专利名称：一种核酸类复合物及其生产方法和其在制备免疫制剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种核酸类复合物及其生产方法和其在制备免疫制剂中的应用，特别是用核酸片段、多肽与水溶性多聚物通过共聚或共价反应生成的核酸类复合物及其生产方法和其在制备免疫制剂中的应用。
背景技术：
提高机体免疫力的最主要的手段是接种疫苗。目前已有多种方法用来生产抗传染性病原体的疫苗，如灭活疫苗、减毒活疫苗、重组疫苗、亚单位疫苗和DNA疫苗等，它们的基本作用原理是相同的，即借助病原体的抗原物质在体内被免疫细胞识别而激发免疫反应，达到免疫个体不被传染性病原体感染的目的。在各种疫苗技术使用中，免疫佐剂发挥着重要的作用，它们对某些分子的相对质量小的多糖或多肽等抗原性微弱的物质，可明显增强其抗原性。但在使用中发现，所使用的佐剂均存在某些问题。例如从细菌中得到的佐剂如氟氏佐剂会引起注射部位的严重过敏反应，导致形成硬结或脓肿；细胞因子类虽然可以增强免疫反应，但它随剂量增加其毒性也增强，另外其制作复杂，成本高；合成核酸或寡核酸不管是单链或双链，在体内易被降解，而达不到应有的作用；另外以上佐剂主要是针对动物的系统免疫系统，通过肌肉、皮下注射而达到，其局限性是无法调动有效的粘膜免疫反应，从而使其应用受到限制；多聚物包裹免疫佐剂现在仍处于实验阶段，同时制造工艺上也比较繁琐。
发明内容
本发明是针对现有技术存在的上述问题，提供一种可以用于制备各种免疫制剂的核酸类复合物及其制备方法，特别是用核酸片段、多肽与水溶性多聚物通过共聚或共价反应生成的复合物及其生产方法和其在制备免疫制剂中的应用。利用本发明复合物制成的提高机体免疫力的免疫制剂，不仅可以不使用佐剂，而且可以激活机体完全免疫反应，有效预防病原体传染。
本发明核酸类复合物是由核酸片段、多肽与水溶性多聚物通过共聚或共价反应生成，具有如下通式核酸/多肽/水溶性多聚物其中核酸片段可以是包括含有随机序列或CpG核心序列的单链、双链寡聚核酸或质粒，其长度是15至10000碱基或碱基对；多肽可以是各种抗原类物质；多聚物可以是水溶性单一高分子成分，如聚乙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、淀粉衍生物、纤维素醚及衍生物、黄原胶、聚乳酸、聚马来酸、聚氨酯树脂、聚乙烯基吡咯烷酮、甲壳胺；也可以是多种水溶性高分子多聚物的混合物。优选为甲壳胺，甲壳胺分子量在10000～5000000范围内，脱乙酰度在75％以上。
本发明核酸类复合物的生产方法为使多肽在催化条件下与水溶性多聚物进行共聚或共价结合，生成多肽/水溶性多聚物后，再使其与核酸片段反应，即可生成本发明复合物；也可以将多肽、核酸片段混合后，再使其在催化条件下与水溶性多聚物发生共聚或共价结合反应，制得本发明复合物。将上述反应的生成物纯化后，可得纯净的本发明复合物。其中水溶性多聚物与多肽的摩尔比值为0.1～10，优选为0.5～5，更优选为0.8～2；反应温度为0～37℃，优选为0～6℃。
通过试验，本发明人发现本发明复合物可激发机体产生完全免疫反应，包括体液免疫反应和细胞免疫反应，其中细胞毒性T细胞反应起着重要的作用。试验已经证明使用本发明复合物的免疫方法使细胞所产生的靶抗原在体内能够被清除。当抗原性物质降解成小肽，被MHC-1分子结合，递呈到细胞表面，这种MHC-1抗原复合物能够有效地刺激CD8T细胞，产生细胞毒性T细胞反应(即杀伤T细胞反应)，该反应是机体抵御病原体和清除有害细胞的关键。使用本发明复合物的免疫方法比单独使用蛋白质抗原或蛋白质抗原加佐剂接种更能有效地产生特异性抗体，能有效地激发特异性细胞毒性T细胞反应，可广泛地应用于制备各种免疫制剂。
