透明质酸的甲酯的制作方法

专利名称：透明质酸的甲酯的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于产生透明质酸(HA)的曱酯的方法。
背景技术：
透明质酸(HA)是天然的线性糖类聚合物，其属于非硫酸化的(non-sulfated) 糖胺聚糖类。它由p-l,3-iV-乙酰葡糖胺和P-l,4-葡糖醛酸的重复二糖单元组成， 具有多至6MDa的分子量(MW)。 HA存在于透明软骨、滑膜关节液(synovial joint fluid)和真皮和表皮皮肤组织中。可以从天然组织包4舌脊推动物的结締组 织，从人脐带和从鸡冠(cocks，comb)中提取HA。然而，现今优选的是通过孩爻 生物方法制备透明质酸以使转移传染剂的潜在风险最小化，并且增加产物均 勻性、品质和可用性(美国专利No. 6,951,743; WO 03/0175902)。
已经鉴定了 HA在体内的多种功能。它在生物体中作为对许多组织(如皮 肤、腱、肌肉和软骨)的细胞的机械支持而发挥重要作用。HA参与了关键的 生物学过程，如组织的湿润，和润滑。还认为它在许多生理功能中具有作用， 如粘附、发育、细胞运动性、癌、血管发生和愈伤。由于HA独特的物理和 生物学性质(包括粘弹性、生物相容性和生物可降解性)，将HA广泛应用在化 妆品、眼科学、风湿病学、药物和基因递送、愈伤以及组织工程中目前的和 正在发展的应用中。在这些应用的一些中HA的使用受到下述事实的限制， 即在室温也就是大约2(TC HA可溶于水，在体内其#1透明质酸酶迅速降解， 和难以将其加工成生物材料。因此引入了 HA的化学修饰，以改进HA的物 理和机械性质及其体内停留时间。
文献中描述了通过从人脐带提取获得的具有高分子量的透明质酸的甲酯 (Jeanloz和Forcheilli, 1950, B/o/. C/zem. 186: 495-511;及Jager和Winkler, 1979, J Bacfen'o/ogy 1065-1067)。可以通过用重氮曱烷的醚溶液处理游离的透 明质酸获得这种酯，并且证明基本上所有羧基都被酯化。还描述了具有5-15 个二糖单元的HA低聚物的曱酉旨(Christener, Brown和Dziewiatkowski， 1977， 所oc/^m. / 167: 711-716)。还描述了用羟基醇基团的部分中的曱醇酯化的透明质酸曱酯(Jeanloz， 1952, / 5/o/. O^m. 194: 141-150;和Jeanloz, 1952, //e/vd/ca C7z/脂'ca爿cto 35: 262-271)。
根据皮肤水合研究，已经观察到与天然透明质酸相比，透明质酸曱酯的 皮肤水合能力得到了增强(美国专利4,851,521)。
为了比较透明质酸及其衍生物，della Valle和Romeo已经进行了一些实 验(美国专利4,851,521)。根据这些结果，确认了透明质酸甲酯的水合能力优 于天然化合物。
della Valle和Romeo描述了透明质酸的酯类的制备方法(欧洲专利No. 216453B1),其中首先在两步中将HA转化成季铵盐，使其可溶于有机溶剂， 然后与脂肪族、芳脂族(araliphatic)、芳香族、环和杂环系列的醇衍生物反应。 产生HA羧基完全或部分酯化的化合物。
在欧洲专利No. 1 401 876 Bl中，Mariotti和同事描述了新的HA衍生物， 其中羟基部分或全部酯化，并且用醇将羧基全部或部分酯化，或者所述^^亍生 物为盐的形式。
在专利申请WO 2005/092929 Al中，Ferlini公开了低取代度的透明质酸 丁酯的制备和用途。HA的季铵盐与酰化剂反应，导致羟基的部分酯化。
Toida描述了用于产生烷基酯化的糖胺聚糖的方法(美国专利申请No. 2006/0172967 Al)。该方法包括将三烷基硅烷基重氮曱烷与二甲亚砜中的透明 质酸和甲醇反应的步骤。在羧基处发生烷基酯化，并且可以是部分或全部酯化。
