专利名称：一种同时识别氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的分子印迹聚合物的制备方法
技术领域：
本发明涉及到分子印迹聚合物的制备方法，具体的说，是涉及一种同时识别氯霉素、 甲砜霉素和氟甲砜霉素的分子印迹聚合物的制备方法。
背景技术：
氯霉素(Chloramphenicol, CAP)、甲砜霉素(Thiamphenicol， TAP)和氟甲砜霉 素(Flommphenicol， FF)同属于氯霉素类抗生素，氯霉素由于其苯环上带硝基，分解 半衰期较长，而且具有严重的毒副作用，因此，动物性食品和水产品中的氯霉素残留对 人类健康构成了巨大威胁，目前，已被禁止在动物源性食品中使用，其最高残留限量为 0.1吗/kg。甲砜霉素和氟甲砜霉素由于毒性较氯霉素小，作为氯霉素的替代药物被广泛 使用，但是随着研究的进展发现甲砜霉素和氟甲砜霉素其毒副作用依然存在，其最高残 留限量标准一般为50-100 pg/kg。因此，为保证动物性食品的食用安全，建立准确可靠 地定性检测方法十分重要。目前，同时检测氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的方法较少， 主要有高效液相色谱(HPLC)法、气相色谱-质谱(GC-MS)法和液相色谱-质谱 (LC-MS/LC-MS/MS)法等；这些方法存在样品前处理过程复杂、价格昂贵、分析速度 慢等缺点，因此，加强对氯霉素类抗生素违禁药物残留检测，尤其是进行多残留成份的 检测，迫切需要新型、高选择性、制备简便、具有专一识别某一类抗生素的填料基质。 基于分子识别理论的分子印迹技术(Molecularly imprinting technique, MIT)是一种模拟 抗体-抗原相互作用，可获得在空间和结合位点上与某一或某一类分子相匹配的聚合物 的技术，获得的分子印迹聚合物(Molecularly imprinted polymers, MIPs)由于具有较好 的选择性和较高的机械强度，可用作固相萃取和液相色谱柱的填料，与传统的固相萃取 填料相比，能够从复杂样品中选择性分离和富集目标分子或者是与结构相似的化合物， 具有高特异性与高选择性、制备简单、稳定性好和可重复使用等优点。经对现有技术的 文献检索发现，目前分子印迹技术已开始应用于食品中氯霉素的检测中。但是，目前关 于氯霉素类抗生素的分子印迹聚合物的研究主要是基于氯霉素这一单一目标化合物的 特异性分离设计的，而且经过常规的洗脱处理不能完全从聚合物中除去模板分子，在随 后进行的固相萃取各个步骤，包括上样、淋洗、洗脱等操作中常常发现模板分子的渗漏 现象，对痕量物质的检测来说，增加了系统误差，直接影响了分子印迹固相萃取技术的 广泛应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状提供一种能同时有效识别氯霉 素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的分子印迹聚合物的制备方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为该同时识别氯霉素、甲砜霉素、氟 甲砜霉素的分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤
(1) 、将功能单体、交联剂加入到致孔剂中，在40~50 "C条件下加热，然后加入 模板分子混合均匀，得到混合溶液；
(2) 、向步骤(1)得到的混合溶液中加入引发剂，超声波脱气5 10min;然后通 氮气10 15min，抽真空或氮气状态下密封；
(3) 、在温度为60 70 。C的条件下热引发聚合，反应时间为36 48h;
(4) 、聚合反应结束后，将获得的聚合物取出研磨、筛分，通过有机溶剂去除模板
分子；
(5) 、将除去了模板分子的聚合物真空干燥，得到能同时识别氯霉素、甲砜霉素和 氟甲砜霉素的分子印迹聚合物；
其中，所述的模板分子为甲砜霉素，所述的致孔剂为乙腈，所述的交联剂为三羟甲 基丙垸三甲基丙烯酸酯(TRIM)或乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA);所述的功能单 体为甲基丙烯酸N,N-二乙基氨基乙酯、甲基丙烯酸或三氟甲基丙烯酸；
所述模板分子、功能单体、交联剂的摩尔比为h 1~8: 25;且致孔剂与交联剂的 体积比为1: 6~14。
较好的，步骤(4)中研磨、筛分后得到颗粒的平均粒径为40 60pm。
步骤(4)中去除模板分子所采用的方法可以是索氏萃取和固相萃取柱洗脱联合使用。
所述的索氏萃取和固相萃取柱洗脱所用的溶剂可以分别为甲醇与甲酸的混合溶液 和甲醇，其中所述的甲醇和甲酸的混合溶液中甲醇与甲酸的体积比为9: 1。 所述的真空干燥温度可以为45 50 °C，干燥时间为8h。