本发明与现有技术相比具有以下优点1、本发明复合物与灭活的或失活的病毒疫苗、蛋白疫苗、亚单位疫苗和DNA疫苗等接种方法相比，可更为安全有效地保护机体抵御病原体感染、抗肿瘤和治疗自主免疫疾病；2、本发明复合物能够有效地激发机体的完全免疫反应，又避免使用感染性的制剂、载体和不安全的遗传物质。其它常规免疫接种技术(除了DNA疫苗以外)，如果不使用感染性制剂就不会激活细胞毒性T细胞反应，因此灭活或失活疫苗、亚单位疫苗接种均不产生完全的免疫反应，而本发明复合物能有效地克服常规免疫接种技术的这些不足；3、本发明复合物不要求特殊的反应条件，一般药厂的普通设备即可生产，生产方法简单，提纯容易，易于工业化生产；4、本发明复合物用途广泛，针对性的致病病原体有病毒、原核细胞、真核细胞，真核细胞病原体包括细胞致病病原体和多细胞寄生虫类和过敏源物质等。
四
图1实施例6的测定多肽释放动力学实验结果图；图2实施例7的测定多肽释放动力学实验结果图；
图3实施例8的测定核酸释放动力学实验结果图；图4实施例9的测定核酸/多肽/甲壳胺复合物实验结果图；图5实施例10的测定核酸/多肽/甲壳胺/PEG复合物实验结果图；图6实施例11的ELISA检测专一性抗体的实验结果图。
五、具体实施例下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1 单链核酸的制备合成单链寡聚核酸是通过标准的自动寡聚核酸合成仪(如ABI，Perceptive Biosystem Expedite 8909等)，合成方法按仪器制造商使用方法，按特定序列(如GATIGGACGTTAGTGACGTTAG)合成。合成后的寡聚核酸，经去保护，酒精沉淀和无离子水溶解后，经紫外分光光度计在波长260纳米定量。其纯度可经毛细管电泳分析。内毒素也许定量。
实施例2双链核酸的制备合成双链核酸按实施例1的方法，按特定序列poly(dA-dT)合成，合成后的核酸，经去保护，酒精沉淀和无离子水溶解后，经紫外分光光度计在波长260纳米定量。
另一种方法是将小牛胸腺组织低温后粉碎，在苯酚氯仿溶液中去掉蛋白质，双链核酸经乙醇沉淀而分离出来。有关此技术的详细描述可在Sambrook等人的＂Molecular Cloning＂(第二版1998，Gold Spring HarborLaboratory Press，纽约)查询。
另一种方法是从大肠杆菌中提取质粒DNA，其方法和技术的详细描述可在Sambrook等人的＂Molecular Cloning＂(第二版1998，Cold SpringHarbor Laboratory Press，纽约)查询。
实施例3多肽的制备多肽可以通过标准的自动多肽合成仪(如ABI，433A等)合成，合成方法按仪器制造商使用方法；或从动物组织、细胞或微生物中，按常规的蛋白质化学方法进行提取，也可以从基因工程表达菌或细胞中提取。这些多肽提取方法都是公知的，在Doonan的＂Protein PurificationProtocols＂(1996，Humana Press，NJ)中有详细描述。