皮肤的水合及其营养(nourishment)看起来与皮肤组织的透明质酸含量密 切相关。事实上已经证明，外源施用HA明显有助于皮肤组织的水合状态。 还在#4居本发明的HA酯化衍生物中，以甚至更高的程度，发现了透明质酸 的这些特性，并且因此它们可以大量用于化妆品领域。
可以通过本质上用于羧酸酯化的方法制备透明质酸酯，例如通过在催化 物质如强无^^酸或酸型离子交换剂存在的情况下用期望的醇，或者在无冲几或 有机碱存在的情况下用能引入期望的醇残基的酯化剂，处理游离的透明质酸。 可使用文献中已知的酯化剂，包括各种无机酸或有机磺酸(sulphonic acid)、氢 酸(hydracid)的酯，即烃基卣化物，曱基或乙基碘化物，或中性硫酸或烃基酸， alfites，碳酸盐，硅酸盐，亚磷酸盐或烃基磺酸盐，曱基苯或对曱苯磺酸盐或 曱基或乙基氯磺酸盐。反应可以在合适的溶剂中发生，例如醇，优选与待引 入羧基的烷基对应的醇。但是反应也可以在非极性溶剂中发生，如酮，醚，如二噁烷或疏质子溶剂(aprotic solvent)如二甲亚砜。作为碱，可以使用例如i咸 或碱土金属的氢氧化物(hydrate)或氧化镁或氧化银或这些金属之一的碱性盐， ^口碳酉吏盐，和有才几石威， 一又氮4b;咸(tertiaiy azotizedbase),》口p比口定(pyridine)或可 力丁(collidine)。还可以使用碱类离子交换剂代替碱。
还可以根据另 一种方法有利地制备透明质酸的甲酯，所述方法经常用于制 备具有羧基的酸性多糖的羧酸酯。这种方法基于用醚化剂处理包含羧基的酸性 多糖的季铵盐，优选在疏质子有机溶剂中。作为起始的酸性多糖，除透明质酸 之外，可以使用，例如，动物或植物来源的其他酸性多糖及其合成^f奮饰衍生物 (如酸性半纤维素酶)，其可获得自某些植物的碱性提取物并且在木聚糖沉淀后， 其中的二糖组分由D-葡糖醛酸和D-木吡喃糖构成(参见W. Pigman的"The Carbohydrates", 668-669页-R. L. Whistler, W. M. Corbett),可获得自同样来源的 月M和酸性多糖，即，聚半乳糖醛酸，可获得自植物胶(分泌物(exudate))的酸 性多糖，如阿拉伯胶(arabicgum)，黄蓍胶(tragacanth)，和源自海藻的最后的酸 性多糖，如琼脂和角叉菜胶(carrageenans)。作为起始的材料，当然还可以使用 通过将所有上述多糖降解而获得的分子部分(molecular fraction)。
已知的酯化方法常常通过逐渐(by degrees)向上述铵盐向上述溶剂之一， 例如向二曱亚砜加入酯化剂来进行。作为烷化剂，可以使用上述那些，特别 是烃基卣化物，例如烷基卣化物。作为起始季铵盐，优选使用较低级的四烷 基化铵，具有的烷基优选为l-6个碳原子。通常使用四丁基铵的透明质酸盐。 可通过在水溶液中，使酸性多糖的金属盐，优选上述之一，特别是钠盐或钾 盐，与和季铵石威成盐的石黄酸初于月旨(salified sulphonic resin with a quaternary ammonium base)反应来制备这些季铵盐。
在近来的报道中，使用三曱基硅烷基重氮曱烷(TMSD, Hirano, Sakai, Ishikawa, Avci， Linhardt和Toshihiko Toida, 2005, Car6o/^rafe i^e"/r/z 340: 2297)制备低分子量乙酰透明质酸(hyaluronan)的甲酯，其中羧基完全酯化。甲 酯通过如下方式制备首先将乙酰透明质酸钠盐转化成它的酸形式。在此过程 中，乙酰透明质酸溶于水中，并施加于Dowex50X8阳离子交换柱，收集酸性 级分，然后冻干。将制备的乙酰透明质酸(K")溶于DMSO-曱醇(20:1)混合物中。 使用的乙酰透明质酸为低分子量的(平均分子量20,000 Da)，使其以使用的浓度 溶于DMSO。向反应混合物中加入三曱基硅烷基重氮曱烷。反应在室温进行 60分钟。向得到的反应混合物中加入乙酸以去除TMSD。用由无水乙酸钠饱和的乙醇进一步在o。c处理1小时。将反应混合物离心，并将沉淀溶于水中， 然后加入乙酸，剧烈混合并在1000 g离心。离心后将获得的水层对水透析并 冻干。将获得的产物表征为乙酰透明质酸的曱酯。然而已经对低分子量HA施 用了由Hirano和同事们开发的方法，仅使其以使用的浓度溶于DMSO中。此 外，需要很多繁瑣的步骤来获得曱酯，而且需^f吏用有毒试剂如DMSO。