与现有技术相比较，本发明以甲砜霉素作为模板分子，通过选择合适的目标分析物 作为模板分子并建立合适的洗脱程序制得能同时识别、分离氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜 霉素的分子印迹聚合物，并解决了分子印迹聚合物通常存在的模板渗漏等问题，获得的 分子印迹聚合物可用于对氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的特异选择性分离和高效富 集。该分子印迹聚合物不仅对氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素具有较强的识别能力，而 且对三种物质具有较高的选择性和灵敏度，可用于生物及环境样品中氯霉素、甲砜霉素 和氟甲砜霉素的分离、富集和纯化。该分子印迹聚合物将为氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素残留的检测提供优良的前处理材料，结合已有检测方法，如ELISA、 HPLC、 HPLC/GC-MS等，可显著提高三种物质残留的检测灵敏度和检测效率，具有较大的推广 应用价值。同时，本发明所提供的分子印迹聚合物可作为固相萃取和液相色谱柱的填料， 实现对氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的分离、纯化和富集。
图1为本发明实施例1中制得的多孔分子印迹聚合物；
图2为本发明实施例1中制得的多孔分子印迹聚合物的表面电镜扫描具体实施例方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。 实施例1
将功能单体甲基丙烯酸(MAA) lmmol加入到致孔剂乙腈5ml中，加入交联剂乙 二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA) 25 mmol，混合均匀后，40 "C加热2 min，然后加入 模板分子甲砜霉素lmmol通入氮气10 15min，加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，超 声脱气5 10min，氮气状态或抽真空状态下密封。60 'C下反应36h;聚合反应结束后， 将合成的聚合物取出研磨、过筛后用甲醇甲酸酸(v/v 9/1)、甲醇通过索氏萃取除去
模板分子，进一步将获得的分子印迹聚合物装入固相萃取小柱，依次用甲醇甲酸(V/V 9/1)、甲醇淋洗，通过高效液相色谱-质谱检测，直到检测不到模板分子为止；将除去模 板分子的聚合物，45 'C真空干燥，得到分子印迹聚合物，最后获得的平均粒径大小为 40~60 nm。
实施例2
将功能单体甲基丙烯酸(MAA) 8mmol加入到致孔剂乙腈5ml中，加入交联剂乙 二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA) 25 mmol，混合均匀后，50 。C加热2 min，然后加入 模板分子甲砜霉素lmmol通入氮气10 15min，加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，超 声脱气5 10min，氮气状态或抽真空状态下密封。60 'C下反应36h;聚合反应结束后，
将合成的聚合物取出研磨、过筛后用甲醇甲酸酸(V/V 9/1)、甲醇通过索氏萃取除去 模板分子，进一步将获得的分子印迹聚合物装入固相萃取小柱，依次用甲醇甲酸(V/V 9/1)、甲醇淋洗，通过高效液相色谱-质谱检测，直到检测不到模板分子为止；将除去模 板分子的聚合物，45 'C真空干燥，得到分子印迹聚合物，最后获得的平均粒径大小为 40~60 (xm。实施例3
将功能单体甲基丙烯酸N,N-二乙基氨基乙酯(DEAEM) 1 mmol加入到致孔剂乙 腈5ml中，加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)25mmo1，混合均匀后，40 °C 加热2 min，然后加入模板分子甲砜霉素1 mmol通入氮气10~15 min，加入引发剂偶氮 二异丁腈(AIBN)，超声脱气5~10 min，氮气状态或抽真空状态下密封。70 'C下反应 36h;聚合反应结束后，将合成的聚合物取出研磨、过筛后用甲醇甲酸酸(v/v9/1)、 甲醇通过索氏萃取除去模板分子，进一步将获得的分子印迹聚合物装入固相萃取小柱， 依次用甲醇甲酸(v/v9/1)、甲醇淋洗，通过高效液相色谱-质谱检测，直到检测不到 模板分子为止；将除去模板分子的聚合物，45 'C真空干燥，得到分子印迹聚合物，最 后获得的平均粒径大小为40~60 pm。
实施例4
将功能单体甲基丙烯酸(MAA) lmmol加入到致孔剂乙腈5ml中，加入交联剂乙 二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA) 25 mmol，混合均匀后，40 "加热2 min，然后加入 模板分子甲砜霉素1 mmol通入氮气10 15min，加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，超 声脱气5 10min，氮气状态或抽真空状态下密封。60 "C下反应48h;聚合反应结束后， 将合成的聚合物取出研磨、过筛后用甲醇甲酸酸(v/v9/1)、甲醇通过索氏萃取除去