实施例4多肽/甲壳胺的制备多肽/甲壳胺的制备通过溴化氰(CNBr)的活化反应。50～100毫克甲壳胺悬浮于5～20毫升1摩尔Na2CO3及10～50毫克溴化氰中活化10分钟。活化甲壳胺经洗涤收集后，再悬浮于5～10毫升1摩尔Na2CO3溶液中并与0.5～5毫克多肽混合，在0～4℃不断搅拌，过夜。然后反应物通过滤纸洗涤收集。
另一种方法是甲壳胺溶于0.1～2％乙酸成甲壳胺乙酸溶液，再与等摩尔的多肽磷酸缓冲液pH6.0～6.5在2～6℃混合，加入0.5～5％戊二醛/磷酸缓冲液在2～6℃反应1～300分钟后，加入10～50毫克NaBH4终止反应。加入1～5毫升三乙醇胺不断搅拌混合后，通过滤纸洗涤收集分离出多肽/甲壳胺复合物。
另一种方法是通过二环己基碳二亚胺(DCC)的活化反应。100毫克多肽溶液悬浮于50～100毫升二氧杂环乙烷溶液中，并加入100～500微克DCC，在不断搅拌下，混合30～240分钟，再加入10～100毫升0.1～2％甲壳胺乙酸溶液，在不断搅拌下，混合1～6小时，加入1～5毫升三乙醇胺不断搅拌，混合后，通过滤纸洗涤收集分离出多肽/甲壳胺复合物。
另一种方法是通过m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide(MBS)的活化反应。向1～10毫升0.1～2％甲壳胺乙酸溶液中，加入10～500微升1～5％的MBS二甲基甲酰胺溶液，在室温下不断搅拌，混合30～240分钟，加入1～5毫升三乙醇胺不断搅拌，混合后，通过滤纸洗涤收集分离出活化的甲壳胺溶液。再加入1～10毫克多肽/磷酸缓冲液pH7.0～7.5，在室温下不断搅拌，混合2～10小时，加入1～5毫升三乙醇胺不断搅拌混合后，通过滤纸洗涤收集分离出多肽/甲壳胺复合物。
实施例5多肽/核酸/甲壳胺的制备0.1～2毫克寡聚核酸或双链核酸与上述2～20毫克多肽/甲壳胺反应物在0～4℃不断搅拌下过夜，然后反应物通过滤纸洗涤收集。
另一种方法是甲壳胺溶于0.1～2％乙酸成甲壳胺乙酸溶液，再与0.1～2毫克寡聚核酸或双链核酸和1～20毫克的多肽/磷酸缓冲液pH6.0～6.5在2～6(混合，加入0.5～5％戊二醛/磷酸缓冲液在2～6℃反应1～300分钟后，加入10～50毫克NaBH4终止反应。加入1～5毫升三乙醇胺不断搅拌，混合后，通过滤纸洗涤收集分离出核酸/多肽/甲壳胺复合物。
另一种方法是1～5克甲壳胺，0.1～0.5克寡聚核酸或双链核酸和0.1～0.5克多肽溶于150毫升0.1～2％乙酸中不断搅拌，溶解后，倒入玻璃盘中干燥过夜。干燥后粉碎成颗粒，再与0.5～5％戊二醛/甲醇磷酸缓冲液反应1～60分钟，用甲醇洗涤后收集。
另一种方法是甲壳胺溶于0.1～2％乙酸成甲壳胺乙酸溶液，加入0.1～1毫克聚乙烯吡咯烷酮K-30(PVP)到1～5毫升甲壳胺乙酸溶液中，不断搅拌混合直到PVP溶解，再与0.1～2毫克寡聚核酸或双链核酸和1～20毫克的多肽/磷酸缓冲液pH6.0～6.5混合，加入0.5～5％戊二醛/磷酸缓冲液在2～6℃反应1～300分钟后，加入1～20毫克NaBH4终止反应。加入1～5毫升三乙醇胺不断搅拌，混合后，通过滤纸洗涤收集分离出核酸/多肽/甲壳胺/PVP复合物。
另一种方法是甲壳胺溶于0.1～2％乙酸成甲壳胺乙酸溶液，加入0.1～1毫克聚乙二醇-400(PEG-400)到1～5毫升甲壳胺乙酸溶液中，不断搅拌混合直到聚乙二醇溶解，再与0.1～2毫克寡聚核酸或双链核酸和1～20毫克的多肽/磷酸缓冲液pH6.0～6.5混合，加入0.5～5％戊二醛/磷酸缓冲液在2～6℃反应1～300分钟后，加入1～20毫克NaBH4终止反应。加入1～5毫升三乙醇胺不断搅拌，混合后，通过滤纸洗涤收集分离出核酸/多肽/甲壳胺/PEG复合物。