透明质酸的曱酯对于酶如透明质酸酶和曱酯酶更稳定。除此之外，新化 合物的水合性质相比而言优于天然的透明质酸(Hirano， Sakai, Ishikawa， Avci, Linhardt和Toshihiko Toida， 2005， CaAo/^rafe i e織rc/z 340: 2297》
因此本领域中需要使用简便而容易的方法制备透明质酸的曱酯。方法还 应该适用于低分子量和高分子量HA。然而文献中已知的方法太过复杂和/或 涉及一 系列步骤才能获得最终的化合物。
重氮曱烷(CH2N2)，如前所讨论的，是用于曱基化反应的公知试剂(Black, 1983，爿Wn'c/H'/m'caA^al6:3)，但是它是高毒性、热不稳定的，和爆炸性的。 使用重氮甲烷有主要的缺点，包括(a)重氮曱烷的制备相当费时而且繁瑣； (b)用于制备重氮曱烷所用的前体是强的诱变剂，在EU中已经划分为致癌物 质；(c)重氮曱烷本身也是致癌性以及爆炸性的，这使其操作复杂化。当使用 重氮甲烷时，不可能控制酯化程度，因为由于试剂具有非常高的挥发性，实 际上难以测量反应的重氮曱烷的摩尔数，由此导致低的可重复性。由于实践 中的困难，至今为止部分酯还未使用重氮曱烷制备。使用四丁基铵盐并进一 步用卣化合物处理的方法涉及很多复杂过程，并且涉及有毒化学品的使用。
通过用三曱基硅烷化基团取代CH2N2的一个氢，可以克服重氮甲烷的缺 点。得到的安全稳定的三曱基硅烷基重氮甲烷(TMSD)起初主要用于分析目的 (Hashimoto, Aoyama和Shioiri, 1981， C/ze附.P/2a/7w. 5w〃. 29: 1475)。在用于大夫见 模制备TMSD的方法的开发过程中，这种替代物越来越多地用于合成应用中 (Shioiri和Aoyama, 1993, Jdv. C/se Sy"^zo"s Org. C/zew. 1:51)。 由于C-Si p兀画d兀 共振，TMSD是热稳定的化合物。它是重氮曱烷的方便的替代品，可以用于很 多重氮曱烷的反应包括与羧酸反应产生曱酯的反应中，并可以用于一碳同素化 (one carbon homologation)i口用于Arndt-Eistert反应(Aoyama和Shirori, 1980, refra/zedra"丄e股ra， 21: 4619)，丰n化合物的同素化(Aoyama和Shirori, 1980, 7^ra/2e afra" i>"era， 21: 4619; Hashimoto, Aoyama和Shirori, 1981， 15: 975)和羧酸、酚和醇的O-曱基化中。Aoyama和他的同事已经成功地在原来由重氮曱烷主导的很多反应中使用了 TMSD。 TMSD化学性质已由Shiori 禾口 Aoyama综述(Shiori和Aoyama， 1993,于Dondoni, A.(编),Advances in the Use of Synthons in Organic Chemistry 1: 51-101)。通过与TMSD的反应产生的酯 甲基基团(estermethylgroup)的碳来自包含重氮基团的碳。尽管如此，曱醇的存 在对于转化为甲酯是必需的。这是安全而且商业上可得到的试剂。
