.5cm直径和7mm宽的棒型叶片的搅拌器以450rpm搅拌反应溶液，在反应期间，将温度和pH保持在40℃和6.0。
通过使用多种有机溶剂获得的F-APM的转化率示于下面表3中。
表3有机溶剂F-APM的转化率(％)磷酸三丁酯 96甲基乙基酮 64甲基乙基酮 85(使用D,L-PM)表3表明磷酸三丁酯的转化率为96％的非常高的值。
图4显示当使用磷酸三丁酯时，在有机相中F-L-Asp、L-PM和产生的F-APM的浓度随时间的变化，并表明F-APM以恒定浓度连续产生。
虽然已详细并参考其具体实施例描述了本发明，对本领域普通技术人员来讲，在不背离其实质和范围的情况下对其作出的各种变化和修改将是显而易见的。
本发明是基于1996年10月15在日本申请的申请号平成8-272129，其全部内容被本文引作参考。
权利要求
1．一种通过N-甲酰基-L-天冬氨酸与L-苯丙氨酸甲酯或D,L-苯丙氨酸甲酯之间的缩合反应制备N-甲酰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯的酶促方法，它包括将包含在pH=6.0时，如下面公式(1)所描述的N-甲酰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯分配比例DF-APM为10-2或更高的水不混溶溶剂DF-APM=PF-APM1+10pH-pKF-APM---(1)]]>其中PF-APM=(CF-APM)otg/(CF-APM)aq(1a)；KF-APM={(CF-APM-)aq×CH+}/(CF-APM)aq---(1b);]]>(CF-APM)org在萃取F-APM之后，有机相所含有的F-APM的浓度；(CF-APM)aq在萃取F-APM之后，残留在水相中的F-APM的浓度；(CF-APM-)aq在萃取F-APM之后，残留在水相中的F-APM-的浓度；CH+在萃取F-APM之后，残留在水相中的H+的浓度，并含有N-甲酰基-L-天冬氨酸和L-或D,L-苯丙氨酸甲酯的有机相；加入到含有嗜热菌蛋白酶样金属蛋白酶的水相中；在水相中进行缩合反应以产生N-甲酰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯；和将由此产生的N-甲酰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯从水相萃取至有机相中。
2．根据权利要求1的方法，其中在水不混溶溶剂中，当pH=6.0时，由下面公式(2)描述的N-甲酰基-L-天冬氨酸的分配比例DF-L-Asp为10-4或更小DF-L-Asp=PF-L-Asp1+10pH-pKF-L-Asp1+102pH-pKF-L-Asp1-pkF-L-Asp2---(2)]]>其中PF-L-Asp=(CF-L-Asp)org/(CF-L-Asp)aq(2a)；KF-L-Asp1={(CF-L-Asp-)aq×CH+}/(CF-L-Asp)aq---(2b);]]>KF-L-Asp2={(CF-L-Asp2-)aq×CH+}/(CF-L-Asp-)aq---(2c);]]>和(CF-L-Asp)org在萃取F-APM之后，有机相所含有的F-L-Asp的浓度；(CF-L-Asp)aq在萃取F-APM之后，残留在水相中的F-L-Asp的浓度；(CF-L-Asp-)aq在萃取F-APM之后，残留在水相中的F-L-Asp-的浓度；CH+在F-APM萃取之后，残留在水相中的H+的浓度，(CF-L-Asp2-)aq在萃取F-APM之后，残留在水相中的F-L-Asp2-的浓度。
3．根据权利要求1或2的方法，其中水不混溶溶剂为至少一种选自磷酸三丁酯、正戊醇、甲基乙基酮、异丁醇和三戊基醇的溶剂。
4．根据权利要求1-3任一项的方法，其中将含有F-L-天冬氨酸和L-或D,L-苯丙氨酸甲酯的水不混溶溶剂连续加入到水相中，连续分离出包含产生的N-甲酰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯的有机相。
5．根据权利要求1-4任一项的方法，其中预先将N-甲酰基-L-天冬氨酸和L-苯丙氨酸甲酯或D,L-苯丙氨酸甲酯溶解在水不混溶溶剂中，接着将包含水不混溶溶剂的有机相加入到水相中。
6．根据权利要求1-5任一项的方法，其中将固体N-甲酰基-L-天冬氨酸和固体L-苯丙氨酸甲酯或固体D,L-苯丙氨酸甲酯分别加入到有机相和/或水相中。
全文摘要
一种通过N－甲酰基－L－天冬氨酸与L－苯丙氨酸甲酯或D,L－苯丙氨酸甲酯之间的缩合反应制备N－甲酰基－α－L－天冬氨酰－L－苯丙氨酸甲酯的酶促方法,它包括:将包含在pH=6.0时,如下面公式(1):D
文档编号C07K5/075GK1236371SQ97198809
公开日1999年11月24日 申请日期1997年10月14日 优先权日1996年10月15日
发明者平田彰 申请人:荷兰加甜剂公司