实施例6测定多肽释放动力学实验溶性多肽释放测定0.1毫克核酸/多肽/甲壳胺/PEG复合物置于1毫升0.01M乙酸溶液中，按不同时间取出20微升测定280纳米紫外吸收以确定其溶出量。甲壳胺∶PEG＝1∶0(Chitosan)，20∶1(Chitosan+PEG 1)，4∶1(Chitosan+PEG 2)，2∶1(Chitosan+PEG 3)实验结果见附图1。
从图中可以看出，核酸/多肽/甲壳胺/PEG复合物中的多肽在酸性溶液中可以逐步释放，而甲壳胺与PEG比例可以影响其释放动力学。在甲壳胺与PEG比是4∶1时，多肽释放比其他比例复合物缓慢，在24～72小时之间达到最大。而其他比例复合物多肽释放最大峰在10小时后，开始下降。
实施例7 测定多肽释放动力学实验酸溶性多肽释放测定0.1毫克核酸/多肽/甲壳胺/PVP复合物置于1毫升0.01M乙酸溶液中，按不同时间取出20微升测定280纳米紫外吸收以确定其溶出量。甲壳胺∶PVP＝1∶0(Chitosan)，20∶1(Chitosan+PVP 1)，4∶1(Chitosan+PVP 2)，2∶1(Chitosan+PVP 3)，1∶1(Chitosan+PVP 4)。
实验结果见附图2。
实施例8测定核酸释放动力学实验酸溶性多肽释放测定0.1毫克核酸/多肽/甲壳胺/PEG复合物置于1毫升0.01M乙酸溶液中，按不同时间取出20微升测定280纳米紫外吸收以确定其溶出量。甲壳胺∶PEG＝1∶0(Chitosan)，20∶1(Chitosan+PEG 1)，4∶1(Chitosan+PEG 2)，2∶1(Chitosan+PEG 3)。
实验结果见附图3。
从图中可以看出，核酸/多肽/甲壳胺/PEG复合物中的核酸在酸性溶液中可以逐步释放，而甲壳胺与PEG比例可以影响其释放动力学。在甲壳胺与PEG比是4∶1时，核酸释放比其他比例复合物缓慢，在120小时后核酸仍然释放。而其他比例复合物核酸释放最大峰在72小时后，开始下降。
实施例9测定核酸/多肽/甲壳胺复合物实验将0.1毫克核酸/多肽/甲壳胺复合物，核酸，多肽或甲壳胺置于10毫升0.02M硼酸缓冲液pH8.4，取40微升用于分析，将BECKMAN MDQ毛细管电泳仪设置为30kV，200纳米紫外吸收，测定时间为15分钟，缓冲液为0.02M硼酸缓冲液pH8.4。
实验结果见附图4。
图中X轴为时间，Y轴为200纳米紫外吸收值，曲线为溶菌酶、质粒DNApCMV4、甲壳胺、核酸/多肽/甲壳胺复合物组成。
图中显示，未形成复合物之前，各种物质多为小分子或单体，形成复合物之后，核酸/多肽/甲壳胺复合物为高分子多聚物复合物。
实施例10测定核酸/多肽/甲壳胺/PEG复合物实验将1毫克核酸/多肽/甲壳胺/PEG复合物溶于1毫升0.01M乙酸溶液中，溶解后，取出10微升于0.7％琼脂糖-EB凝胶点样孔中，以100伏直流电压电泳1小时后，在紫外灯下拍照。
实验结果见附图5。
图中M为分子量标志物，V为质粒DNA pCMV4，1为多肽/甲壳胺复合物，2为甲壳胺/PEG复合物，3为核酸/多肽/甲壳胺/PEG复合物(甲壳胺∶PEG是4∶1)，4为核酸/多肽/甲壳胺/PEG复合物(甲壳胺∶PEG是2∶1)，5为核酸/多肽/甲壳胺/PVP复合物，6为核酸/多肽/甲壳胺复合物，7为核酸/多肽/甲壳胺复合物。
实施例11抗体的ELISA检测在小白鼠肌肉注射100微克核酸/多肽/多聚物复合物后，第二周再重复注射同等剂量一次，两周后，取血清对免疫血清进行抗体水平ELISA检测，测定其免疫反应。