Lappert和Lorberth在1967年首次报道了 TMSD的制备(Lappert和 Lorberth， 1967, C/zew. Owwm". 16: 836)。然而从此之后已公开了制备TMSD 的几种合成方法。在这些方法中，三曱基硅烷基甲基氯化镁与二苯基磷酰叠 IUt物(diphenyl phosphoryl azidate) (DPPA)的重氮4争牙多反应(Shioiri, Aoyama 和Mori, 1993, Og. ^w决.Co〃. 8: 612)是优选的方法，因为最实用而且允许高 收率和大规模的制备。DPPA是商业上可得到的。然而，前体还可以如Shioiri 和Yamada所述的合成的修正方法制备(Shioiri和Yamada, 1984， Org. ^"A. 62: 187)。通过非常大规模的纯化，然后将溶剂系统由Et20改变成正己烷，来表 4正TMSD的大头见才莫合成(Shioiri， Aoyama和Mori， 1993， Og. S;y"仇Co〃. 8: 612)。 Presser和Hufner注意到，转移至正己烷不是必需的，因为初始的Et2(3 溶液也是反应性的，可以不分解地保存几个月(Presser和Hufher， 2004, Mowate/^/fe/wr O^w/e 135: 1015)。由于其商业可用性和其与曱醇的相容性， 所以TMSD是最有吸引力的溶剂。与重氮曱烷相比，用TMSD曱基化更易于 标准化，因此产生更具可重复性的结果。
在近来Hirano等的方法中，通过将低分子量透明质酸溶于DMSO,然后 用TMSD处理而制备曱酯。通过繁瑣的沉淀和提取方法分离获得的化合物。
用于HA的曱酯化和随后的纯化的已知方法仍然是费时而且复杂的。
本领域中需要用于制备和纯化HA的甲酯的简单方法。
发明概述
由于使用的酯化试剂具有非常高的反应性，所以本发明的方法非常快速。 使用此简单而快速的方法，能在6小时之内实现酯化。与先前报道的规程相 比，本发明的方法中的副产物更少，并且产生的副产物易于去除。
在第一个方面，本发明涉及产生透明质酸的甲酯的方法，所述方法包括 步骤
(a) l是供包含透明质酸的酸形式在曱醇中的悬浮液；(b) 向所述悬浮液中加入三曱基硅烷基重氮曱烷的有机溶液并混合，从而 产生透明质酸的曱酯；和
(c) 回收所述透明质酸甲酯。
附图简述


图1显示根据本发明的酯化的透明质酸的分子结构。
图2显示HA的钠盐的结构式。
图3显示三甲基硅烷基重氮曱烷或TMSD的结构。
图4显示在包含曱醇的溶液中，TMSD与羧酸的反应方案，其以优异的 收率产生相应的曱酯。
图5显示才艮据本发明，在包含曱醇的溶液中，HA与TMSD的反应方案。 图6显示根据本发明的曱酯化HA的结构。
发明详述
本发明涉及产生透明质酸的曱酯的方法，包括下述步骤
(a) 提供包含透明质酸的酸形式在曱醇中的悬浮液；
(b) 向所述悬浮液加入三曱基硅烷基重氮曱烷的有机溶液并混合，从而产 生透明质酸的曱酯；和
(c) 回收所述透明质酸甲酯。
在本发明的方法中，能够将HA可控地甲酯化，并具有用于不同应用的 多种特性。这些应用包括(i)局部化妆品配制物，(ii)先进的递送系统，如用 于化妆品、生物医药和药物施用的农i米和纳米粒子(micro and nanoparticles), 微米和纳米胶嚢，聚合胶束，(iii)各种形式的愈伤和组织工程支架结构(敷料 (dressing)、膜、纤维等)和广泛的其他生物医药应用。
曱酯化的HA还可以与其他生物聚合物组合使用，以改进例如其在技术、 生物医药和药物应用中的乳化性质。
术语"透明质酸，，或"HA"在本文定义为非硫酸化的糖胺聚糖，其由通 过交替的(3-1,4和卩-1，3糖苷键连接在一起的iV-乙酰葡糖胺(GldVAc)和葡糖醛 酸(GlcUA)的重复二糖单元组成，其天然存在于细胞表面、脊推动物结締组织 的月包夕卜基质(basic extracellular substance)中、关节的滑液中、目艮球内液 (endobulbar fluid of the eye)中、人脐带组织中和公鸡冠中。透明质酸也称为乙酰透明质酸(hyaluronan)、透明质酸盐(hyaluronate)或HA。术语乙酰透明质酸 和透明质酸在本文可互换使用。
