用于检测甲砜霉素和氟苯尼考的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽药残留分析和免疫学技术领域，具体涉及一种能识别甲砜霉素和氟 苯尼考的单克隆抗体，以及用于检测甲砜霉素和氟苯尼考的酶联免疫方法(ELISA)与试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 氟苯尼考和甲砜霉素属于氯霉素类化合物，氯霉素在可食性动物中作为预防和治 疗药物使用已经有50多年了，然而由于它对人类有着严重的危害，许多国家将氯霉素列为 禁用药物。因此，就需要有与氯霉素有相似抗菌活性而且对人体又没有潜在的危害的化合 物来取代氯霉素。氟苯尼考和甲砜霉素主要用于治疗牛、家禽和猪呼吸道和肠道感染。虽然 没有氯霉素毒性强，但是已有报道表明甲砜霉素的使用可引起动物的可逆性贫血，氟苯尼 考有一定的胚胎毒性，中国、美国、日本及欧盟等许多国家和组织都规定了它们在动物组织 中的最大残留限量。目前仪器分析的方法已经能够达到对该类药物的检测要求，准确度和 精密度都很高，但是仪器昂贵、样品前处理繁琐、还需要专业的操作人员。免疫化学分析法 特别是酶联免疫吸附分析技术具有快速、灵敏度高、操作简单、适应性强等优点，适合高通 量样品筛选，因此对于快速检测甲砜霉素和氟苯尼考在动物组织中的残留，ELISA方法更具 优势。
[0003] 酶联免疫吸附法是一种简单、灵敏度高、特异性好的检测方法，因此得到了广泛的 应用。目前能够同时检测甲砜霉素和氟苯尼考的ELISA检测方法的报道不是很多，大多数还 是单个药物的检测。其中Luo(2011)建立了猪饲料中氟苯尼考和甲砜霉素的残留检测方法， 以氟苯尼考为半抗原，采用混合酸酐法合成了完全抗原，制备了多克隆抗体。该方法对氟苯 尼考IC 5Q为1.02yg/L，对甲砜霉素 IC5Q为2.55yg/L，该方法能同时识别氟苯尼考和甲砜霉 素，但是甲砜霉素较氟苯尼考灵敏度低，交叉反应率为40%，且该方法制备的为多克隆抗 体。金银珍等(2012)以氟苯尼考胺为半抗原，采用碳二亚胺法合成免疫原，以甲砜霉素琥珀 酸酐为半抗原，采用活性酯法合成包被原进行检测，对甲砜霉素的IC 5Q为15yg/L，对氟苯尼 考胺和氟苯尼考的交叉反应率分别为10.8%和10.4%，因此该抗体只能检测甲砜霉素，且 灵敏度较低。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的为：
[0005] (1)提供一种能特异性识别甲砜霉素和氟苯尼考的单克隆抗体；
[0006] (2)提供所述单克隆抗体在制备甲砜霉素和氟苯尼考酶联免疫检测试剂盒中的应 用；
[0007] (3)提供一种含有所述单克隆抗体的酶联免疫检测试剂盒；
[0008] (4)提供所述酶联免疫检测试剂盒在甲砜霉素和氟苯尼考药物残留非诊断目的检 测中的应用；
[0009] (5)利用该单克隆抗体，建立一种非诊断目的检测甲砜霉素和氟苯尼考药物残留 的ELISA方法。
[0010] 上述目的是通过以下技术方案实现的：
[0011] -种单克隆抗体，能识别甲砜霉素和氟苯尼考，它是杂交瘤细胞株TAP/5F4所分泌 的。
[0012] 所述的杂交瘤细胞株TAP/5F4，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC N0:C201549。
[0013] 所述的单克隆抗体，它是以氟苯尼考胺(FFA)与琥珀酸酐(HS)反应后的氟苯尼考 胺半琥珀酸酯(FFA-HS)与载体蛋白偶联得到的偶联物作为免疫原制备得到的。本发明优选 的免疫原载体蛋白是血蓝蛋白（KLH)。
[0014] 所述的单克隆抗体可用于制备检测甲砜霉素和氟苯尼考的酶联免疫试剂盒。
[0015] -种包含所述的单克隆抗体的试剂盒，该试剂盒是检测甲砜霉素和氟苯尼考药物 残留的酶联免疫试剂盒。
[0016] 所述的试剂盒可用于甲砜霉素和氟苯尼考药物残留非诊断目的的检测。
[0017] -种甲砜霉素和氟苯尼考药物残留的非诊断目的酶联免疫检测方法，包括免疫 原、包被原和抗体的制备，其步骤如下：
[0018] (1)将氟苯尼考胺(FFA)与琥珀酸酐(HS)反应后的氟苯尼考胺半琥珀酸酯(FFA-HS)与载体蛋白偶联得到的偶联物作为免疫原；
[0019] (2)将氟苯尼考胺(FFA)与载体蛋白偶联得到包被原；
