alb/C鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性 血清），在75%酒精中浸泡5min消毒。无菌取出小鼠脾脏，分离出脾细胞，与新鲜制备的SP2/ 〇骨髓瘤细胞(SP2/0骨髓瘤细胞来自本实验室)按1~2 X 107个SP2/0与108个免疫脾细胞(1: 10~1:15)的比例于50mL离心管，用15mLRPMI_1640基础液重悬细胞，1500r/min离心5min， 洗细胞1次。离心的间隙将温浴的培养基，温浴的水，温浴的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG)等放入超净台。然后取出灭菌的吸水纸，将装有骨髓瘤细胞和免疫脾细胞的离 心管上清倒尽后，倒扣在吸水纸上控干水滴，轻敲管底使细胞松动。打开计时器，用lmL吸管 吸取0.8mLPEG，手持装有混合细胞的离心管，将其放置在水浴中片刻，将PEG缓慢的滴加到 混合细胞上，边加边轻轻搅拌，lmin内加完，持续搅拌30s。用吸管取10mL基础液，沿管壁缓 慢加到融合细胞上，边加边轻轻摇动(不能吹打），5min内分别加 lmL，2mL，3mL，4mL，最后补 加基础液到40mL，加完后，盖上盖子，反复颠倒几次，使细胞混匀。800r/min 5min离心，弃上 清。吸取含有饲养细胞的HAT培养基，用吸管将离心管中的融合细胞轻轻搅拌起来，液面附 近逐滴滴入到含饲养细胞的血清瓶中，搅拌混匀，动作要轻将细胞轻轻搅拌起来，千万不要 吹打。颠倒混匀。然后将细胞接种在细胞培养板上，每孔两滴，置于培养箱中培养。一次融 合可接种4~6块96孔板。根据需要也可少种，一般按SP2/0的细胞数计算，每孔接种量约含 1 〇4左右个SP2/0细胞。于37°C，5 % C02培养箱中培养。
[0046] 融合当天记为第0d，前3d尽量不要移动细胞，第3d每孔补加1滴1%HAT完全培养 基，观察集落生长情况。第5d每孔吸出100yL上清，再补加2滴0.5 %HAT完全培养基，继续跟 踪观察融合细胞。
[0047]待融合细胞集落长至培养孔1/10~1/5,同时用建立的间接ELISA方法进行筛选。 与零药物孔相比，药物孔0D值能被抑制的判为阳性。根据抑制率和细胞集落生长状况，选择 2~6个强阳性的仅有1-2个单集落的细胞孔，采用有限稀释方法进行克隆化。
[0048]经过3~4次克隆，最终筛选出分泌抗甲砜霉素药物抗体的单克隆杂交瘤细胞株， 申请人将其命名为TAP/5F4，并于2015年4月24日送位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典 型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO:C201549。对该细胞系进行了染色体 计数，结果显示，SP2/0的染色体数为62~68条，脾细胞染色体为40条，而杂交瘤细胞的染色 体数目平均值为104.5条，说明融合细胞的确是SP2/0细胞与脾细胞的杂交产物。将该细胞 株经腹腔注射Balb/C小鼠，生产单克隆抗体。采用购自Thermo Sxientific公司的鼠单克隆 抗体(Monoclonal antibody，Mab)快速ELISA同型试剂盒对本发明所得到的单克隆抗体的 亚型和轻链进行鉴定，结果为小鼠 IgGi亚型。
[0049 ]实施例3甲砜霉素间接竞争ELI SA检测方法的建立
[0050] 3.1试剂的配制(本实施例使用的试剂除另注明外均采用以下方法配制）
[0051] 磷酸盐缓冲液:NaCl 8.0g，KH2P〇4〇.2g，Na2HP〇4 · 12H20 2.9g，KCl 0.2g，加双蒸水 至 lOOOmL，调节 pH至7 · 4;
[0052] 包被液：取Na2C03l. 59g，NaHC032.93g，加三蒸水至 1000mL，调节pH值至9.6;
[0053] 洗涤液：NaCl 8.0g，KH2P〇4〇.2g，Na2HP〇4 · I2H2O 2.9g，KCl 0.2g，Tween 20 0 · 5mL，加双蒸水至lOOOmL，调节pH至7 · 4;
[0054] 封闭液:卵清蛋白lg溶于lOOmL磷酸盐缓冲液中；
[0055] 底物液A:3,3'，5'，5_四甲基联苯二胺（TMB)200mg，无水乙醇100mL，加双蒸水至 1000mL；