本文中可理解的是，术语"透明质酸"包含具有不同分子量的iV-乙酰-D-葡糖胺和D-葡糖醛酸的一组多糖，或者甚至所述多糖的降解的部分。
本发明描述了避免使用采用四丁基衍生物的冗长方法或使用有毒的重氮 曱烷而制备HA的曱酯的简单方法，所述方法能够即时制备用于反应。本发明 解决的一个问题是如何以极为简单而容易的方法可控地制备透明质酸的曱酯。
本发明使用的HA可以是任何可用的HA,包括源自天然组织的HA,所 述天然组织包括脊推动物的结締组织、人脐带和公鸡冠。在一个具体的实施 方案中，透明质酸或其盐是重组产生的，优选通过革兰氏阳性细菌或宿主细 胞，更优选通过芽孢杆菌属(genus5acz7/w)的细菌来重组产生。在另一个实施 方案中，HA从链球菌属(5^e/ /ococcw)细胞获得。
宿主细胞可以是适合用于重组产生透明质酸的任何芽孢杆菌属细胞。芽 孢杆菌属宿主细胞可以是野生型芽孢杆菌属细胞或其突变体。在本发明的实 践中有用的芽孢杆菌属细胞包括，但不限于Bac/〃w agaracfer/zera、嗜碱芽孢 才干菌(5ac/〃w a汰a/o/ /7z7w"、解5定4分芽孑包才干菌(5"c/〃1^ awjK/o/z々i^/bc/em1)、 #豆芽 孢杆菌CBac/〃w ^eW力、环状芽孢杆菌CBa"7/w "Vrw/a"力、克劳氏芽孢杆菌 (5(3"'〃t^ c/aww7)、凝结芽孢杆菌(5acz7/ws coagwAms)、坚强芽孑包杆菌(5ac/〃ws ^ww"、灿烂芽孢杆菌(5a"7/w /aw^ )、迟緩芽孢杆菌(5a"7/w;y /e"ft )、地衣 芽孑包杆菌(5acz'〃ws //c/2em》rm&)、 巨大芽孢杆菌(5ac/〃ws wegateWwm)、短小芽 孑包杆菌(5acz7/us /wwz7iw)、嗜热月旨肪芽孑包杆菌(5acz.〃as WearaAermop/H'/ws)、枯 草芽孢杆菌C8(3c/〃ws w6"fc)和苏云金芽孢杆菌(Bacz'〃w //mW"g7'e"w;s)细胞。尤 其适合用于重组表达的突变枯草芽孢杆菌细胞在WO 98/22598中描述。无包 嚢的(non-encapsulating)芽孢杆菌属细胞尤其适用于本发明。
在优选的实施方案中，芽孢杆菌属宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌、克劳氏 芽孢杆菌、迟緩芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆 菌细胞。在更优选的实施方案中，芽孢杆菌属细胞是解淀粉芽孢杆菌细胞。 在另一个更优选的实施方案中，芽孢杆菌属细胞是克劳氏芽孢杆菌细胞。在 另一个更优选的实施方案中，芽孢杆菌属细胞是迟緩芽孢杆菌细胞。在另一 个更优选的实施方案中，芽孢杆菌属细胞是地衣芽孢杆菌细胞。在另一个更 优选的实施方案中，芽孢杆菌属细胞是枯草芽孢杆菌细胞。在最优选的实施方案中，芽孢杆菌属宿主细胞是枯草芽孢杆菌A164A5 (参见美国专利No. 5,891,701)或枯草芽孢杆菌168A4。
透明质酸的平均分子量可以使用本领域的标准方法来测定，例如由Ueno 等，1988， C7^附.Bw〃. 36， 4971-4975; Wyatt， 1993,爿wa/. On.附.^cto 272， 1-40;和Wyatt Technologies, 1999， "Light Scattering University DAWN Course Ma腿l，，及"DAWN EOS Manual" Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, California描述的那些方法。
在优选的实施方案中，本发明的透明质酸或其盐具有约500-约10,000,000 Da;优选约10,000-约1,500,000 Da的分子量。在另 一个更优选的实施方案中， 透明质酸或其盐具有约10，000-50,000 Da的平均分子量。在另一个更优选的 实施方案中，透明质酸或其盐具有约50，000-500，000 Da，优选约80，000-300,000 Da的平均分子量。在又一个更优选的实施方案中，透明质酸或其盐 具有约500,000-1 ，500,000 Da,或优选约750，000-l,000，000 Da的平均分子量。