模板分子，进一步将获得的分子印迹聚合物装入固相萃取小柱，依次用甲醇甲酸(V/V 9/1)、甲醇淋洗，通过高效液相色谱-质谱检测，直到检测不到模板分子为止；将除去模
板分子的聚合物，50 'C真空干燥，得到分子印迹聚合物，最后获得的平均粒径大小为 40~60 pm。
实施例5
将功能单体甲基丙烯酸(MAA) 6mmol加入到致孔剂乙腈5ml中，加入交联剂乙 二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA) 25 mmol，混合均匀后，40 。C加热2 min，然后加入 模板分子甲砜霉素lmmol通入氮气10 15min，加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN),超 声脱气5 10min，氮气状态或抽真空状态下密封。60 'C下反应48h;聚合反应结束后， 将合成的聚合物取出研磨、过筛后用甲醇甲酸酸(v/v9/1)、甲醇通过索氏萃取除去 模板分子，进一步将获得的分子印迹聚合物装入固相萃取小柱，依次用甲醇甲酸(v/v 9/1)、甲醇淋洗，通过高效液相色谱-质谱检测，直到检测不到模板分子为止；将除去模
板分子的聚合物，50 x:真空干燥，得到分子印迹聚合物，最后获得的平均粒径大小为 40~60 nm。
实施例6将功能单体甲基丙烯酸(MAA) 6 mmol加入到致孔剂乙腈5 ml中，加入交联剂乙 二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA) 25 mmol，混合均匀后，45 。C加热2 min，然后加入 模板分子甲砜霉素lmmol通入氮气10 15min，加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)，超 声脱气5 10min，氮气状态或抽真空状态下密封。60 。C下反应48h;聚合反应结束后， 将合成的聚合物取出研磨、过筛后用甲醇甲酸酸(v/v9/1)、甲醇通过索氏萃取除去 模板分子，进一步将获得的分子印迹聚合物装入固相萃取小柱，依次用甲醇甲酸(v/v
9/1)、甲醇淋洗，通过高效液相色谱-质谱检测，直到检测不到模板分子为止；将除去模
板分子的聚合物，50 'C真空干燥，得到分子印迹聚合物，最后获得的平均粒径大小为 40~60 |am。
实施例7
将功能单体甲基丙烯酸(MAA) 6mmol加入到致孔剂乙腈5ml中，加入交联剂三 羟甲基丙垸三甲基丙烯酸酯(TRIM) 25rnmo1，混合均匀后，45 。C加热2min，然后加 入模板分子甲砜霉素lmmol通入氮气10 15min，加入引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)， 超声脱气5 10min，氮气状态或抽真空状态下密封。60 。C下反应48h;聚合反应结束 后，将合成的聚合物取出研磨、过筛后用甲醇甲酸酸(v/v9/1)、甲醇通过索氏萃取 除去模板分子，进一步将获得的分子印迹聚合物装入固相萃取小柱，依次用甲醇甲酸
(V/V9/1)、甲醇淋洗，通过高效液相色谱-质谱检测，直到检测不到模板分子为止；将
除去模板分子的聚合物，50 'C真空干燥，得到分子印迹聚合物，最后获得的平均粒径 大小为40~60 )im。
实施例8
将功能单体三氟甲基丙烯酸(TFMAA) 1 mmol加入到致孔剂乙腈5 ml中，加入 交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA) 25 mmol，混合均匀后，50 。C加热2 min， 然后加入模板分子甲砜霉素1 mmol通入氮气10~15 min，加入引发剂偶氮二异丁腈 (AIBN)，超声脱气5 10min，氮气状态或抽真空状态下密封。60 'C下反应36h;聚 合反应结束后，将合成的聚合物取出研磨、过筛后用甲醇甲酸酸(v/v9/1)、甲醇通 过索氏萃取除去模板分子，进一步将获得的分子印迹聚合物装入固相萃取小柱，依次用 甲醇甲酸(v/v9/1)、甲醇淋洗，通过高效液相色谱-质谱检测，直到检测不到模板分 子为止；将除去模板分子的聚合物，45 t:真空干燥，得到分子印迹聚合物，最后获得 的平均粒径大小为40~60 nm。
实施例9
将功能单体三氟甲基丙烯酸(TFMAA) 8 mmol加入到致孔剂乙腈5 ml中，加入交联剂三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)25mmo1，混合均匀后，50 。C加热2min， 然后加入模板分子甲砜霉素1 mmol通入氮气10~15 min，加入引发剂偶氮二异丁腈 (AIBN)，超声脱气5 10min，氮气状态或抽真空状态下密封。60 'C下反应36h;聚 合反应结束后，将合成的聚合物取出研磨、过筛后用甲醇甲酸酸(v/v 9/1)、甲醇通 过索氏萃取除去模板分子，进一步将获得的分子印迹聚合物装入固相萃取小柱，依次用 甲醇甲酸(v/v9/1)、甲醇淋洗，通过高效液相色谱-质谱检测，直到检测不到模板分 子为止；将除去模板分子的聚合物，45 X:真空干燥，得到分子印迹聚合物，最后获得 的平均粒径大小为40~60 ^un。