[0056] 底物液B : Na2HP〇4l4.6g，梓檬酸9.3g，0.75 %过氧化氢脲6.4mL，加双蒸水至 1000mL；
[0057] 底物混合液:将A液和B液按体积比1:1混合即得，现配现用；
[0058] 终止液:2mol/L硫酸溶液。
[0059] 3.2包被原浓度和抗体工作浓度的初步确定
[0060] 选择上述合成的FFA-EDC-0VA作为包被原，用包被液稀释成16mg/L、8mg/L、4mg/L、 2mg/L、lmg/L、0 · 5mg/L、0 · 25mg/L、0 · 125mg/L 8个浓度，在96孔酶标板，从第一至第八列依 次加入，4°C过夜;洗涤3次，拍干，加入封闭液200yL，37°C封闭60min;洗涤3次，拍干，在酶标 板的第一行至第八行依次加入l〇〇yL磷酸盐缓冲液稀释的稀释倍数为1000、2000、4000、 8000、16000、32000、64000、128000的单克隆抗体，37°C孵育30min，洗涤3次，拍干;各孔加入 1:5000倍磷酸盐缓冲液稀释的HRP标记的羊抗鼠 IgG抗体(简称二抗，以下所指二抗均为HRP 标记的羊抗鼠 IgG抗体，购自武汉飞弈生物技术有限公司）100yL，37°C孵育30min，洗涤5次， 拍干;各孔加入l〇〇yL底物混合液，避光显色15min，加入50yL终止液，用自动酶标仪在450nm 波长处测定光密度值(0D值），结果见表1。
[0061 ]结果表明，初步确定包被原FFA-EDC-0VA的包被浓度为lmg/L或0.5mg/L，抗体工作 浓度为 1:16000或 1:8000。
[0062] 表1包被原浓度和抗体工作浓度的初步确定
[0063]
[0064] 3.3最佳包被原浓度和抗体工作浓度的确定
[0065]以初步确定的包被原FFA-EDC-0VA包被浓度，设置lmg/L、0 · 5mg/L 2个浓度包被酶 标板。将甲砜霉素用磷酸盐缓冲液稀释成1.6yg/L、0.8yg/L、0.4yg/L、0.2yg/L、0. lyg/L、0μ g/L6个浓度，分别将1:16000和1:8000磷酸盐缓冲液稀释的单克隆抗体（因为作间接竞争 ELISA时，单克隆抗体的加样体积减小了一半，相应地单克隆抗体稀释度减小一半)和上述 甲砜霉素溶液各加50yL进行间接竞争ELISA。以甲砜霉素浓度对数值作为横坐标，以甲砜霉 素标准溶液的0D值与"零"孔0D值的比值(B/Bo)作为纵坐标绘制抑制曲线，选择线性较佳、 产生50 %抑制时甲砜霉素浓度（IC5Q)较低者作为包被浓度。以最佳包被原浓度包被酶标 板，将甲砜霉素稀释成 1 · 6yg/L、0 · 8yg/L、0 · 4yg/L、0 · 2yg/L、0 · lyg/L、Oyg/L 6个浓度，将抗 体以中心浓度1:16000等差设置4个稀释度，单克隆抗体和系列浓度甲砜霉素标准溶液各加 50yL进行间接竞争ELISA，绘制抑制曲线，选择线性较佳、IC 5Q值较低者作为最佳抗体工作浓 度。结果见表2和表3。
[0066]表2最佳包被原浓度优化
[0068]表3最佳抗体稀释度优化
[0070]结果表明，包被浓度为lmg/L，抗体稀释度为1:16000时，其IC5Q最低。
[0071] 3.4标准曲线的建立
[0072] 将甲砜霉素用磷酸盐缓冲液配制成1.6以8/1、0.8以8/1、0.4以8/1、0.2以8/1、0.14区/ L、0yg/L6个系列浓度，每个浓度重复5孔，按照间接竞争ELISA方法测定，重复测定5次。以甲 砜霉素溶液浓度的对数值为横坐标，Β/Β0为纵坐标绘制标准曲线，求出IC5〇。本试剂盒的 IC50 值为 0.35±0.03yg/L〇
[0073] 3.5交叉反应试验
[0074] 将氯霉素类药物用磷酸盐缓冲液配制成适当浓度，用建立的ELISA方法测定各药 物的IC5Q值，每个药物3个重复孔，以单克隆抗体对甲砜霉素的交叉反应率为100%，利用公 式1计算单克隆抗体对各药物的交叉反应率，结果见表4。
[0076] 表4本发明试剂盒对各种氯霉素类药物的交叉反应率
[0077]
[0078] 结果表明，单克隆抗体仅对甲砜霉素和氟苯尼考有较高的交叉反应率，能同时检 测这两种药物。
[0079]实施例4本发明甲砜霉素和氟苯尼考残留检测ELISA试剂盒的组装 [0080] 4.1本发明ELISA试剂盒由下述部分组成：
[0081 ] 1)包被有包被原FF