在本发明的方法中，使用的三曱基硅烷基重氮曱烷可以是任何可用的三 曱基硅烷基重氮曱烷，TMSD， TMSD的结构示于图3。 TMSD是Arndt-Eistert 合成和羰基化合物同素化中高毒性和爆炸性的重氮曱烷的稳定而安全的替代 物。它可以平稳地与包含甲醇的溶液中的羧酸反应，以优异的收率产生相应 的曱酯。它是商业上可用的并且比使用重氮曱烷安全得多。TMSD是黄绿色 液体，在烃溶液中是稳定的(Dietmar Seyferth等，1972， Jowma/ o/ Og朋ometo仏'c O^m/s^y 44: 279)。提出TMSD与羧酸的反应以显著不同于重 氮曱烷与羧酸的反应的反应机制发生。反应必须存在曱醇才能得到良好收率 的期望曱酯(图4)。
得到的曱酯中的一个质子来自重氮曱烷衍生物， 一个来自曱醇，并且剩 余的一个是由羧酸提供的酸性质子。
在本发明的方法中，根据图5所示的反应将HA与TMSD反应。
在本发明的具体实施方案中，通过将乙酰透明质酸钠盐转化为其酸形式 而制备a)的水溶液(aqueous solution),在所述方法中，将乙酰透明质酸溶于水 中，并施加于阳离子交换柱，收集酸性级分(HAlT)然后冷冻干燥。
在本发明的另一个具体实施方案中，将透明质酸的酸形式悬浮于质子型 溶剂或非质子型溶剂中。选择的溶剂优选为低沸点的易混合液体。低沸点的 易混合液体可以选自下组二乙醚、曱醇、二氯曱烷、四氢呋喃、二嗯烷、二曱亚砜、二甲基曱酰胺、二曱基乙酰胺等。在本发明的一个更具体的实施 方案中，反应溶剂可以优选在反应过程中具有曱醇作为组分之一。
在本发明的优选实施方案中，以包含二乙醚或己烷的三曱基硅烷基重氮
曱烷的有机溶液的形式提供TMSD。
在本发明的具体实施方案中，在将HA悬浮于反应混合物之后将反应物 的温度降低至约0。C至5°C,并在反应过程中保持在0。C-25。C以避免TMSD 蒸发。在本发明的一个更具体的实施方案中，反应过程中将反应物的温度保 持在0。C和5。C。在第一个方面的优选实施方案中，加入有机溶液之前，包含 透明质酸的酸形式在曱醇中的悬浮液具有的温度在-20。C至20。C的范围内，优 选在-10。C至10。C的范围内，更优选在-5。C至5。C的范围内，并且最优选在0 。C至5"C的范围内。
为了实现反应，向反应混合物中加入酯化剂。在完全加入酯化剂后，搅 拌液体反应混合物以确保完全反应。优选的实施方案涉及第 一方面的方法， 其中在搅拌悬浮液时向悬浮液中加入三曱基硅烷基重氮曱烷的有机溶液。
另一个优选的实施方案也涉及第一方面的方法，其中通过搅拌进行混合。 优选地，搅拌继续至少5分钟，优选至少10分钟、20分钟、30分钟、40分 钟、50分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8 小时、9小时、IO小时、ll小时，或者最优选至少12小时。
在另一个优选的实施方案中，在-20。C至20。C范围内，优选在-l(TC至lO 。C的范围内，更优选在-5。C至5。C的范围内，和最优选在Ot;至5'C的范围内 的温度进行混合。
本发明的 一个优选实施方案涉及第 一方面的方法，其中混合物中透明质酸 与三曱基硅烷基重氮曱烷的摩尔比在1:0.01至1:100的范围内，优选在l:0.05 至1:50的范围内，并且最优选在1:0.1至1:10的范围内。混合物中HA-TMSD 摩尔比的范围最优选为1:0.5-1:4。在一个优选的实施方案中，按照约1:1的比 例，用125微升TMSD (二乙醚中的2 M溶液，0.025 mmol)处理包含曱醇的溶 剂中的100 mgHA(0.25 mmol)，产生HA的~50°/。酯化。在另一个优选的实施 方案中，按照1:2的比例，用更高量的酯化剂(250微升)处理相同浓度的HA(0.25 mmol)，产生HA的80。/。酯化。在一个更优选的实施方案中，按照大约1:4的 比例，用500微升TMSD处理0.125 mmol HA,产生HA的100%酯化。