将96孔酶标板用适量抗原包被，4℃过夜；弃去包被液并用洗液PBST洗板三次；加入不低于1∶100稀释度的免疫动物血清，37℃孵育2小时；PBST洗板三次后，每孔加入适量辣根过氧化物酶标记的羊抗动物二抗(IgG)100μl 37℃孵育1小时后弃去；PBST洗三次，加入底物液100μl，室温显色反应30分钟，2M硫酸终止反应，用酶标仪测定相应波长的OD值。
实验结果见附图6。
图中，对照＝pCMV4，质粒＝口蹄疫VP1(pCMV4-VP1)质粒，复合物＝口蹄疫VP1多肽与pCMV4-VP1与甲壳胺的复合物。
权利要求
1.一种核酸类复合物，特别是由核酸片段、多肽与水溶性多聚物通过共聚或共价反应生成的核酸类复合物，具有如下通式核酸/多肽/水溶性多聚物
2.按照权利要求1所述的复合物，其中核酸片段可以是包括含有随机序列或CpG核心序列的单链、双链寡聚核酸或质粒，其长度在15至10000碱基或碱基对范围内。
3.按照权利要求1所述的复合物，其中多肽可以是各类抗原类物质。
4.按照权利要求1所述的复合物，其中多聚物可以是水溶性单一高分子成分，如聚乙二醇、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、淀粉衍生物、纤维素醚及衍生物、黄原胶、聚乳酸、聚马来酸、聚氨酯树脂、聚乙烯基吡咯烷酮、甲壳胺；也可以是多种水溶性高分子多聚物的混合物。
5.按照权利要求1所述的复合物，其中水溶性多聚物优选为甲壳胺。
6.按照权利要求1所述的复合物，其中甲壳胺分子量在10000～5000000范围内，脱乙酰度在75％以上。
7.权利要求1所述的复合物的生产方法使多肽在催化条件下与水溶性多聚物进行共聚或共价结合，生成多肽/水溶性多聚物后，再使其与核酸片段反应，即可生成本发明复合物，将反应生成物纯化后，即可得纯净的本发明复合物——核酸/多肽/水溶性多聚物，其中水溶性多聚物与多肽的摩尔比值为0.1～10，反应温度为0～37℃。
8.权利要求1所述的复合物的生产方法将多肽、核酸片段混合后，在催化条件下，使其与水溶性多聚物发生共聚或共价结合反应，即可生成本发明复合物，将反应生成物纯化后，即可得纯净的本发明复合物——核酸/多肽/水溶性多聚物，其中水溶性多聚物与多肽的摩尔比值为0.1～10，反应温度为0～37℃。
9.根据权利要求7或8所述的生产方法，其特征在于水溶性多聚物与多肽的摩尔比值优选为0.5～5。
10.根据权利要求7或8所述的生产方法，其特征在于水溶性多聚物与多肽的摩尔比值进一步优选为0.8～2。
11.根据权利要求7或8所述的生产方法，其特征在于反应所需的温度条件优选为0～6℃。
12.权利要求1～6中任意一项获得的复合物可用于提高机体免疫力的免疫制剂中。
全文摘要
本发明涉及一种核酸类复合物及其生产方法和其在制备免疫制剂方面的应用。本发明是由核酸片段、多肽与水溶性多聚物在催化条件下,通过共聚或共价反应生成,具有如下通式:核酸/多肽/水溶性多聚物。本发明复合物不仅可以更为安全有效地保护机体抵御病原体感染、抗肿瘤和治疗自主免疫疾病,有效地激发机体的完全免疫反应,而且生产方法简单,提纯容易,易于工业化生产。本发明复合物可广泛地用于制备各种免疫制剂。
文档编号C08B37/00GK1422888SQ0114024
公开日2003年6月11日 申请日期2001年12月7日 优先权日2001年12月7日
发明者王宾 申请人:王宾