测试
将实施例1制备的分子印迹聚合物制成固相萃取小柱后，将加标样品经固相萃取小 柱分离纯化后，以LC-MS/MS检测，应用到鱼、虾样品中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉 素的检测结果。实施例2至实施例9的测试结果基本相同。
加标浓度Og平均回收率a
kg-l)
(%)
RSD (%)
0.1100.26.1
氯霉素0.399.44.7
0.597.74.5
0.597.205.10
鱼甲砜霉素1.095.404.70
2.094.704.60
0.596.205.40
氟甲砜霉素1.095.304.90
2.092.70楊
0.199.26.2
氯霉素0.398.44.9
0.597.14.5
0.598.25.4
虫下甲砜霉素1.095.74.9
2.095.74.1
0.595.75.2
氟甲砜霉素1.095.14.7
2.093.64.3
8
权利要求
1、一种同时识别氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)、将功能单体、交联剂加入到致孔剂中，在40～50℃条件下加热，然后加入模板分子混合均匀，得到混合溶液；(2)、向步骤(1)得到的混合溶液中加入引发剂，超声波脱气5～10min；然后通氮气10～15min，抽真空或氮气状态下密封；(3)、在温度为60～70℃的条件下热引发聚合，反应时间为36～48h；(4)、聚合反应结束后，将获得的聚合物取出研磨、筛分，通过有机溶剂去除模板分子；(5)、将除去了模板分子的聚合物真空干燥，得到能同时识别氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的分子印迹聚合物；其中，所述的模板分子为甲砜霉素，所述的致孔剂为乙腈，所述的交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)或乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)；所述的功能单体为甲基丙烯酸N，N-二乙基氨基乙酯、甲基丙烯酸或三氟甲基丙烯酸；所述模板分子、功能单体、交联剂的摩尔比为1∶1～8∶25；且致孔剂与交联剂的体积比为1∶6～14。
2、 根据权利要求1所述的同时识别氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的分子印迹聚 合物的制备方法，其特征在于步骤(4)中研磨、筛分后得到颗粒的平均粒径为40~60 pm。
3、 根据权利要求1所述的同时识别氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的分子印迹聚 合物的制备方法，其特征在于步骤(4)中去除模板分子所采用的方法是索氏萃取和固 相萃取柱洗脱联合使用。
4、 根据权利要求3所述的同时识别氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的分子印迹聚 合物的制备方法，其特征在于所述的索氏萃取和固相萃取柱洗脱所用的溶剂分别为甲醇 与甲酸的混合溶液和甲醇，其中所述的甲醇和甲酸的混合溶液中甲醇与甲酸的体积比为 9: 1。
5、 根据权利要求1所述的同时识别氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的分子印迹聚 合物的制备方法，其特征在于所述的真空干燥温度为45~50 °C，干燥时间为8h。
全文摘要
本发明涉及到一种能同时识别氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的分子印迹聚合物的制备方法，属于生物工程技术领域。具体为首先将功能单体、交联剂加入到致孔剂中，混合均匀后，加热，然后加入模板分子甲砜霉素和引发剂，进一步将混合溶液超声脱气，氮气或抽真空状态下密封，进行聚合反应；聚合反应结束后，将合成的聚合物取出研磨、过筛，通过索氏萃取和固相萃取小柱的联用方法，用有机溶剂洗脱除去模板分子，直到通过高效液相色谱-质谱检测不到模板分子为止；最后将除去模板分子的聚合物，真空干燥，得到分子印迹聚合物。本发明制得的聚合物可同时应用于食品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素抗生素检测的前处理，实现对氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的特异选择性分离和高效富集。
文档编号C08F222/00GK101628955SQ20091010139
公开日2010年1月20日 申请日期2009年7月31日 优先权日2009年7月31日
发明者史西志, 孙爱丽, 李德祥, 苏秀榕 申请人:宁波大学