[0020] (3)用步骤（1)的免疫原制备得到保藏号为CCTCC N0:C201549的杂交瘤细胞株 TAP/5F4；
[0021] (4)用保藏号为CCTCC N0:C201549的杂交瘤细胞株TAP/5F4制备单克隆抗体；
[0022] (5)用步骤(2)的包被原包被固相载体；
[0023] (6)样品的处理和检测。
[0024] 优选地，免疫原载体蛋白是血蓝蛋白（KLH)，包被原载体蛋白是卵清白蛋白（0VA)。
[0025] 本发明的有益效果是：
[0026] 1、本发明在抗体制备时，以氟苯尼考胺半琥珀酸酯作为半抗原，将半抗原与载体 蛋白偶联作为免疫原，由该免疫原制备的单克隆抗体能特异性地同时识别氟苯尼考和甲砜 霉素。
[0027] 2、本发明的酶联免疫试剂盒和方法适用于检测动物可食性组织如猪肉、鸡肉、鱼、 猪肝脏和鸡肝脏中的氟苯尼考和甲砜霉素药物残留，检测的灵敏度、准确度高，精密度好， ICso 值仅为 0 · 35 ± 0 · 03yg/L。
[0028] 3、本发明所涉及的检测方法简单，易操作，检测成本低，对操作者身体健康危害相 对较小。
【附图说明】
[0029]图1为本发明的单克隆抗体与甲砜霉素标准品的间接竞争ELISA反应曲线，X轴为 甲砜霉素(TAP)标准溶液浓度对数值，Y轴为甲砜霉素标准品溶液的光密度值除以"零"孔光 密度值(B/Bo)。
【具体实施方式】
[0030] 下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。
[0031] 实施例1免疫原和包被原的制备
[0032] 1.3氟苯尼考胺半琥珀酸酯与血蓝蛋白偶联物(FFA-HS-KLH)的制备
[0033] 称取氣苯尼考胺(FFA)247mg( lmmol)，B0C酸酉干218mg( lmmol)，Na2C〇3l06mg( lmmol) 于50mL圆底烧瓶中，加入二氯甲烷10mL，室温反应过夜。过滤，除掉Na2C03,然后加入琥珀酸 酐200mg(2mmol)，三乙胺lmL，60°C油浴条件下，回流反应Id。蒸干除掉二氯甲烧，加三氟乙 酸2mL，室温水浴反应2-4h，待反应完全滴加三乙胺调中性，用乙酸乙酯洗涤2-3次，合并有 机相，无水硫酸镁脱水后，蒸干得到黄色油状物，即半抗原氟苯尼考胺半琥珀酸酯（FFA-HS)。反应式如下：
[0035] 称取氟苯尼考胺半琥珀酸酯69.4mg，溶于lmL DMF中，加入DCC 60mg和N-羟基琥珀 酰亚胺(NHS)34.6mg，室温避光反应8h，反应完全过滤得到A液。取3mL KLH溶于3mL PBS中， 为B液。冰浴条件下，将A液缓慢滴加到B液中，4°C反应8-10h。将产物装入透析袋内，4°C条件 下用PBS透析5d，每天更换透析液3次。得到的即为FFA-HS-KLH。
[0037] 1.4氟苯尼考胺卵清白蛋白偶联物(FFA-EDC-0VA)的制备
[0038] 称取氟苯尼考胺24.7mg，溶于100yL DMF中为A液。称取40mg 0VA溶于6mL PBS中， 为B液。将A液缓慢滴加到B液中，然后加入EDC 16mg和NHS 12mg，室温反应过夜，将反应物装 入透析袋内，4°C用透析5d，每天更换透析液3次。得到的即为完全抗原FFA-EDC-OVA。反 应式如下：
[0040]实施例2单克隆抗体的制备 [0041 ] 2.1动物免疫
[0042]利用发明人所在的国家兽药残留基准实验室制备的免疫原（FFA-HS -KLH)免疫 Balb/C小鼠（购自湖北省医学科学院实验动物中心）。免疫程序是取含FFA-HS-KLH偶联物50 ~l〇〇yg的蛋白溶液与佐剂等量混合后注入小鼠体内，使其产生特异性血清。
[0043] 2.2细胞融合和克隆化
[0044] 参照杨汉春《动物免疫学》，利用发明人所在国家兽药残留基准实验室制备的FF-HS-KLH免疫原免疫Balb/C小鼠（购自湖北省疾病预防控制中心实验动物中心），免疫程序 为:基础免疫将免疫原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，于小鼠背部皮下多点注射，以后每 间隔2周加强免疫一次，换用不完全佐剂乳化。最后于融合前三天(最好于免疫结束后休整1 月）腹腔注射，强化免疫，抗原量加倍，不加佐剂。
[0045] 融合时，取经最后强化免疫的B