反应结束之后，分离酯化的HA产物，优选通过过滤回收透明质酸曱酯；优选地，用至少一体积的一种或多种有机溶剂，优选用曱醇和/或二乙醚，将
得到的包含透明质酸曱酯的固体滤过物(solid filtrate)至少洗涤一次，优选洗涤 至少两次；更优选将经洗涤的包含透明质酸曱酯的固体滤过物干燥、透析和 冻干。
为了纯化衍生的产物，将其离心并用溶剂如乙醇、曱醇或丙酮洗涤。可
以对产物进行透析以提供基本上纯的曱基化的HA产物。
可以将酯化的HA配制成干粉，例如，通过冻干或通过喷雾干燥。 在一个具体的实施方案中，本发明公开了具有如图6所示结构的曱酯化
的HA。
可以通过质子NMR来表征曱酯化的HA产物。由曱酯质子3.84 ppm (3H) 至透明质酸的N-乙酰基质子(-NHCOCH3， 3H， 2.0 ppm)的积分值(integration value)来测定甲酯化程度或取代度(DS，以％表示)。
本文描述并要求保护的发明不局限公开的具体实施方案或实施例的范围 内，因为这些实施方案和实施例主要意欲作为本发明的说明。任何等同的方 面都意欲在本发明的范围内。事实上，由本文的描述和实施例，除本文显示 和描述的那些之外，本发明的多种修饰对于本领域的技术人员将是显而易见 的。这样的修饰也意欲落入所附权利要求的范围内。
实施例 实施例1
通过阳离子交换树脂(Dowex 50 WX8-200),将中分子量透明质酸 (750,000-1,000,000道尔顿)转化成H"形式。在冷冻干燥机中将其冻干。
将得到的产物(50 mg, 0.125 mmol)在室温悬浮于曱醇(10 mL)中。然后将 反应混合物的温度降至0°C。向上述反应化合物中加入新鲜制备的重氮曱烷 的醚溶液(10mL)。在低温(0-5。C)在搅拌下进行反应。透明质酸与重氮甲烷的 摩尔比为1:8。 4小时后，过滤反应混合物。用曱醇(3x50mL)和二乙醚(3x50 mL)洗涤。真空下将获得的固体干燥。将其溶于去离子水并冻干。产物收率 >90%(47mg)。得到的产物的取代度为1.0。
实施例2
通过阳离子交换树脂(Dowex 50 WX8-200),将中分子量透明质酸(750,000-1，000，000道尔顿)转化成tf形式。在冷冻干燥机中将其冻干。
将得到的产物(100 mg, 0.25 mmol)在室温(20。C)悬浮于曱醇(10 mL)中。然 后将反应混合物的温度降至0°C。向上述反应化合物中加入三曱基硅烷基重 氮曱烷的醚溶液(125微升，0.25 mmol)。在低温(0-5。C)在搅拌下进行反应。 透明质酸与TMSD的摩尔比为1:1。 6小时后，过滤反应混合物。用有机溶剂 即曱醇和二乙醚(各3x50mL)洗涤。将获得的固体干燥。将其透析并冻干。 产物收率〉90。/。(93mg)。得到的DS为 0.5。
实施例3
通过用0.6 N乙醇HC1 (ethanolic HC1)处理，将中分子量透明质酸 (750,000-1,000,000道尔顿)转化成H""形式。在冷冻干燥机中将其冻干。
将得到的产物(IOO mg, 0.25 mmol)悬浮于曱醇(10 mL)中。然后将反应混 合物的温度降至0°C。向上述反应化合物中加入部分TMSD的醚溶液(125微 升，0.25 mmol)。在低温(0-5。C)在搅拌下进行反应。透明质酸与TMSD的摩 尔比为1:1。 6小时后，过滤反应混合物。用有机溶剂即甲醇和二乙醚洗涤。 将获得的固体干燥、透析并冻干。产物收率〉90。/o(94mg)。得到的DS为 0.5。
使用上述反复，通过用变化的摩尔量的TMSD处理，获得具有变化的酯 化百分比的不同的曱酯化透明质酸衍生物。通过比较在2.02 (3H， -NHCOCH3) 和3.84 (乙酰透明质酸的曱酯的质子)处的信号计算°/。-酯化。修饰产物的收率 >90%。
实施例4
使用NMR (Varian-300)来测定酯化的透明质酸(在D20中)的最终官能 度(functionality)和纯度。使用2&0作为分析溶剂，并且使用4.79 ppm的2HOH 峰作为参比线。曱酯化透明质酸的质子-NMR在3.84ppm显示尖峰。修饰度 由曱酯至透明质酸的N-乙酰基质子(-NHCOCH3， 3H, 2.0 ppm)的相对积分来 确定。如前所讨论的，通过改变HA-TMSD的摩尔比(1:0.5至1:4)，获得了具 有不同酯化程度的甲酯。
权利要求
1.产生透明质酸的甲酯的方法，所述方法包括步骤(a)提供包含透明质酸的酸形式在甲醇中的悬浮液；(b)向所述悬浮液中加入三甲基硅烷基重氮甲烷的有机溶液并混合，从而产生透明质酸的甲酯，和(c)回收所述透明质酸甲酯。
2. 权利要求1的方法，其中透明质酸具有的平均分子量为500-10,000,000 Da;优选在10,000和1,500,000 Da的范围内。
3. 权利要求2的方法，其中透明质酸具有的平均分子量为10,000-50,000Da。
4. 权利要求2的方法，其中透明质酸具有的平均分子量为50,000-500,000 Da,优选80,000-300,000 Da。
5. 权利要求2的方法，其中透明质酸具有的平均分子量为 500,000-1,500,000 Da;优选750,000-1,000,000 Da。
6. 权利要求1-5中任一项的方法，其中三甲基硅烷基重氮甲烷的有机溶液包含二乙醚或己烷。
7. 权利要求1-6中任一项的方法，其中所述混合物中透明质酸和三曱基J圭 烷基重氮曱烷的摩尔比在1:0.01至1:100的范围内，优选在1:0.05至l:50的范 围内，并且最优选在1:0.1至1:10的范围内。
8. 权利要求1-7中任一项的方法，其中在加入所述有机溶液之前，在甲 醇中包含透明质酸的酸形式的悬浮液的温度在-20。C至2(TC的范围内，优选在 -10。C至10。C的范围内，更优选在-5。C至5。C的范围内，并且最优选在0。C至5 'C的范围内。
9. 权利要求1-8中任一项的方法，其中在搅拌所述悬浮液的同时向该悬 浮液中加入三甲基硅烷基重氮曱烷的有机溶液。
10. 权利要求1-9中任一项的方法，其中通过搅拌进行混合。
11. 权利要求1-10中任一项的方法，其中所述混合继续至少5分钟，优 选至少IO分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、1小时、2小时、3 小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、IO小时、ll小时， 或最优选至少12小时。
12. 权利要求1-11中任一项的方法，其中所述混合在-2(TC至20。C,优选 -10。C至10。C,更优选-5。C至5。C，并且最优选0。C至5。C的温度进行。
13. 权利要求1-12中任一项的方法，其中通过过滤回收透明质酸曱酯。
14. 权利要求13的方法，其中用至少一体积的一种或多种有机溶剂，优 选用曱醇和/或二乙醚将包含透明质酸曱酯的固体滤过物洗涤至少一次，优选 洗涤至少两次。
15. 权利要求14的方法，其中将经洗涤的包含透明质酸甲酯的固体滤过 物干燥、透析并冻干。
全文摘要
本发明涉及产生透明质酸甲酯的方法，所述方法包括步骤(a)提供在甲醇中包含透明质酸的酸形式的悬浮液；(b)向所述悬浮液中加入三甲基硅烷基重氮甲烷的有机溶液并混合，从而产生透明质酸的甲酯，和(c)回收所述透明质酸甲酯。
文档编号C08B37/00GK101589065SQ200880002894
公开日2009年11月25日 申请日期2008年1月23日 优先权日2007年1月25日
发明者卡迪加·施瓦克-阿布德尔劳伊, 理查德·A·格罗斯, 维内特·库玛, 范妮·朗金 申请人:诺维信生物制药丹麦公司